开发板

21世纪是生物学的世纪，生命科学发展迅猛。生命科学仪器及耗材的发展水平标志着国家创新能力和科学技术发展的水平，当前生命科学仪器市场被国外大型仪器公司所垄断，美国、德国等欧美国家科学仪器发展处于世界先进水平。虽然我国生命科学领域相关研究相对国外起步较晚，作为生命科学研究支持的仪器及耗材等相对国外也有一定差距，但国产生命科学领域仍然涌现出不少优质潜力股，专注PCR研发制造的杭州柏恒便是其中之一。为了解国产生命科学仪器企业发展路径，仪器信息网特邀请杭州柏恒常务副总/研发总监徐伟兵，请他就国产PCR仪器发展难点、痛点谈谈他的理解与看法。徐伟兵 杭州柏恒常务副总/研发总监微控制器、工业设计软件、人才被“卡脖子” 以杭州柏恒所生产的PCR仪为例，目前基因扩增仪内所用到的部分零配件如MCU微控制器、AD转换器等芯片、半导体制冷片等部件都大多采用进口器件，目前还没完全做到国产替代。产品设计过程中所用到的工业设计软件，例如MCU微控制器软件设计平台KEIL、PCB板设计软件Altium Design、结构设计三维软件Solidworks、平面设计软件Photo Shop/Illustrator /CorelDRAW都是国外公司开发的，没有更优的国产软件可以替代。此外，限制国产仪器发展的还有一个方面原因是国内部分中小型加工厂的制造工艺与国外存在一定差距，导致制造出来的部分仪器在某些关键性能上与原进口仪器存在一定偏差。除了仪器设备本身，仪器行业高端人才也很稀缺。国产仪器开发的常规做法是逆向工程，购买国外的样机，进行分析，破解原理，再进行设计，这种模式设计出来的产品性能和稳定性上与样机会存在一定差距，如果部分关键点没有掌握透彻，设计出来的产品可能会存在一定的缺陷。如何解决如何解决这些“卡脖子”问题？目前我国的生命科学仪器行业虽然与国外大型仪器公司的产品存在一定差距，但是现阶段已有不小的进步与发展，并且随着国产仪器的发展，大众对国产仪器的认可度也不断提高。科学仪器的终端用户大都是高校和科研单位，国家政策支持高校和科研单位优先采购国产设备，是对国产仪器发展最大的利好，毕竟有市场保障，企业才能发展。需要国家政策支持工业用芯片研发，鼓励企业用国产芯片，并在高校实验室和科研单位推广国产的开发板、仿真器等开发工具，建立免费的网络技术交流社区或论坛。同理国产工业软件的发展也是至关重要，但软件受制于电脑端操作系统，需要跟国产操作系统同步发展。高校需要加强技术型人才的培养，高校实验室与企业之间应该有更多的互动，学生可以学习企业的设计开发流程，产品应用，企业管理，企业可以从实验室获得先进技术，并可以引进优秀毕业生。国产生物仪器行业不同于传统民用设备行业，生物仪器行业技术门槛较高，研发投入大，需要长期的技术积累。随着国内生命科学行业的发展与崛起，国产科学仪器必然也会迎来新的发展机遇。国产仪器企业一方面需要长期的坚持，逐步发展，同时也需要不断整合，提高产业集中度。届时，国产仪器企业将蓬勃发展，部分企业跻身国际一流科学仪器行业地位。相信在不久的将来，国产科学仪器会逐渐完成国产化替代，这个行业也会发展发展越来越好。走差异化路线专精PCR仪制造杭州柏恒科技有限公司成立于2009年，是一家集研发，生产，销售及服务于一体的国家高新技术企业。公司10余年来一直专注于分子生物实验室设备，主营产品有实时荧光定量PCR仪，等温荧光PCR仪，定性梯度PCR仪，全自动PCR仪，全自动核酸提取仪以及相关配套产品。公司于2012年开发完成的GE4852T双槽梯度PCR仪是国内首款在双槽PCR扩增仪中实现独立梯度功能的仪器。2016年开发完成的GET3XG三槽梯度PCR仪是国内首款三槽梯度PCR仪。2019年开发完成的RePure-C二维梯度PCR仪是国内首款二维梯度PCR仪，并且仪器最大升温速率可以达到8℃/s，是国内最快的96孔PCR仪。本公司坚持技术创新，走差异化路线，减少同业竞争。柏恒科技智能二维梯度PCR仪 RePure C柏恒科技智能三槽梯度基因扩增仪柏恒科技公司未来几年产品的规划是：完善分子生物实验室设备产品链，由专精于PCR仪设备研发，向PCR仪上下游设备研发扩展；再基于荧光定量PCR仪快检设备，延伸开发针对医疗快检的POCT设备；完善高校科研、生物制造企业、人民医院、医学检验中心、畜牧养殖、宠物医院等领域的分子生物设备开发。

