1.样品:新西兰 婴儿配方奶粉 (0~6 个月)
2.样品提取及净化
称取 1 g 试样于 50 mL 具塞离心管中,加 2 mL 水, 涡旋 30s,加 2 mL 乙腈涡旋 30s。再往现有的提取液中加 2 mL 乙腈,重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复2次, 得到共计约 10 mL 的提取液。以 4000 r/min 离心 5 min, 将全部上清液加入新一代 Cleanert® MAS-QuChERS 管中(500mg / 15mL),将 MAS 管上下晃动 30s,然后涡旋 30s 后,8000r/min 离心 5 min,取全部上清液 (约10 mL)于玻璃试管中,50℃ 下氮气吹干,加入 1 mL 乙腈-水混合溶液(97:3)复溶,过 0.22 µm 滤器,待测。
注:a. 做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂,防止加标瞬间发生蛋白沉淀;b.乙腈提取分 4 次,为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快,影响提取效果;c. 净化液氮气吹干后, 如发现有少量油脂,可采用 1 mL 乙腈:水(97:3)混合溶液复溶,之后加入 1 mL 正己烷(色谱纯)液液萃取,取下层溶液过 0.22 μm 微孔滤膜,进样检测。
3.检测方法
3.1高效液相色谱法
色谱柱:Venusil® HILIC(5µm,100Å,4.6×250mm);
流动相: 10mmol/L乙酸铵(pH=4.0):乙腈=3:97;
波长:220nm;进样量:10µL;柱温:30℃;
流速:0.8mL/min。
注: 本实验选用的奶粉经过净化后, 按 10 mmol/ L 乙酸铵(pH=4.0):乙腈=15:85 液相条件,有一个杂质与双氰胺完全重合,经实验条件优化后,确定流动相条件为 10 mmol/L 乙酸铵(pH=4.0):乙腈=3:97,双氰胺保留时间为9.3 min,可以和杂质完全分离。
3.2液相色谱串联质谱法
色谱柱:Venusil® HILIC
5 µm,100 Å,2.1×150 mm;
流动相:A:0.5 mmol/L乙酸铵(pH=4.0)
B:乙腈;
进样量:10 µL;柱温:30℃;流速:0.3 mL/min。
表 2 流动相梯度程序
时间(min) | A% | B% |
---|---|---|
0 | 10 | 90 |
0.4 | 50 | 50 |
1.8 | 50 | 50 |
1.9 | 10 | 90 |
7 | 10 | 90 |
*备注:本文曾尝试过多种 C18 色谱柱,对双氰胺没有保留,需要使用离子对试剂,但是无法用于 LC-MS/MS;也曾尝试过 MERCK ZIC-HILIC 柱,但是得到双氰胺的峰面积偏差较大,分析原因是其具有阳离子交换基团,对双氰胺有不稳定的死吸附。最后确定使用键合丙基酰胺的 Venusil® HILIC 柱,以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留。
质谱条件:
质谱仪:API 4000+;离子源:电喷雾离子源;扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测;CAD:8.00; CUR:20.00;GS1:60.00;GS2:50.00;IS:5500.00; TEM:600.00。
表 3 双氰胺质谱信息
药物名称 | 监测离子对 | DP | EP | CE | CXP |
---|---|---|---|---|---|
双氰胺 | 85.1/68.1 | 71 | 10 | 41 | 6 |
85.1/43.1 | 71 | 10 | 41 | 6 |
4.结果与讨论
4.1高效液相色谱法
实际样品基质加标的线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品 50 mg 于 50 mL 容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,作为标准贮备液;
分别称取 1 g 奶粉试样,添加一定量标准溶液,配制成含双氰胺为 0.5µg/g,1µg/g,2µg/g,5.0µg/mL 和 10µg/ g 的添加样品,按照上述提取、净化方法操作,所得净化液按照上述色谱条件,依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标,峰面积为纵坐标,拟合线性方程,结果见表4:
表 4 双氰胺线性方程和定量限 (HPLC 法 )
名称 | 保留时间 | 线性方程 | 相关系数 | 最低定量限(S/N=10) |
---|---|---|---|---|
双氰胺 | 5.57min | Y=108.16X+27.827 | 0.9971 | 0.5µg/g |
准确度和精密度
选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样,进行添加回收实验,结果见表5
表 5 0.5 µg/g 添加回收实验结果 (HPLC 法 )
平行1 | 平行2 | 平行3 | 平均值 | RSD |
---|---|---|---|---|
82.3% | 85.5% | 89.1% | 85.63% | 3.97% |
4.2 LC-MS/MS法
实际样品基质加标的线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品 50 mg 于 50 mL 容量瓶中,加水溶液并稀释至刻度,作为标准贮备液;
分别称取 1 g 奶粉试样,添加一定量标准溶液,配制成含双氰胺为 5ng/mL,10ng/mL,50ng/mL,100ng/mL和200ng/mL 的添加样品,按照上述提取、净化方法操作,所得净化液按照上述液质条件,依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标,峰面积为纵坐标,拟合线性方程,结果见表6:
准确度和精密度
选取市售某婴幼儿奶粉试样,进行添加回收实验,结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液,双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化,故判断该方法无基质效应的影响。
5. 订货信息
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