【飞诺美色谱】婴幼儿奶粉中双氰胺的分析方法

婴幼儿奶粉中双氰胺的分析方法

AF10045

北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。

针对婴幼儿奶粉中基质复杂的特点，本方法加大了净化材料的用量，以获得了更好的净化效果。采用天津博纳艾杰尔科技的新一代的Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管（500 mg/15 mL，货号：MS-SQA02）和Venusil® HILIC液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。

双氰胺标准品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），新一代Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil® HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。

样品：新西兰婴儿配方奶粉（0~6个月）

1.2 实验步骤

称取1 g试样于50 mL具塞离心管中，加2 mL水，涡旋30 s，加2 mL乙腈涡旋

。再往现有的提取液中加2 mL乙腈，重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复2次，得到共计约10 mL的提取液。以4000 r/min离心5 min，将全部上清液加入新一代Cleanert® MAS-QuChERS管中（500 mg/15 mL），将MAS管上下晃动30 s，然后涡旋30 s后，8000 r/min离心5 min，取全部上清液（约10 mL）于玻璃试管中，50℃下氮气吹干，加入1 mL乙腈-水混合溶液（97:3）复溶，过0.22 μm微孔滤膜，待测。

注：1.做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂，防止加标瞬间发生蛋白沉淀；

2.乙腈提取分4次，为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快，影响提取效果；

3.净化液氮气吹干后，如发现有少量油脂，可采用1 mL乙腈：水（97:3）混合溶液复溶，之后加入1 mL正己烷（色谱纯）液液萃取，取下层溶液过0.22 μm微孔滤膜，进样检测。

1.3 实验条件

1.3.1高效液相色谱法（HPLC法）：

色谱柱：Venusil® HILIC（5 μm，100 Å，4.6 × 250mm）；

流动相： 10 mmol/L乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=15: 85；

波长：220 nm；进样量：10 μL；柱温：30℃；流速：0.8 mL/min。

1.3.2 LC-MS/MS法：

（1）色谱条件：

色谱柱：Venusil® HILIC（ 5 μm，100 Å，2.1 × 150mm）；

流动相：A：0.5 mmol/L乙酸铵（pH=4.0）

B：乙腈；

*备注：本文曾尝试过多种C18色谱柱，对双氰胺没有保留，需要使用离子对试剂，但是无法用于LC-MS/MS；也曾尝试过MERCK ZIC-HILIC柱，但是得到双氰胺的峰面积偏差较大，分析原因是其具有阳离子交换基团，对双氰胺有不稳定的死吸附。最后确定使用键合丙基酰胺的Venusil HILIC柱，以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留。

（2）质谱条件：

质谱仪：AB SCIEX API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；CAD：8.00；CUR：20.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：600.00。

注：带“____”的监测离子对为定量离子对。

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱法：

2.1.1双氰胺的液相色谱图

2.1.2实际样品基质加标的线性关系和检出限

准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液；

分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为0.5μg/g，1μg/g，2μg/g，5.0μg/mL和10μg/g的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述色谱条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表4：

2.2 LC-MS/MS法

2.2.1双氰胺的LC-MS/MS图

XIC of +MRM (2 pairs): 85.100/68.100 Da from Sample 19 (10ppb+_new) of 20130128.wiff (Turbo Spray)Max. 8.9e4 cps.0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5Time, min0.05000.01.0e41.5e42.0e42.5e43.0e43.5e44.0e44.5e45.0e45.5e46.0e46.5e47.0e47.5e48.0e48.5e48.9e4Intensity, cps2.25

2.2.2实际样品基质加标的线性关系和检出限准确称取双氰胺标准品50 mg于50 mL容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液； 分别称取1 g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为5 ng/mL，10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL和200 ng/mL的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述液质条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表6： 表6 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS法）