广州禾信仪器股份有限公司(以下简称“禾信仪器”、“发行人”或“公司”)首次公开发行不超过1,750万股人民币普通股(A股)(以下简称“本次发行”)的申请已经上海证券交易所科创板股票上市委员会委员审议通过，并已经中国证券监督管理委员会(以下简称“中国证监会”)证监许可〔2021〕2320号文同意注册。本次发行的保荐机构(主承销商)为国信证券股份有限公司(以下简称“国信证券”或“保荐机构(主承销商)”)。发行人的股票简称为“禾信仪器”，股票代码为“688622”。　　本次发行采用向战略投资者定向配售(以下简称“战略配售”)、网下向符合条件的网下投资者询价配售(以下简称“网下发行”)和网上向持有上海市场非限售A股股份和非限售存托凭证市值的社会公众投资者定价发行(以下简称“网上发行”)相结合的方式进行。发行人和保荐机构(主承销商)综合考虑发行人基本面、本次公开发行的股份数量、发行人所处行业、可比上市公司估值水平、市场情况、募集资金需求以及承销风险等因素，协商确定本次发行价格为17.70元/股，发行数量为1,750万股，全部为新股发行，无老股转让。　　初始战略配售发行数量为262.50万股，占本次发行数量的15%。战略配售投资者承诺的认购资金已于规定时间内汇至保荐机构(主承销商)指定的银行账户。依据本次发行价格确定的最终战略配售数量为262.50万股，占发行总量的15%，最终战略配售数量与初始战略配售数量相同。　　网上网下回拨机制启动前，网下发行数量为1,041.25万股，占扣除最终战略配售数量后发行数量的70% 网上发行数量为446.25万股，占扣除最终战略配售数量后发行数量的30%。　　回拨机制启动后，网下最终发行数量为892.50万股，占扣除最终战略配售数量后发行数量的60%，占本次发行总数量的51% 网上最终发行数量为595.00万股，占扣除最终战略配售数量后发行数量的40%，占本次发行总数量的34%。网上发行最终中签率为0.02548948%。　　本次发行的网上、网下认购款项缴纳工作已于2021年9月3日(T+2日)结束。具体情况如下：　　一、新股认购情况统计　　保荐机构(主承销商)根据本次战略投资者缴款情况，以及上海证券交易所和中国证券登记结算有限责任公司上海分公司提供的数据，对本次战略配售、网上、网下发行的新股认购情况进行了统计，结果如下：　　(一)战略配售情况　　本次发行的战略配售由保荐机构相关子公司跟投、发行人的高级管理人员专项资产管理计划组成，跟投机构为国信资本有限责任公司，发行人的高级管理人员专项资产管理计划为国信证券禾信仪器员工参与战略配售集合资产管理计划，无其他战略投资者安排。各战略投资者缴款认购结果如下：　　1、国信资本有限责任公司缴款认购情况如下：　　(1)缴款认购股数：87.50万股　　(2)缴款认购金额：1,548.75万元　　2、国信证券禾信仪器员工参与战略配售集合资产管理计划缴款认购情况如下：　　(1)缴款认购股数：175.00万股　　(2)缴款认购金额：3,097.50万元　　(3)缴纳的战略配售经纪佣金：15.4875万元　　(二)网上新股认购情况　　1、网上投资者缴款认购的股份数量(股)：5,945,894　　2、网上投资者缴款认购的金额(元)：105,242,323.80　　3、网上投资者放弃认购数量(股)：4,106　　4、网上投资者放弃认购金额(元)：72,676.20　　(三)网下新股认购情况　　1、网下投资者缴款认购的股份数量(股)：8,925,000　　2、网下投资者缴款认购的金额(元)：157,972,500.00　　3、网下投资者放弃认购数量(股)：0　　4、网下投资者放弃认购金额(元)：0　　5、网下投资者缴纳的新股配售经纪佣金(元)：789,826.35　　二、网下配售摇号结果　　根据《广州禾信仪器股份有限公司首次公开发行股票并在科创板上市发行安排及初步询价公告》《广州禾信仪器股份有限公司首次公开发行股票并在科创板上市发行公告》，发行人和保荐机构(主承销商)于2021年9月6日(T+3日)上午在上海市浦东东方路778号紫金山大酒店四楼会议室海棠厅主持了禾信仪器首次公开发行股票网下限售账户摇号抽签仪式。