甲基吡恶磷

目前我国农产品农药残留现状，可以用三句话来概括，即近年不断好转，总体现状较好，但仍存在隐患。具体来说，一是全国每年3-5次的农产品质量安全例行监测显示逐年好转和大为改善的结果，不仅表现于农药残留超标率逐年持续下降，已从十年前的超过50%到目前的10%以下；而且表现在残留检出值也是明显降低，十年前检出超过1 mg/kg农药残留量的蔬菜数量较多，但现已很少见，仅偶有检出超过1 mg/kg的。二是目前农产品农药残留监测合格率总体较高，如稻米和水果高达98%以上，蔬菜和茶叶也达95%以上。 三是目前农药残留状况尚不稳定，仍然存在着一些风险隐患，如南方地区或其他地区的夏季由于病虫害发生重、农药使用量大、易造成农产品农药残留超标，又如在设施反季节栽培情况下由于农药用量大并且不易降解、也易引起农药残留超标，还有随着国内外残留限量标准的提高或监测农药种类的增加、原来不超标的农产品变成了超标；特别是由于我国农业生产的产业规模太小，有众多千家万户的农民分散生产和经营，加上生产技术较为落后，基地准出和市场准入难以真正做到，造成监管更加困难。 同时，人们往往喜欢比较我国与欧美发达国家的标准。在农药残留标准数量方面，由于欧美农药管理历史长，我国农药残留的标准数量相对还比较少，因此，加快制定和完善农药残留标准是十分重要的工作。但有一点要明白，在标准的水平方面，很难比较各国残留标准的高低。从技术层面讲，各国的农业生产、农药使用情况和食物结构等不同，因此，残留标准会存在一定差异。从管理层面讲，尽管制定残留标准的主要目的是为了确保食品安全，但现在各国越来越将农药残留作为农产品国际贸易的技术壁垒，必要时进而用作政治筹码。各国农药残留标准差异还受以下几个因素的影响。一是对于本国不生产不使用的农药，往往制定最严格的标准，而本国使用的农药特别是在出口农产品上使用的农药，残留标准在安全范围内尽可能松。如美国、欧盟和日本对本国没有登记使用的农药按照一律限量标准（即0.01~0.05mg/kg）执行，而这个浓度许多发展中国家的仪器都难以检测；但是在本国登记使用的农药，即使农药毒性高，其标准却松。如美国规定高毒农药甲胺磷在芹菜上的标准为1mg/kg，花椰菜上为0.5mg/kg，日本规定芹菜上为5mg/kg，花椰菜上为1mg/kg。 二是本国没有或主要依靠进口的作物上的标准严。如氯虫苯甲酰胺是个新杀虫剂，欧盟在葡萄上的标准为1mg/kg，而在大米等粮谷上却为0.01mg/kg，茶叶上为0.02mg/kg，按理葡萄可鲜食，标准应该更高，但葡萄是欧洲的优势作物，因此制定的标准松；再如常用的杀菌剂百菌清，欧盟在直接食用的苹果、梨上标准为1mg/kg，而在大米等粮谷上却为0.01mg/kg，在茶叶上为0.1mg/kg。 三是同一作物，各国标准也不同，如安全性不很高的杀菌剂克菌丹在稻谷中的残留标准，日本是5mg/kg，欧盟为0.02mg/kg，相差100倍；又如高毒农药甲基对硫磷，日本为1mg/kg，欧盟为0.02mg/kg，相差50倍。 为了协调和统一残留标准，国际食品法典委员会负责制定农药残留国际标准，但即使有国际残留标准，大部分发达国家都执行自己的本国标准，而绝大部分发展中国家因为制定残留标准能力弱，往往只能执行国际标准。 我国是国际食品法典农药残留标准委员会的主席国，因此，我国的农药残留标准尽可能与国际食品法典标准（而不是欧美日标准）接轨，有的标准比发达国家低，但有的标准比发达国家高。 