质谱泛素化位点检测

泛素化过程对于细胞稳态调控的重要性不言而喻。除了参与UPS（泛素-蛋白酶体系统，ubiquitin-proteasome system）介导的蛋白降解外，泛素化还是重要的信号通路和亚细胞定位调控手段。随着PROTAC药物的兴起，泛素化系统也受到了进一步的重视，成为了新兴的药物研发方向。在本期的前沿案例中，研究人员关注重要的细胞周期和DNA修复调控蛋白PCNA(增殖细胞核抗原)，及其K164单泛素化修饰。该修饰过程是DNA损伤耐受通路激活的关键步骤，也是潜在的抗肿瘤靶点。利用强大、灵活，并可支持定量的ALPHA蛋白互作技术，研究针对PCNA单泛素化过程中的各个环节均建立了高通量筛选和分析体系。以此为基础，研究进一步开展小分子药物筛选，并成功获得一系列具有靶向活性的氧杂蒽酮化合物。这些药物不仅为研究PCNA单泛素化功能供了新的工具，也为该方向的抗肿瘤药物研发打下基础。作为核心的PPI筛选和分析平台，ALPHA技术主要参与了该研究以下工作:一、建立靶向PCNA单泛素化各个环节的筛选和分析体系与常见的泛素化过程一致，PCNA 单泛素化也需要E1（Uba1，泛素活化酶），E2（Rad6，泛素携带蛋白）和E3（Rad18，泛素蛋白连接酶）发挥作用。利用一系列反应中出现的相互作用，研究基于APLHA技术构建了Uba1-ubiquitin相互作用；Rad6-ubiquitin相互作用；Rad18自泛素化和最终的PCNA泛素化检测和分析平台（见上图）。并在此基础上，研究进一步建立Rad6和Rad18以及Rad6和Ubr1互作分析方法，用于协助评价候选小分子。上述方法全面覆盖了泛素化过程中的各个反应，也展现ALPHA技术用于PPI分析的高度灵活性。二、靶向PCNA单泛素化的小分子抑制剂筛选在之前PCNA单泛素化检测的基础上，研究继续从蛋白浓度、稀释倍数和Beads浓度等多个方面优化ALPHA体系，并开展高通量小分子药物筛选。研究发现一系列的氧杂蒽酮化合物，如NSC 9037能有效抑制PCNA的泛素化，而类似结构的荧光素和阴性化合物则不能。上述发现与经典的Western blot或 Gel-based法的检测结果有较好的一致性，也间接反应了ALPHA技术抗荧光干扰的优势（见上图）。三、候选小分子活性评价针对泛素化的主要环节，研究继续利用ALPHA技术分析一系列候选药物的特异性和可能的工作机制。通过对比Uba1-ubiquitin相互作用(上图左，该检测中NSC 9037为阴性化合物)；Rad6-ubiquitin相互作用(上图中)和Rad18自泛素化(上图右)检测的结果，研究证明NSC 9037能特异抑制Rad6和ubiquitin的相互作用，以及下游的Rad18自泛素化。基于ALPHA平台，研究继续构建和优化Rad6和Rad18（上图左）/Ubr1（上图中）相互作用检测平台，证明NSC 9037能特异阻断Rad6和Rad18的相互作用，是首个报道的Rad6-Rad18互作抑制剂。最后，在肿瘤细胞模型上，NSC 9037和其他筛选获得的PCNA泛素化抑制剂，均表现出不同程度的细胞毒性(上图右)，为肿瘤药物研发提供了新的潜在方向。在PCNA泛素化抑制剂筛选和解析的过程中，ALPHA技术因其强大的灵活性发挥了重要的推动作用。相较于传统技术路线，ALPHA具有高灵敏度、优越的动态范围和能灵活支持不同亲和力范围和距离下的互作检测，是蛋白互作筛选和分析的利器。靶向蛋白互作的抑制剂筛选，除了ALPHA平台外，我们还提供同样均相的HTRF技术和非均相DELFIA技术平台，和相应的涵盖试剂、微孔板、检测平台和自动化的全线解决方案，满足不同的蛋白蛋白/蛋白小分子互作检测需求。

p style="text-indent: 2em "北京时间5月24日凌晨，北京软物质科学与工程高精尖创新中心、北京化工大学生命学院冯越教授研究组在strongiNature/i/strong在线发表了题为span style="color: rgb(79, 129, 189) "iStructural basis of ubiquitin modification by theLegionella effector SdeA/i/span的研究长文(Article)，报道了span style="color: rgb(255, 0, 0) "嗜肺军团菌内一种新型的泛素修饰与连接酶——SdeA及其与泛素复合物的晶体结构，揭示了其修饰泛素及催化新型泛素化过程的工作机理/span。这是北京化工大学历史上首篇发表在strongiNature、Science、Cell/i/strong三大国际顶级学术期刊主刊的研究论文。