摇号仪式按照公开、公平、公正的原则进行，摇号过程及结果已经上海市东方公证处公证。　　中签结果如下：　　凡参与网下发行申购禾信仪器A股股票的公开募集方式设立的证券投资基金和其他偏股型资产管理产品、全国社会保障基金、基本养老保险基金、根据《企业年金基金管理办法》设立的企业年金基金、符合《保险资金运用管理办法》等相关规定的保险资金和合格境外机构投资者资金等配售对象持有的申购配号尾数与上述号码相同的，则为中签号码。本次发行参与网下配售摇号的共有5,231个账户，10%的最终获配账户(向上取整计算)对应的账户数量为524个。根据摇号结果，所有中签的账户获得本次配售的股票限售期为6个月。中签账户对应的股份数量为628,825股，占本次网下发行总量的7.05%，占扣除战略配售数量后本次公开发行股票总量的4.23%，占本次发行总数量的3.59%。本次网下摇号中签的配售对象具体情况请详见“附表：禾信仪器网下摇号中签配售明细”。　　三、保荐机构(主承销商)包销情况　　网下和网上投资者放弃认购的股份全部由保荐机构(主承销商)包销，本次保荐机构(主承销商)包销股份的数量为4,106股，包销金额为72,676.20元，包销比例为0.02%。　　2021年9月7日(T+4日)，保荐机构(主承销商)将余股包销资金与战略投资者认购资金、网下和网上发行募集资金扣除保荐承销费和新股配售经纪佣金后一起划给发行人，发行人向中国结算上海分公司提交股份登记申请，将包销股份登记至保荐机构(主承销商)指定证券账户。　　四、承销商联系方式　　投资者对本公告所公布的发行结果如有疑问，请与本次发行的保荐机构(主承销商)联系。具体联系方式如下：　　联系电话：0755-22940052、0755-22940062　　联系人：资本市场部　　发行人：广州禾信仪器股份有限公司　　保荐机构(主承销商)：国信证券股份有限公司

双十一结束小奥的购物车都清空了没法儿给你抄了我借ELISA实践笔记给你抄快到期末/年底了实验汪们可要抓紧搬砖咯前面三份笔记拉到文末看哦以下，可都是尖货儿哟！??Part 1 —— 前 言 | ELISA方法用于杂交瘤和噬菌体展示筛选是最为广泛的高通量的抗体发现的筛选方法，其实质是亲和力测定方法的一种变种，其目的是需要建立ELISA信号值和样品亲和力大小之间的正相关性。相对于采用ELISA进行抗体的亲和力测定方法，用于杂交瘤和噬菌体展示筛选的ELISA方法有以下难点：1.待测样本极具多样性，且单一样品通常也是混合物，有很大的可能存在非特异吸附；2.不同的待测样品之间可能存在较大的浓度差异，浓度的大小和亲和力的大小均会对检测结果产生影响。在进行杂交瘤和噬菌体展示筛选方法开发时，需要选择合适的条件使信号值主要能够表征亲和力的大小而一定程度上忽略浓度差异造成的影响。本文是ELISA定量测定方法开发和亲和力测定方法开发的进阶版本，配体受体反应的基本原理解析，和两种应用的差异性区分是进行ELISA筛选方法的开发的基础。 Part 2 - 原理解析 - ELISA信号值和亲和力大小的关系 无论是进行杂交瘤的筛选还是噬菌体展示的筛选，其化学原理的实质是抗体和抗原可逆的相互作用，John McCafferty在Phage Display of Peptides and Proteins A Laboratory Manual一书的第七章节Phage Display：Factors Affecting Panning Efficiency中对可逆反应的数学原理有过理论的推导和实验的验证，简而概之可以用下面的公式进行描述：Abinput代表可逆反应中抗体的加入量，Aginput 代表可逆反应中抗原的加入量，Kd代表Ab和Ag的亲和力大小。