如新农药甲氧虫酰肼我国在甘蓝中的标准为2mg/kg，而美国和日本的为7mg/kg；马拉 硫磷是老农药，我国在柑橘、苹果、菜豆中的标准为2mg/kg，在糙米中为1mg/kg，在萝卜中为0.5mg/kg，均严于美国8mg/kg的标准；嗪草酮在大豆中标准为0.05mg/kg，而美国的为0.3mg/kg、欧盟和日本为0.1mg/kg的标准；常用杀菌剂噻菌灵我国在蘑菇中的标准为5mg/kg，美国为40mg/kg、欧盟10mg/kg、日本60mg/kg，分别比他们严格8、2、和12倍。 我国制定农药残留标准主要考虑安全，很少涉及贸易保护问题。由此可知，不管各国残留标准水平是否存在差异，残留标准都是根据安全风险评价而制定的，只要符合残留标准，农产品是安全的，不能用别国的标准来判断是否存在安全，不能用一国标准否定别国的标准，这缺乏科学性。因为农药残留标准是不仅仅根据安全风险评估结果来制定，也综合考虑产业发展、国际贸易等各方面因素。 如果不能确定或者过分担心农药残留标准不合格，还可以自行进行检测。 BePure专注于标准物质的研发和生产已有20多年，对于农药残留检测有着丰富的经验，满足国内检测实验室在农残领域的要求。配套的营运中心和售前售后团队保证产品品质和服务可靠快速。现在是很多政府实验室、制药企业、第三方机构和科研单位“指定供应商”。

近日，南京腾辰生物宣布完成数千万元A轮融资，本轮融资由树兰俊杰资本领投，知名个人投资人跟投，探针资本担任独家财务顾问。本轮融资主要用于biomarker专利库和临床样本的进一步积累，加速后续产品管线的研发，着重推进肺结节良恶性判别IVD产品的注册检及后续的医疗器械证申报，以及LDT产品的商业化落地。腾辰生物成立于2018年，专注于针对恶性肿瘤的核酸质谱早筛早诊产品研发。从公司成立之初开始，就着手与国内顶尖医院合作，建立全球高水平的早期癌症样本库。截至目前已经积累了两万余例临床样本，并基于真实世界的临床样本开发原研靶点阵列，布局了一系列分子标志物专利，建立专利护城河。同时，围绕核酸质谱平台优化工艺流程，自研自产基础试剂盒，在提高产品壁垒的同时大大降低检测成本，提升临床可及性及数据稳定性。肿瘤早筛早诊市场规模达千亿，其中分子诊断市场近几年增长迅速。DNA甲基化被认为是极佳的肿瘤体外早诊分子标志物，可以针对包括肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、结直肠癌、宫颈癌等一系列恶性肿瘤进行早期检测。尽管目前针对DNA甲基化已经有多款产品上市（适应症包括结直肠癌、宫颈癌等），但大部分的产品所检测的疾病范围尚集中在能够获取肿瘤附近组织样本的类型。而恶性肿瘤早期体外诊断最佳的介质是血液，因为其采样简单且几乎适用于所有癌种，但早期恶性肿瘤患者血液中甲基化信号弱、背景噪音强，想要精准捕捉相应信号的难度极大。目前，针对甲基化的检测主要有三种方式，分别为qPCR、二代测序及定量核酸质谱。其中，qPCR检测相对简单、生信分析要求较低，且相应的仪器在临床端较为普遍，IVD报证先例较多。然而qPCR只适用于检测位点相对较少的产品（1-5个位点最佳），且检测的精密度相对较低，因此不适用于血液样本的检测。而基于NGS做甲基化检测的精密度相对较高，可同时检测成千上万个DNA位点，但其操作相对复杂，生信要求和成本均较高，更适用于位点的筛选。而定量核酸质谱操作相对简单，生信要求低，数据稳定性高，适用于10-100个DNA位点的检测范围，符合血液样本临床检测的应用场景。