泰乐菌素(Tylosin),亦称泰农、泰乐霉素,是美国于 1959年从弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)的培养液中获得的一种大环内酯类抗生素,对支原体有特效,对多种G+菌具有很强的抗菌作用,还对部分G-菌、弯杆菌、螺旋体及球虫具有抑制作用。其产品形式有酒石酸盐、磷酸盐、盐酸盐、硫酸盐及乳酸盐,易溶于水,被广泛的应用于畜牧业的畜禽疾病防治及促生长的饲料添加剂。2006年欧盟成员国全面禁止使用抗生素作为促生长剂。欧盟对肉制品中泰乐菌素的最高残留量规定为100µg/kg。我国农业部在 2002年公告的《关于动物性食品中兽药最高残留的通知》中,规定泰乐菌素在鸡、猪、牛的肌肉、脂肪、肝、肾组织中的最高残留量为200µg/kg。
1.样品提取
称取5.0 g(精确到0.01 g)均质好的样品,置于50 mL离心管中,加入20 mL 乙腈,用均质器均质1 min,在振荡器上振荡10 min,4200 rpm离心5 min,取上清液于另一50 mL离心管中;再加入20 mL乙腈于样品残渣,重复提取一次,合并上清液于50 mL离心管中,用乙腈定容至50 mL。移取 10 mL提取液,加入30 mL正己烷,涡旋振荡2 min,以4200 rpm离心5 min,弃去正己烷,下层提取液于50℃水浴氮气浓缩至近干。用10 mL磷酸盐缓冲液分两次溶解残留物,作为待净化液。
2.净化方法
先将Cleanert® PEP-2 (500mg / 6mL)小柱分别用5 mL甲醇,5 mL水,5 mL磷酸盐缓冲液活化平衡;然后将待净化液过柱(流速控制在1 mL/min);用5 mL水和5 mL甲醇-水 (2+8)洗柱,弃去全部流出液,小柱用真空泵抽干30 min;最后用10 mL甲醇洗脱。收集洗脱液于45℃氮气吹干,用1 mL 10%甲醇-水溶液溶解残留物,过0.22 µm滤膜后待测。
3.检测方法
3.1色谱条件
色谱柱:Venusil® MP C18,
2.1×50 mm,5 µm,100 Å;
流动相:A相-0.1%甲酸水,B相-0.1%甲酸乙腈
柱温:30℃;
进样量:10 µL;
梯度洗脱:见表1
表 1 液相色谱梯度洗脱条件
时间(min) | 流速 (mL/min) | A/% | B/% |
---|---|---|---|
0.00 | 0.30 | 80.0 | 20.0 |
1.00 | 0.30 | 80.0 | 20.0 |
2.50 | 0.30 | 5.0 | 95.0 |
4.00 | 0.30 | 5.0 | 95.0 |
6.00 | 0.30 | 80.0 | 20.0 |
15.00 | 0.30 | 80.0 | 20.0 |
3.2质谱条件
离子源:电喷雾离子源
扫描方式:正离子扫描
电喷雾电压:5500 V
雾化气压力:50 psi
气帘气压力:15 psi
辅助气压力:45 psi
离子源温度:550℃
采集方式:多反应监测(MRM)
Q1、Q3均为单位分辨率质谱参数(见表2)
4.实验结果
由表3可知,采用固相萃取结合液相色谱-串联质谱法检测泰乐菌素,加标量为4.0 µg/kg、20.0 µg/kg加标回收率在80%~100%之间,RSD值小于10%,能够满足检测要求。由图1和图2可看出经Cleanert® PEP-2固相萃取柱净化,采用 Venusil® MP C18色谱柱检测得到的泰乐菌素峰形良好,且保留时间稳定。
图 1 泰乐菌素样品加标 4.0 μg/kg 液相色谱/ 串联质谱质量色谱图
图 2 泰乐菌素样品加标 20.0 μg/kg 液相色谱/ 串联质谱质量色谱图
结论:
本实验建立了泰乐菌素残留量的LC-MS/MS检测方法,并结合固相萃取技术对猪肉中泰乐菌素的含量进行了测定。对于加标量为4.0 µg/kg、20.0 µg/kg的样品进行了检测,回收率在80%~100%,符合国标要求。固相萃取方法稳定并且色谱柱重现性良好,说明本方法能够用于检测动物源性食品中泰乐菌素的残留量。
5.订货信息
产品名称 | 规格包装 | 订货号 |
---|---|---|
Venusil® MP C18 | 5µm,100Å,2.1×50mm | VA950502-0 |
Cleanert® PEP-2 | 500mg/6mL,30/pk | PE5006-2 |
保护柱套 | 适用于4.6×10mm和2.1×10mm | SH-100 |
直联式保护柱芯 | 5µm,100Å,2.1×10mm | VA950102-0S |
1.5 mL样品瓶 | 短螺纹透明带书写32×11.6mm,100/pk | 1109-0519 |
1.5mL样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖,红色橡胶/米色PTFE隔垫,45.Shore A 1.0 mm,100/pk | 0915-1819 |
微孔滤膜(Nylon) | 13mm,0.22µm,200/pk | AS021320 |
一次性注射器 | 2mL两件式 无针头,100/pk | LZSQ-2ML |
乙腈UV级 | 4L/瓶,色谱纯 | 015-4 |
正己烷HPLC | 4L/瓶,色谱纯 | AH216-4 |
甲醇 | 4L/瓶,色谱纯 | S230-4 |
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