归一化响应比

蛋白归一化在Western Blot中的应用 在Western Blot（WB）实验中，归一化是实验数据处理的关键步骤。WB实验常设计不同的内部对照或检查点，对样本或者实验中的偏差进行监控、修正。在WB中的偏差通常来自蛋白样本浓度不均、凝胶上样不一致或转膜不完全。这些不一致性可以通过凝胶和膜的可见光或荧光标记法监控，用泳道总蛋白或内参蛋白（比如GAPDH、β-tubulin、β-actin或cyclophilin B）进行归一化校正, 来保证实验结果的可靠性。那么泳道总蛋白校正和内参蛋白校正有什么不同呢？内参蛋白校正使用内参蛋白校正是目前比较成熟的一种手段。具体校正方法就是在各蛋白样品中选一种表达量保持一致的蛋白作为内参蛋白（一般是管家基因），将每个样品目的蛋白含量与内参蛋白含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量。再进行样品与样品之间的比较。例：当前有三份蛋白样品S1、S2、S3，选择的内参基因为Control，需要检测目的蛋白Test在这三份样品中的相对表达量。经过电泳、转膜、封闭、孵育、清洗等一系列实验操作后，获得一张蛋白印迹膜。用GelView 6000 Pro全自动化学发光成像系统或GelView 6000Plus智能图像工作站进行显影成像，获得的发光图。如图1所示：图1BioAnaly分析软件具有蛋白归一化分析功能，可以直接输出蛋白归一化结果，不需要进行额外的操作，方便快捷，如图2所示： 图2最终得到实验结果如图3所示：图3如果仅看三个样品中目的蛋白的灰度值（如图3中蓝色数据条所示），会发现其发光强度基本一致。此时并不能判断目的蛋白的含量一致，因为内参蛋白的灰度值相差较大（如图3中橙色数据条所示），因此还需要通过内参蛋白进行校正，将内参蛋白的灰度值归一化，可得到三个样品中目的蛋白的真实灰度值，该结果才能比较准确地反映目的蛋白的含量。计算结果如图4所示：图4通过内参蛋白校正后发现待测蛋白在三个样品中的相对表达量呈梯度上升趋势。泳道总蛋白校正总蛋白校正是一种新兴的实验策略。具体校正方法就是直接测量样品中总蛋白的含量（通过非特异性蛋白染料对泳道中所有蛋白进行染色测定），将每个样品目的蛋白含量与总蛋白含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量。再进行样品与样品之间的比较。例：当前有四份蛋白样品S1、S2、S3、S4，需要检测目的蛋白Test在这四份样品中的相对表达量（本次实验中使用的非特异性荧光染料，可以对所有蛋白进行染色；二抗为FITC荧光标记）。经过电泳、转膜、封闭、孵育、清洗等一系列实验操作后，获得一张蛋白印迹膜。用GelView 6000Plus智能图像工作站的荧光模块进行荧光成像，结果如图5所示，泳道内所有蛋白均产生荧光，荧光强度可以代表样品总蛋白的含量：图5通过分析软件BioAnaly计算灰度值，得到实验数据，如图6所示：图6使用475nm的蓝光（不同荧光染料所需波长参照试剂的使用说明）激发目的蛋白Test，结果如图7所示：图7通过分析软件BioAnaly计算发光强度，得到实验数据，如图8所示：图8从上图可以看出，目的蛋白在S3中的发光强度最大，接近S2的2.5倍。然而经过蛋白归一化后，结果，如图9所示：图9我们不难发现目的蛋白在四份样品中表达量基本一致，所以我们说蛋白归一化是必须的。相应的，BioAnaly分析软件也可以直接对总蛋白进行归一化分析。