四环素类(Tetracyclines,TCs)是由链霉菌产生的一类 广谱抗生素,主要包括四环素(Tetracycline,TC)、土霉素(Oxytetracycline,OTC)、金霉素(Chlortetracyline,CTC)等, 其结构均含并四苯基本骨架,已被广泛应用于可食性动物疾病的治疗和药物添加剂中,常用于预防和治疗动物疾病。四环素类抗生素在酸性和碱性条件下均不稳定,其含有许多羟基、烯醇羟基及羰基,在中性条件下能与多种金属离子形成不溶性螯合物,与钙或镁离子形成不溶性的钙盐或镁盐,与铁离子形成红色络合物,与铝离子形成黄色络合物。为了有效地预防四环素类药物的滥用,欧盟、日本和美国等都制定了动物组织及牛奶中的最大残留限量, 其中规定在动物组织中的最大残留限量为0.1 mg/L。GB/T 21317-2007中规定最低检出限为50.0 µg/kg。
1.样品提取
称取5.0 g(精确到0.01 g)均质好的试样,置于50 mL离心管中,分别加入20 mL、20 mL、10 mL 配置好的0.1 mol/ L的EDTA-Mcllivaine缓冲溶液,1000 rpm涡旋混合1 min, 再超声提取10 min,于3000 rpm离心5 min,合并上清液(控制上清液体积不超过50 mL)并定容至50 mL,混匀,5000 rpm离心10 min,用快速滤纸过滤,待净化。
2.净化方法
先将Cleanert® PEP-2小柱分别用5 mL甲醇和5 mL水活化,再准确吸取10mL提取液以1滴/s的速度过SPE小柱,待样液完全流出后,依次用5 mL水和5 mL 5%甲醇水溶液淋洗,弃去全部流出液。减压抽干小柱5 min,最后用10 mL 甲醇+乙酸乙酯(1:9,v/v)洗脱。将洗脱液低于40℃氮气吹干,用1 mL甲醇水(3:7,v/v)溶液溶解残渣,过0.45 µm滤膜,待测。
3.检测方法
3.1色谱条件
色谱柱:Durashell C18,
2.1×50 mm,3 µm,100 Å;
流动相:A相-0.3%甲酸水溶液,B相-0.3%甲酸乙腈
柱温:30℃;
进样量:5 µL;
梯度洗脱:见表1
表 1 液相色谱梯度洗脱条件
时间(min) | 流速 (mL/min) | A/% | B/% |
---|---|---|---|
0.00 | 0.20 | 90.0 | 10.0 |
1.00 | 0.20 | 10.0 | 90.0 |
8.00 | 0.20 | 60.0 | 40.0 |
8.10 | 0.20 | 10.0 | 90.0 |
9.00 | 0.20 | 90.0 | 10.0 |
15.00 | 0.20 | 90.0 | 10.0 |
3.2质谱条件
离子源:电喷雾离子源
扫描方式:正离子扫描
电喷雾电压:5500 V
雾化气压力:70 psi
气帘气压力:15 psi
辅助气压力:65 psi
离子源温度:550℃
采集方式:多反应监测(MRM)
Q1、Q3均为单位分辨率
定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞电压(见表2)
4.实验结果
由表3可知,采用固相萃取结合液相色谱-串联质谱法检测三种四环素类药物,加标量为10.0 µg/kg、50.0 µg/kg、200 µg/kg,回收率为90%~105%,能够满足检测要求。由图1-3可看出经Cleanert® PEP-2固相萃取柱净化,采用Durashell C18色谱柱检测能够使三种四环素药物得到良好的分离,且各种物质峰形良好,保留时间稳定。
图 1 四环素类样品加标 10.0 μg/kg 液相色谱/ 串联质谱质量色谱图
图 2 四环素类样品加标 50 μg/kg 液相色谱/ 串联质谱质量色谱图
图 3 四环素类样品加标 200 μg/kg 液相色谱/ 串联质谱质量色谱图
结论:
本实验建立了三种四环素类药物的LC-MS/MS检测方法。实验对加标量为10 µg/kg、50 µg/kg、200 µg/kg的样品进行了检测,结果表明前处理方法回收率在90%-105%之 间,均在国标要求范围内,固相萃取方法稳定而且色谱柱重现性较好。说明本方法能够用于检测动物源性食品中的四环素类药物残留。
5.订货信息
产品名称 | 规格包装 | 订货号 |
---|---|---|
Durashell C18 | 3µm,100Å,2.1×50mm | DC930502-0 |
Cleanert® PEP-2 | 60mg/3mL,50支/包 | PE0603-2 |
Qdaura®卓睿自动固相萃取仪 | 24通道 | SPE-40 |
保护柱套 | 适用于4.6×10mm和2.1×10mm | SH-100 |
直联式保护柱芯 | 3µm,100Å,2.1×10mm | DC930102-0S |
1.5 mL样品瓶 | 短螺纹透明带书写32×11.6mm,100/pk | 1109-0519 |
1.5mL样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖,红色橡胶/米色PTFE隔垫,45.Shore A 1.0 mm,100/pk | 0915-1819 |
微孔滤膜(Nylon) | 13mm,0.45µm,200/pk | AS021345 |
一次性注射器 | 2mL两件式 无针头,100/pk | LZSQ-2ML |
乙腈UV级 | 4L/瓶,色谱纯 | 015-4 |
甲醇 | 4L/瓶,色谱纯 | S230-4 |
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