由公式可知，当反应完成时，形成的抗原抗体偶联物占抗体的加入量的比值（proportion bound），是一个与抗原的加入量和亲和力大小这两个参数相关的特征函数。具体在ELISA测定过程中当抗体的加入量是恒定值时，proportion bound可以用检测的信号值来等价表示，在ELISA反应中抗原的加入量和Kd将决定信号的大小。相同浓度的抗体，因为亲和力不一样，在同一抗原浓度下其proportion bound的比例也不一样，用具体的图形演示如下图：红色实线是亲和力为1nM的抗体Ab1随抗原浓度变化其proportion bound的函数曲线，蓝色实线是亲和力为10nM的抗体Ab2随抗原浓度变化其proportion bound的函数曲线，绿色虚线为在相同抗原浓度下，Ab1/ Ab2 proportion bound的比值。在抗原浓度为10nM的条件下，90%的Ab1(Kd=1nM)和50%的Ab2(Kd=10nM)能够形成抗体抗原偶联物，作为ELISA检测的信号值，Ab1，Ab2亲和力10倍的差异反应到ELISA信号值上1.8倍的信号差异；在抗原浓度为1nM的条件下，50%的Ab1(Kd=1nM)和9.1%的Ab2(Kd=10nM)能够形成抗体抗原偶联物，作为ELISA检测的信号值，Ab1，Ab2亲和力10倍的差异反应到ELISA信号值上5.5倍的信号差异；在加入的抗体浓度是相同的情况下，加入反应的抗原的浓度越少，ELISA信号比值的差异和抗体亲和力比值的差异更具相关性。抗原的浓度决定了ELISA筛选方法的选择性！以上是关于杂交瘤和噬菌体展示筛选理论状态的推导，也是ELISA筛选结果出来了做出客观解读的理论依据，在实际的筛选应用过程中由于不同的待测抗体样品之间可能存在较大的浓度差异。在抗原浓度较高的情况下ELISA信号差异很多情况下由于抗体样品的浓度差异导致的，ELISA信号值对于亲和力大小不具有选择性；只有在抗原浓度较低时，信号值主要能够表征抗体亲和力的大小而一定程度上忽略浓度差异造成的影响，而在ELISA方法开发时当抗原浓度较低时，相对于抗原浓度较高时，其ELISA信号值要弱很多，提升ELISA方法信号的灵敏度，如何通过优化酶联抗体的浓度，挑选显色液和选择显色时间以增强ELISA检测的信号值是一个有区分度的ELISA筛选方法的关键。当ELISA检测的信号值得到提升时，由于筛选样品复杂性，往往其背景信号也会极大的提升，如何通过封闭液，酶标板材等降低背景信号值，得到好的信噪比是一个高质量的ELISA筛选方法的另一个关键。Part 3 - 实例分享 - ELISA用于噬菌体展示筛选布 局——————(Note 1)一 般 操 作 流 程1.酶标板的制备取浓度为100 ug/ml抗原，室温溶解，混匀用包被液按如下步骤稀释至0.2ug/ml，0.5ug/ml，1ug/ml，按加样布局表加入100ml/孔，分别加入酶标板条中 (Note 2)，其中加入包被液做包被抗体的空白对照，2-8℃过夜。2.用洗涤液洗板3次，拍干，加入300ml/孔封闭液(Note 3)室温封闭1小时；洗涤液洗板3次，拍干待用；3.取出包含有阴性对照和阳性对照过夜孵育制备含有噬菌体的深孔96孔板，在奥豪斯高速离心机中2000g离心15min，取上清，稀释10倍，一一对应加入包被好酶标板中。(Note 4)4.放入奥豪斯微孔板振荡器内 (如ISLDMPHDG- 30391935)，设置37℃、600rpm振荡1小时； 5.用洗涤液洗板3次，拍干；6.抗M13 p8酶联抗体稀释到合适的浓度（Note 5），在漩涡混合器上（如VXMNFS-30392112）混匀，100ul/孔。7.放入微孔板振荡器内，设置37℃、600rpm振荡1小时； 8.用洗涤液洗板4次，拍干；9.取酶联抗体对应的TMB显色液，临用前20分钟拿出平衡到室温，在漩涡混合器上混匀；（Note 6）10.