两种方法的对比内参蛋白校正优点1、发展时间久，技术成熟；2、成本低，不需要额外的染色；缺点1、需要根据不同的组织选择不同的内参蛋白，以保证样品间的一致性；2、内参蛋白大小与目的蛋白大小相差5KD以上，防止发光时互相干扰；3、内参蛋白与目的蛋白表达量不能相差过大，防止内参蛋白曝光过度；4、需要证明内参蛋白本身的表达量在各样品间保持一致；总蛋白校正优点1、适用于任何组织样本；2、具有更好的说服力，投稿更方便；缺点1、染料具有一定的线性范围，需要一定程度上控制上样量；2、每次都需要对整张膜进行染色，试剂使用量大；总结在Western Blot实验中，归一化处理是关键步骤，归一化以后才能进行蛋白浓度的对比。其中，内参蛋白校正由于其发展时间久、成本低等优点，受众多，积累了大量的使用经验，同时有丰富的试剂种类可供选择，对于常规实验对象的研究是很好的方法；总蛋白校正则是直接测得整个泳道（样本）内所有蛋白的含量，不用担心内参蛋白本身带来的误差，对于没有参考资料的新样本来说十分适合。所以，两者是相辅相成的，大家可以根据自己的实际情况进行选择。除了选择合适的归一化方法以外，一台高灵敏度的光信号捕捉设备也是获得理想实验数据所必需的。博鹭腾公司在光子信号的高效率识别接收领域有着多年的研发经验，旗下的GelView6000系列产品配备了科研级冷CCD相机、多色荧光光源以及功能强大的BioAnaly分析软件，能对泳道内的蛋白做准确的定量和定性分析，完全兼容这两种归一化方法的需求，并且设备操作简便，5分钟即可上手，欢迎各位老师咨询试用。

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Cinogy光束质量分析仪—角度响应校准：应用于大角度发散角的激光光束测量1.1 应用范围有不同种类的应用需要考虑角度响应。这些应用大多使用(非常)发散的光束。在这种情况下，我们在一幅图像中有连续的入射角范围。照相机的灵敏度取决于激光束的入射角，这是由过滤器和传感器造成的。1.2 角度线性原因1.3过滤器这里，我们将只考虑吸收滤波器。如果光束没有垂直入射到滤光器上，则通过滤光器的路径较长。较长的路径导致较强的吸收，因此相机(滤光片和传感器)的响应较低。与过滤器相关的效果是各向同性的。但是，如果滤光器相对于传感器倾斜(取决于相机型号)，则会在滤光器倾斜的方向上产生各向异性。入射角αin的线性透射可以用数学方法描述，如果透射指数为垂直光束T0和折射率n已知。因为对吸收性滤光片来说，T0与波长有很大的线性关系，与入射角度有关的相对透射率Trel也与波长密切相关。1.4 传感器角度响应取决于传感器技术、传感器类型、波长和微透镜。通常它不是各向同性的。图1:KAI-16070对单色光(未知波长)的角度线性灵敏度。参考:KAI-16070的 数据表图2 CMX4000白光的角度线性灵敏度如这些示例所示，对于不同类型的传感器，角度响应可能完全不同。因为这种效应还 取决于波长和单个传感器(每个传感器表现出稍微不同的行为)，取决于波长的校准是必要的。两个传感器都显示出各向异性。为了考虑校准中的各向异性，需要比仅在x和y方向上更复杂的测量。2 涂层通过一种特殊的涂层，我们可以消除(主要是抑制)传感器本身的角度产生。剩余的影响角度的灵敏度是由滤波器引起的。这产生了以下主要优点:1）剩余的角度响应是各向同性的，这意味着它不再取决于入射角的方位角。2）剩下的角度响应的校正系数更小，因此更不容易出错。下面的图表显示了CinCam cmos Nano 1.001在940nm下的两个角度响应测量值，前面有CMV4000传感器和OD8吸收滤光片。第1张图表中的摄像机采用默认设置，没有特殊涂层。图3:CMV 4000传感器在x(蓝色)和y(橙色)方向的角度响应，前面有OD8吸收滤光片，在940nm处测量。上半部分显示相对角度响应，下半部分显示测量点和蕞佳拟合曲线之间的相对偏差。第二张图中的相机是用特殊涂层制作的。图4:CMV 4000传感器在x(蓝色)和y(橙色)方向的角度响应，该传感器具有特殊涂层，前面有OD8吸收滤光片，在940纳米处测量。上半部分显示相对角度响应，下半部分显示测量点和蕞佳拟合曲线之间的相对偏差。