Nature Communications：利用光镊技术揭示黏连蛋白分子构象变化产生机械力的机制

内容简介

黏连蛋白可以在空间上组织DNA，黏连蛋白分子可以沿着DNA移动，挤出DNA环，这对基因表达、修复和重组非常重要。黏连蛋白分子构象变化产生机械力被认为是推动自身沿DNA运动并产生DNA环的关键，但黏连蛋白分子的构象变化产生机械力的机制仍不甚清楚。来自伦敦伦敦大学学院的Maxim I. Molodtsov等利用布鲁克光镊技术（Nanotracker）测量了单个黏连蛋白分子构象变化产生的机械力，揭示了产生机械力的两种不同机制。黏连蛋白分子SCM结构域的弯曲由随机热布朗运动驱动的，而两个ATPase头结构域之间的啮合是其与ATP结合产生能量驱动的。该工作讨论了黏连蛋白分子变化的能量学过程及意义，以帮助理解黏连蛋白分子作为分子机器的力学原理，相关研究成果以“Single cohesin molecules generate force by two distinct mechanisms”发表于Nature Communications上。

实验结果与讨论

黏连蛋白分子的核心由两个长约50 nm 的SMC1和 SMC3卷曲螺旋状亚单元组成，二者在球状铰链（hinge）结构域二聚化，并通过ATPase头（head）结构域进行瞬时相互作用，图1a。ATPase 头结构域形成ABC类的ATP结合及水解位点，也通过部分未结构化的 SCC1 kleisin 亚基连接。SCC1的N端和C端分别与SMC3和SMC1亚基相互作用。第四个亚基（STAG1或STAG2）与SCC1结合，并为黏连蛋白内部以及与其他蛋白质和DNA 的相互作用提供额外的结合界面。其中一个关键的相互作用是与NIPBL-MAU2（酵母中的 SCC2，本文中称为NIPBLScc2）的相互作用，它也与黏连蛋白的ATPase 头和 SCC1相互作用，是拓扑加载到 DNA上和 DNA环挤出所必需的。

为了确定黏连蛋白ATPase 头-铰链构象变化的能量学原理，作者将人黏连蛋白SMC3亚单元的ATPase头固定在微流体流动池表面，将球状铰链结构域利用110 nm 长的卷曲螺旋状蛋白linker与500 nm大小的聚苯乙烯珠子连接，从而利用光镊对铰链结构域施加可控力，图1b。在典型的力钳实验中，作者对分子施加恒定的力，监测该力下头-铰链（head-hinge）距离（L）的变化。

实验结果表明，黏连蛋白头-铰链距离显示出三种清晰的构象之间的转换，图1c。动态分子显示距离变化可达约 32 nm，这是铰链远离 ATPase 头的最大幅度，这一测量结果与铰链可移动的距离一致，最短构象对应于卷曲螺旋弯曲的分子构象。弯曲态和伸展态之间的转换经常是通过中间的第三态发生的，铰链大约处于完全弯曲和完全伸展状态的中间，图 1c。在低作用力条件下，黏连蛋白在完全伸展状态下时间很少，大部分时间都处于完全弯曲状态。在 1 pN 的作用力下，转向了中间状态和延伸状态，在 1.5 pN 及以上的作用力下，凝聚蛋白处于完全伸展状态，说明铰链向头部的弯曲势能无法克服大于或等于1.5 pN 的作用力，图1c,d。NIPBLScc2、ATP和 DNA存在的情况下，黏连蛋白构象转换最为活跃，而不使用ATP、NIPBLScc2或 DNA中的一种成分，构象转换的凝聚蛋白分子数量会明显减少，特别是DNA。利用TEV 蛋白酶裂解SCC1 kleisin 后，未发现头-铰链结构动态变化，说明其变化需要完整的SCC1 kleisin。令人惊讶的是，在非水解ATP类似物AMPPNP以及 DNA和NIPBLScc2的存在下，头-铰链结构动态变化几乎与ATP存在下一致，这一结果表明头-铰链动态变化不是由ATP提供的能量驱动的。进一步地，作者通过对三态在不同力作用下的分布分析得出，发现其符合热驱动转换中三态分布与力的指数关系，进一步证实了头-铰链之间的转换是热布朗运动驱动的。

随后作者把SCM1 ATPase 头利用linker与500 nm大小的聚苯乙烯珠子连接，利用光镊技术测量了与头-头相互作用相关的能量过程，图2a。结果表明在有ATP但没有NIPBLScc2的情况下，黏连蛋白在SMC ATPase头之间没有表现出任何明显的运动，仅仅发生了约30 nm的弹性伸展，图 2b。而ATP和NIPBLScc2同时存在时，20 pN 的力不会导致任何明显的弹性伸展，但一些力-距离迹线显示出间隔约10 nm的阶梯状转变，表明ATPase头-头的啮合及脱离。进一步实验表明，在5至20 pN 的作用力范围内，头-头间距可出现约10 nm的转变（图 2c、d），两种状态可能对应于SMC头头啮合和脱离相关的黏连蛋白构象。在高达15 pN的机械力作用下，头头的啮合仍会发生，这比完全阻滞头-铰链运动所需的1.5 pN要大得多。在没有NIPBLScc2，基本无头部啮合事件，而在无ATP时，偶尔检测到单次脱离事件（24次中有4次），但这些事件之后从未发生过啮合，证实ATP 和NIPBLScc2都是外力作用下头-头动态结构变化的必要条件。值得注意的是，在存在不可水解的ATP类似物AMPPNP的情况下，无头-头动态结构转换，这与头-铰链动态构象转换不同。啮合和脱离率都不以指数形式依赖于外力，证实头部的啮合/脱离并不是由热布朗运动驱动的。

作者进一步利用X射线衍射以及分子动力学模拟，证实在ATP存在时，NIPBLScc2 在 ATPase头啮合时将采用弯曲构象，脱离时采用延伸的构象，类似弹簧作用，而两个ATP 分子与SMC1和SMC3 ATPase头结合产生能量为 ATPase头啮合和NIPBLScc2弯曲提供动力。基于实验得到ATPase 头动态转换的能量图，作者描绘了黏连蛋白复合物促成DNA空间结构变化的示意图，ATPase 头-头脱离的冲程过程促使了初始DNA环形成，一旦环路形成，其伸长可以由头-头和头-铰链的组合运动或单独由头-铰链运动驱动。

总之，作者利用光镊技术对单个黏连蛋白中机械瞬态力及产生机理进行研究，描绘了黏连蛋白促使DNA结构转换过程，更为重要的是理解聚合酶化学中的机械力对了解聚合酶作为分子机器的机械细节及功能具有重要意义。