使用8道排枪以100 ml/孔加入TMB显色液；11.显色液室温避光放置10-30分钟 （Note 7）；12.使用8道排枪以100ml/孔加入终止液终止反应；13.用酶标仪测定信号值；14.结果分析（Note 8）。Note1：由于不同的噬菌体样品有不同的亲疏水性，其对酶标板材的非特异吸附强度不一样，做一块没有抗原包被的阴性对照板是十分有必要的。Positive和Negtive是和样品有同样噬菌体制备过程，Positive Stock为早已经制备好的分装保存的阳性噬菌体，前者目的是监控在不同时间内噬菌体样品制备过程的差异，后者是监控在不同时间内ELISA检测操作的差异。Note2：在包被过程中，建议选择疏水性酶标板材（polysorp）,这样可以极大的减少背景信号值，提高整个方法的信噪比。在实验初期包被的抗原浓度需要少量0.2-1ug/ml，然后根据不同包被条件下同一样品信号大小来进行判断优化。一个已知亲和力的展示阳性抗体的噬菌体是十分有必要的，根据该阳性展示噬菌体样品的信号值来确定最终筛选过程中抗原的包被浓度。抗原直接包被酶标板材上会屏蔽部分结合位点，造成部分假阴性的结果，如果条件允许可采用生物素化抗原，首先5ug/ml的链霉亲和素包板，然后加入0.05-0.2 ug/ml不等的生物素化抗原。抗原直接包被和间接包被其效率不太一样，采用间接包被可适当降低生物素化抗原的包被浓度。Note3：在有生物素化抗原参与的ELISA实验中，不要加入含脱脂奶粉的封闭剂，脱脂奶粉含有微量生物素，会干扰整个检测体系。Note4：噬菌体上清液的稀释比例，可提前根据阳性噬菌体样品做好稀释预实验进行确定。Note5：应选择抗噬菌体的P8蛋白的酶联抗体，噬菌体有2000个以上的P8蛋白，适当的增加酶联抗体的浓度可以提高方法的灵敏程度，笔者曾增加5倍的酶联浓度得到了3倍的信号提升。Note 6：市面上TMB底物最低和最高有10倍的显色差异，建议选择市面上最强的TMB显色底物。需要提前确认检测仪器的信号线性范围，比如一般的酶标仪吸光度值的信号线性范围在0-3，吸光度值在3-4之间为非线性的，信号值超过3时，信号和亲和力的相关性变差。Note 7：显色时间可适当的延长，一般来说在30分中内显色的信号值和显色的时间成线性。Note 8：条件的选择最终是通过阳性噬菌体的信号值决定的，阳性噬菌体的亲和力大小是一个非常重要的选择参数。如阳性噬菌体的亲和力为1nM时，筛选的目的是得到高亲和力的抗体，可以选择阳性噬菌体的信号在OD值为0.5时的条件作为最终的筛选条件，这样很多OD值很小的低亲和力的抗体均被过滤掉；筛选的目的是尽可能得到多的亲和力抗体，可以选择阳性噬菌体的信号在OD值为2-3时的条件作为最终的筛选条件，低亲和力的抗体在OD值上也不会太小，可以得到体现。不论如何抗原的浓度大小决定了选择性，选择较小的抗原浓度进行反应是信号和亲和力大小匹配的关键和趋势性选择，信号大小的调节可以通过酶联抗体浓度，高显色能力的显色液和显色时间进行调节。如果在一块板的检测中未知样品的信号值大小呈合理的分布是ELISA条件较好的表现。Part 4 - 总结 - ELISA用于杂交瘤和噬菌体展示筛选是ELISA用于亲和力测定方法的一种变种，想要得到好的信号和亲和力大小的相关性，低抗原浓度条件下进行方法学开发是必须的。低抗原浓度条件下会有低的信号值，通过增加酶联抗体浓度，选择高显色能力的显色液和延长显色时间，增加ELISA灵敏程度是ELISA优化的技术方向。由于检测样品的多样性和复杂性，高灵敏的ELISA检测体系必然会导致背景信号的增加，无法得到很好的信噪比，疏水性的酶标板条，尽可能低的样品的稀释倍数是解决这个问题的关键。一个稳健的能用于杂交瘤和噬菌体展示筛选方法是ELISA各种耗材，试剂和实验条件的完美组合，需要对试剂耗材的多种可能进行探索，也是平台经验的系统汇总，以下是用于筛选方法的优化方向的汇总。 以上，就是小奥带给大家的第四篇ELISA方法学开发的干货内容！我们下期再见哦！