/pp style="text-align: center "img title="1.jpg" style="float: none " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201805/insimg/dbfb3a2a-d837-40e3-9ed6-2700d7be0684.jpg"//pp　　泛素化是泛素在特定酶的作用下，对底物蛋白进行特异性修饰的过程，几乎参与一切生命活动的调控，与肿瘤、心血管等疾病的发病也密切相关【1】。常规的泛素化过程是由E1、E2、E3三个酶的级联反应催化的，最终将泛素蛋白转移到底物的赖氨酸残基上【2】。然而，美国普渡大学罗招庆研究组在2016年的istrongNature/strong/i文章中报道，嗜肺军团菌(嗜肺军团菌是一种条件性致病菌，引起人的以非典型性肺炎为主要症状的军团菌病，该菌通过其Dot/Icm IV型分泌系统输送超过300个效应蛋白到宿主细胞内，改变宿主的多种信号通路以构建其在宿主内的最适生长环境)中以SdeA为代表的SidE家族可以通过一种全新的、完全不同于经典泛素化的方式修饰泛素，并催化其对几种内质网相关蛋白的泛素化过程，实现all-in-one的泛素化模式【3】。紧接着，在2016年底，Ivan Dikic研究组报道了对该反应过程的进一步研究，明确了SdeA的mART和PDE结构域经过两步催化反应最终完成对底物的泛素化过程【4】。在该过程中，泛素第42位的精氨酸先在mART结构域的作用下被修饰成ADP核糖基化泛素。随后，该修饰形式的泛素在PDE结构域的作用下生成磷酸核糖基化泛素，并转移到底物或SdeA自身的丝氨酸残基上。此外，罗招庆实验室的另一项工作证明SidJ具有去泛素化功能以逆转由SidE家族蛋白对底物的修饰，其活性不依赖于活性的半胱氨酸残基【5】。br//pp　　巧合的是，在Ivan Dikic组Cell文章在线发表的同一天(2016年12月1日)，冯越研究组获得了SdeA核心区231-1190区域的初步结构信息(图1a)，确认了SdeA中mART和PDE组成活性中心，C端结构域形成scaffold的基本结构组成方式(图1b)。通过结构分析和功能实验，冯越研究组发现，与PDE结构域自身即具备催化活性(即可以以ADP核糖基化泛素作为底物催化该新型泛素化反应)不同的是，mART结构域则需要PDE结构域的稳定作用才能维持正常的活性。在维持mART活性的结构要素中，mART结构域一段伸到PDE结构域中的loop(789-797段氨基酸)发挥了重要功能，在该文章中被命名为“Plug” loop。随后，冯越研究组又进一步获得了该区段SdeA与泛素复合物、及与泛素-NADH复合物的晶体结构，从而揭示了泛素与mART结构域的结合模式。span style="color: rgb(255, 0, 0) "在二者结合的过程中，mART结构域的ARTT和PN loop，以及α-helical lobe均发挥了重要作用/span(图1c)。而泛素分子中参与结合的则主要是其C端区域，尤其是泛素的R72和R74两个氨基酸分别结合到mART结构域表面的两个带负电的凹槽中(图1d)，起到最关键的锚定作用。这两个氨基酸的单突变均可使得泛素失去被SdeA的mART结构域修饰的能力。/pp style="text-align: center "img title="2.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201805/insimg/ecdeddf9-3bc8-480c-94b1-0a95e6a21c9d.jpg"//pp style="text-align: center "图一 /pp　　在SdeA mART和泛素-NADH复合物结构中，最令人吃惊的一点在于，R72要比被修饰的R42更靠近活性中心(作为亲核基团的R42的ε氨基N原子距离作为亲电基团的NAD+中与烟酰胺基团相连的核糖C1原子之间的距离为11.7埃)。从直观上看，这与R42被mART修饰是相矛盾的。经过查阅文献，冯越研究组发现部分mART蛋白的催化机制被认为是SN1反应，即烟酰胺基团会先从NAD+中脱离，使得NAD+转变为活性中间体(oxocarbenium cation intermediate)，之后发生亲核攻击反应。受此启发，冯越研究组将复合物结构中的NADH替换成该活性中间体，并对该体系进行了分子动力学模拟。其结果显示，R72在模拟过程中远离了活性中心，而R42则进入活性中心并占据了之前R72所在的位置，最终使得R42的亲核基团和NAD+的亲电基团之间的平均距离缩短至4.46埃。br//pp　　文章的最后部分还对SdeA的C端结构域的功能进行了研究，通过体外pull down和凝胶过滤层析实验，冯越研究组证明了SdeA的C端结构域结合IcmS-IcmW蛋白复合物，并且其1191-1350区域可与IcmS-IcmW及DotL的C端形成四元复合物。