这里，角度响应是各向同性的、平滑的，对于大角度，下降效应不太明显。CinCam CMOS Nano Plus-X针对传感器和外壳正面之间的极短距离进行了优化。这使得入射角度高达65°时的角度响应测量成为可能。3 角度响应的拟合函数拟合函数是Zernike2多项式，其中入射角的正弦用于半径。这些多项式为入射角的任意方向提供了x和y方向的简单插值。用这种方法，我们可以用少量的系数描述高达±60度的测量结果。4 均匀性由于生产原因，涂层并不在任何地方都具有完全相同的厚度。这导致照相机灵敏度的不均匀性增加。这个缺点通过进一步的均匀性校准来补偿。图5:940纳米无涂层传感器(紫色)和均匀性校准后(绿色)的相对灵敏度。5 精度整体精度取决于以下几点:1）拟合精度。2）角度响应的各向同性。3）垂直光束位置(x，y)的精度。4）顶点到传感器的光学距离的精度(z)。5）蕞大角度下的角度响应下降。通过特殊的涂层，我们可以提高拟合精度和角响应的各向同性。此外，大角度灵敏度的相对下降要弱得多。6 RayCi中的校正要求为了根据角度响应校正图像数据，必须满足以下要求：1）角度响应校准数据必须可用于每个波长。该数据由蕞佳拟合的Zernike多项式系数组成。2）为了生成从每个像素到相应入射角的映射，必须知道光束垂直的x和y传感器位置。3）需要传感器和激光焦点位置之间的光学距离。4）CINOGY Technologies提供外壳和传感器之间的光学距离作为额外的校准数据。5）外壳和焦点之间的距离必须由用户提供。6）软件版本必须是RayCi 2.5.7或更高版本。 昊量光电提供的德国Cinogy公司生产的大口径光束分析仪，相机采用CMOS传感器，其中大口径的CMOS相机可达30mm，像素达到惊人的19Mpixel。是各种大光斑激光器、线形激光器光束、发散角较大的远场激光测量的必不可少的工具。此外CinCam大口径光束分析仪通用的C/F-Mount 接口设计，使外加衰减片、扩束镜、紫外转换装置、红外转换装置更为方便。超过24mm通光孔径的大口径光束分析仪CinCam CMOS-3501和CinCam CMOS-3502更是标配功能齐全的RayCi-Standard/Pro分析软件，该软件可用于光束实时监测 、测量激光光斑尺寸 、质心位置、椭圆度、相对功率测量（归一化数据）、二维/三维能量分布（光强分布） 、光束指向稳定性（质心抖动） 、功率稳定性 （绘制功率波动曲线）、发散角测量等 ，支持测量数据导出 ，测试报告PDF格式文档导出等。主要特点： 1、芯片尺寸大，可达36mm 2、精度高，单像元尺寸可达4.6um 3、支持C/C++, C#, Labview, Java语言等多种语言二次开发主要技术指标：RT option: CMOS/ccd-xxx-RT：响应波长范围：320~1150nmUV option:CMOS/CCD-xxx-UV：响应波长范围：150nm~1150nmCMOS/CCD-xxx-OM：响应波长范围：240nm~1150nmIR option:CMOS-xxx-IR：响应波长范围：400~1150nm + 1470nm~1605nm 关于昊量光电昊量光电 您的光电超市！上海昊量光电设备有限公司致力于引进国外先进性与创新性的光电技术与可靠产品！与来自美国、欧洲、日本等众多知名光电产品制造商建立了紧密的合作关系。代理品牌均处于相关领域的发展前沿，产品包括各类激光器、光电调制器、光学测量设备、精密光学元件等，所涉足的领域涵盖了材料加工、光通讯、生物医疗、科学研究、国防及前沿的细分市场比如为量子光学、生物显微、物联传感、精密加工、先进激光制造等。我们的技术支持团队可以为国内前沿科研与工业领域提供完整的设备安装，培训，硬件开发，软件开发，系统集成等优质服务，助力中国智造与中国创造! 为客户提供适合的产品和提供完善的服务是我们始终秉承的理念！