Plant Cell Tiss Organ Cult :一种分离植物细胞用于原子力显微镜测量的方法

Plant Cell Tiss Organ Cult :一种分离植物细胞用于原子力显微镜测量的方法

郭鑫 博士

在植物细胞培养中，植物细胞通常以大团聚体的形式生长。然而，各种研究往往需要单个细胞。尤其是需要测量单个细胞与其他表面或者细胞与细胞彼此之间的粘附力。使用原子力显微镜（AFM）进行测量单个动物细胞、细菌之间的粘附力已经非常普遍。但是植物细胞往往以大的细胞团聚体形式生长，因此无法直接进行单个细胞AFM测量。凯泽斯劳滕大学（RPTU）的Roland Ulber等开发了一种植物细胞分离方法，成功获取了 Ocimum basilicum CMC 类型的活性单个细胞，并利用AFM对这些细胞在玻璃表面上的粘附进行了测量。

(Schmeckebier, A., Ebel, C., Haffelder, J. et al. Plant Cell Tiss Organ Cult 156, 86 (2024). https://doi.org/10.1007/s11240-024-02708-6 )

细胞分离与细胞活力测试

这种植物细胞分离方法可以分为以下几个步骤，（I）过滤（II）酶处理和洗涤（III）孵育和（IV）密度离心过滤。在预培养中植物细胞会长成大的细胞团，第一步首先使用滤器进行过滤。这样可以将单个细胞和较小的细胞团从较大的细胞团中分离出来，因为植物细胞的尺度约为50-150微米，因此使用了150微米孔径的滤膜。通过这种方式，已经存在的单个细胞在与酶溶液孵育期间可以不受到压力，并且保持活力。为了评估细胞的活力，作者除了用FDA和Calcolour White染色并随后获取荧光显微镜图像进行快速活力验外，还使用了 Resazurin 测定评估活力。Resazurin 还原速率是衡量细胞活力的良好指标，因为反应速率与生物质量之间存在稳定的线性关系，使得所使用的方法可以很好地评估细胞的活力。在对细胞进行过滤后，使用离析酶（Macerozyme）处理残留在滞留物中的细胞。离析酶能分解果胶和其他小型细胞壁成分。经过这种酶处理后，细胞的活力降低到约25%。随后的洗涤步骤非常重要，需要完全分离酶溶液，以避免进一步损害细胞的活力。由于细胞活力在酶处理中受到影响，因此添加了一次在生长培养基中孵育的步骤。七天的孵育使细胞有机会恢复活力。然而，在这个孵育步骤之后细胞团可能再次形成，因此需要进行另一次过滤步骤以再次分离这些新形成的团块并获得活性的单个细胞。尽管如此，获得的溶液仍然含有可能影响后续原子力显微镜（AFM）测量的细胞碎片，因此必须通过最终的离心步骤将它们分离。作者在这里使用蔗糖梯度来进行离心，以分离细胞碎片。在分离细胞碎片后，最终获得了可用于进一步的测量活性的单个细胞。

图1 显示的是细胞分离步骤的流程图。

(I) 使用孔径为150 μm的滤膜进行过滤。

(II) 对留在滞留物中的细胞进行酶处理（Macerozyme R-10浓度0.025% （m v-1）），然后进行洗涤步骤（使用LS培养基，并在4000 rpm下离心4分钟）。

(III) 将步骤(I)的渗透液与步骤(II)后的细胞结合，进行7天的孵育（29°C，120 rpm）。

(IV) 使用孔径为150 μm的滤膜进行过滤，然后对渗透液进行密度离心（蔗糖梯度，浓度分别为500 g l-1，400 g l-1，200 g l-1，0.1 M NaCl）。

细胞粘附力测量

在单细胞力谱（Single Cell Force Spectroscopy）实验中，作者使用了布鲁克NanoWizard III生物型原子力显微镜并搭载了FluidFM附件。作者利用孔径为8微米，弹性系数为2N/m的FluidFM中空探针进行单个细胞的提取与测试。在载玻片上，使用FluidFM探针对单个细胞进行了20秒的接触，然后测定其粘附力为约4 nN ± 1.2 nN。文献中以乳酸菌为例，在相似的测量条件下获得了近似相等的粘附力。必须注意的是，乳酸菌的大小约为0.8–1.4 μm，明显小于植物细胞 Ocimum basilicum CMC 的大小，后者约为50–150 μm（Mehring等，2020年）。尽管细胞尺寸大了100倍，但没有显著更高的粘附力。迄今为止文献中尚无关于植物细胞在表面上的可比较的单细胞粘附测量。未来，对不同植物细胞系的测量将成为关注的焦点，同时还将研究这些细胞在不同表面上的情况。

图 2 A：细胞分离前细胞团的显微图片；B：使用聚丙烯过滤器过滤后的图片；C：在所有分离步骤后的单个细胞；C1：显微图片，C2：用FDA和Calcoflour White染色的荧光图片。

布鲁克CellHesion 300生物型原子力显微镜

自动化的CellHesion 300型原子力显微镜是以单分子灵敏度测量细胞-细胞，细胞-组织，细胞-基底相互作用的理想工具。 其可提供可重复的、高品质的、定量的数据。高度自动化增加了测试通量，提高了生产效率，提供了生物医学以及临床研究中必需的统计学意义。而且重要的参数，如最大粘附力，单独的折叠，tether 特征等，可通过开创性的软件自动获取。

左图：在基底或者目标细胞上用于细胞黏附测试的单个3T3纤维细胞（绿色，FDA染色）修饰的探针。右图：在单细胞力谱（SCFS）实验中，一个与探针进行生物化学交联的活细胞（如通过功能化修饰）。蓝色是细胞以给定的力与结合目标接触，图1。在用户给定的结合时间后，通过回拉探针使得细胞与目标分离，图2。分离的阻力被探针的弯曲量定量测量。

安装在蔡司Axio Observer型倒置显微镜上的CellHesion 300。