这表明span style="color: rgb(255, 0, 0) "SdeA的C端结构域可能在SdeA转移到宿主细胞的过程中发挥功能/span。br//pp　　strongSdeA是目前为止世界上首个鉴定出的新型泛素连接酶，其与泛素复合物结构的解析揭示了一种全新的泛素化结构机理/strong。由于哺乳动物也含有类似结构，同时其他细菌可能也具有类似的、尚未发现的泛素化系统，所以在未来，该研究将帮助鉴定出其它新型泛素化系统，从而丰富我们对细胞生命过程的认知 同时，嗜肺军团菌是军团菌肺炎这一潜在致死性肺炎的致病微生物，SdeA的结构解析也为设计针对该家族蛋白的小分子抑制剂，作为治疗军团菌肺炎的潜在抗生素奠定了重要基础。br//pp　　据悉，北京化工大学硕士研究生strong董亚南/strong、strong穆雅娟/strong、strong解永超/strong及清华大学博士研究生strong张玉鹏/strong依次为本论文的共同第一作者，strong冯越/strong教授为本文的通讯作者，strong北京软物质科学与工程高精尖创新中心/strong及strong北京化工大学/strong为第一完成单位。/pp style="text-align: center "img title="3.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201805/insimg/bd22f066-6d36-42e6-8e93-c7244d62eb5c.jpg"/　/pp style="text-align: center "冯越教授课题组合影/pp　　span style="color: rgb(0, 176, 80) "BioArt后记：冯越研究组的这篇文章是与Ivan Dikic研究组和美国康奈尔大学的Yuxin Mao研究组一起以back-to-back的形式共同向Nature投稿的(span style="color: rgb(127, 127, 127) "2017年9月24日投稿，2018年3月28日接收/span)。在这三篇文章中，冯越研究组以mART结构域为主要研究对象，而另外两个研究组的重点则是PDE结构域。在三篇文章投到Nature四个多月后，中科院生物物理所高璞组将SidE家族的另一蛋白SidE的结构功能研究投稿到Cell杂志，该文章也于日前发表(span style="color: rgb(79, 129, 189) "Cell丨高璞组揭示新型泛素化修饰的作用机制——胡荣贵、王丰点评/span)。值得一提的是，在这四篇文章中，冯越研究组报道的结构所包含的SidE家族蛋白的长度是最长的，同时该文章也是四篇文章中最早接收的。/span/pp style="text-align: center " img title="4.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201805/insimg/7f148278-a4e4-4914-a656-49f2a40ebdae.jpg"//pp style="text-align: center "Nature同期发表的Ivan Dikic研究组和Yuxin Mao研究组的研究论文/ppspan style="color: rgb(192, 0, 0) "冯越教授简介：/span/pp style="text-align: center "　　img title="5.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201805/insimg/43fed980-f71b-488b-9b41-08880433a4b5.jpg"//pp　　冯越，1985年生，辽宁锦州人，教授、博士生导师。2013年7月博士毕业于清华大学结构生物学中心，经高层次人才引进进入北京化工大学生命科学与技术学院工作，主要以蛋白质结构生物学为手段，对多酶生物分子机器及重大疾病相关蛋白质的结构与功能进行研究。共发表SCI论文23篇，其中第一作者或通讯作者论文11篇，分别发表在Nature (两篇，第一作者和通讯作者各一篇)、Nature Plants (通讯作者)、PNAS (共同第一作者)等国际著名期刊上。作为项目负责人主持国家及省部级项目3项，其中国家自然科学基金青年项目和面上项目各一项，北京市自然科学基金项目一项。/ppspan style="color: rgb(192, 0, 0) "参考文献/span/pp1. Hershko, A., A. Ciechanover, and A. Varshavsky, Basic Medical Research Award. The ubiquitin system.Nat Med, 2000. 6(10): p. 1073-81./pp2. Komander, D. and M. Rape, The ubiquitin code. Annu Rev Biochem, 2012. 81: p. 203-29./pp3. Qiu, J., et al., Ubiquitination independent of E1 and E2 enzymes by bacterial effectors. Nature, 2016.533(7601): p. 120-4./pp4. Bhogaraju, S., et al., Phosphoribosylation of Ubiquitin Promotes Serine Ubiquitination and Impairs Conventional Ubiquitination. Cell, 2016. 167(6): p. 1636-1649 e13./pp5、Qiu, J., Yu, K., Fei, X., Liu, Y., Nakayasu, E. S., Piehowski, P. D., ... & Luo, Z. Q. (2017). A unique deubiquitinase that deconjugates phosphoribosyl-linked protein ubiquitination. Cell research, 27(7), 865./p

近日，中国科大生命科学学院、合肥微尺度物质科学国家实验室田长麟教授和清华大学刘磊教授合作，基于蛋白质化学全合成方法制备了不同类型的双泛素蛋白，在特定位点引入光活化交联基团，并成功鉴定高选择性双泛素结合蛋白。相关研究成果以“Chemical synthesis of diubiquitin-based photoaffinity probes for selectively profiling ubiquitin-binding proteins”为题发表在《Angewante Chemie Int. Ed.(DOI: 10.1002/anie.201611659)》上，该文章于2017年2月1日在网上公开发布。　　泛素化修饰是蛋白质翻译后修饰中非常复杂的一类体系，目前发现存在8种多泛素连接方式，分别在泛素蛋白的Met1、Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48、ys63等不同位点上接入下一个泛素蛋白。这些不同类型的蛋白质多泛素修饰在细胞自噬、蛋白酶体降解、细胞信号传导及DNA损伤修复等生命活动中执行非常多样的功能。但是，目前针对多泛素蛋白的生物法制备较为困难，导致选择性识别并结合多泛素修饰的蛋白质的了解非常贫乏。近年来，中国科大田长麟实验室和清华大学刘磊实验室通过紧密合作，在蛋白质化学全合成尤其是含有特种标记、翻译后修饰的膜蛋白、蛋白质复合物的化学全合成及组装等方面取得了多项重要突破(Angew Chemie2013,52:9558，JACS2014, 126:3695，Angew Chemie2015, 54:14276， JACS2016, 128:3553等)，并于近期发展了蛋白质泛素化修饰的化学合成技术并应用于含泛素化修饰核小体的冷冻电镜(cryo-EM)结构解析(ChemBioChem2017, 18:176)。这些为基于蛋白质化学全合成制备含有光交联基团的不同类型双泛素蛋白制备和高选择性结合蛋白的质谱鉴定提供了重要基础。　　 含有光交联基团的双泛素蛋白化学全合成及不同类型双泛素特异性结合蛋白的质谱鉴定　　近期，中国科大田长麟实验室、严以京实验室和清华大学刘磊实验室密切合作，应用基于蛋白质化学全合成方法制备了Lys48连接、Lys63连接的双泛素蛋白，并在蛋白质化学合成过程中在Ala46位点上引入不同的光交联基团。通过和标准泛素蛋白结合实验，确认了双泛素蛋白合成的有效性，并优化了光交联基团的反应条件。在此基础上，从哺乳动物细胞HEK293裂解液中通过光激活双泛素蛋白，并应用质谱方法鉴定出多个能和Lys48-连接双泛素、Lys63-连接双泛素结合的蛋白质，为后续进一步分析这些双泛素结合蛋白在细胞自噬、DNA损伤修复等生理活动中的功能机制提供了重要的前期基础。相关工作将为分析其他蛋白质相互作用、细胞中配体-受体发现等重要科学问题提供可靠的方法学手段。　　合肥微尺度物质科学国家实验室、化学物理系博士研究生梁军为该研究工作的第一作者。该研究工作得到了科技部、国家自然科学基金的资助。