然而，在应用核酸质谱检测过程中几乎所有步骤的试剂盒均需进口，如何降低检测成本、优化检测流程，且如何选取合适的分子标志物阵列，均为应用该技术平台需要解决的难题。目前，围绕核酸质谱检测平台，腾辰生物共布局了近10条产品管线，覆盖包括肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤。其中，肺癌早诊产品已经完成了4000余例临床验证（其中I期肺癌比例大于90%），对于2cm以下的极早期肺癌的灵敏度与特异性均＞80%。与竞品相比，腾辰生物的肺癌早诊产品”菲捷明“拥有采血量低、对样本要求低、成本及终端价格低等优势，目前正在推进商业化落地和准备启动IVD报证工作。随着公司产品研发进度的加快和资源的不断注入、公司管线日益丰富，腾辰生物吸引了一批优秀的人才加入，组建了一支能力卓越、经验丰富的研发、生产及销售团队。腾辰生物创始人，CEO杨蓉西博士表示：我们很高兴连续获得知名专业基金和投资人的认可和支持。腾辰生物拥有十余年的技术积累，具有国际领先的持续原研能力，致力于开发高效稳定低成本的癌症早筛早诊的分子标志物，以及相关的底层技术和检测体系。经过四年的成长，公司团队逐渐完善，临床数据快速积累，市场销售开始布局。未来我们将与合作方携手共进，持续推进研发和注册申报，为临床医生和患者提供优质的肿瘤早筛早诊服务和产品。树兰俊杰资本创始合伙人许迪龙表示：我们很高兴作为领投方参与腾辰生物的A轮融资。树兰俊杰医疗资本扎根产业，深耕医疗领域投资，近年来一直以务实的眼光关注肿瘤早筛早诊赛道，寻找有创业精神，有持续原研能力且最终能落地的项目。腾辰生物坚持原研十余年，积累了30余项发明专利、数千例临床数据和自有的工艺流程，从而建立了很高的技术壁垒。核酸质谱平台的应用在大幅提高数据的精密度和稳定性的同时也大大降低了成本和提高了工作效率。我们对腾辰生物的后续发展充满了期待。探针资本合伙人杨丹宁表示：腾辰生物拥有一流的IVD产品研发和落地能力，围绕核酸质谱快速布局多条产品管线，并建立自己的分子标志物阵列及自研试剂专利壁垒，在研发具有高度差异化、高精准度及特异性的IVD产品同时进一步降低检测成本、增加检测结果稳定性，更加贴近疾病早筛早诊应用场景。公司自创立起，便与国内多家知名医院展开合作，共同推进项目落地，相信未来一定会实现爆发增长。我们非常荣幸参与到腾辰生物此次的融资工作中，并期待公司在CEO的带领下进一步建立研发壁垒、完善产品管线，助力行业更好地发展。关于腾辰生物南京腾辰生物科技有限公司座落于南京市江北新区“南京生物医药谷”，是一家由留德海归博士创办、致力于开发新一代肿瘤及心脑血管等重大疾病体外早诊技术及产品的高科技生物企业。公司在疾病早诊、预后评估、疗效评估和复发监控等方面拥有领先的自主技术，并已获得多家国内一线风投机构的投资。公司已与国内多家三甲医院建立合作，积极筹建肿瘤体外诊断研发基地，进一步提升研发创新能力、丰富大数据积累和完善知识产权布局。公司创始人曾担任德国国家癌症研究中心和德国排名第一的海德堡大学医学院研究员，其研究成果于2016年获得了欧洲知名的Claudia von schilling基金会颁发的乳腺癌研究贡献奖，并在德国有丰富的创业经验并多次获奖，其创立的肿瘤体外诊断体系先后获得了德国国家经济部高科技转化大奖及欧盟创业大赛生物技术类一等奖。关于树兰俊杰资本树兰俊杰资本由树兰医疗集团早期投资人和创始团队共同发起组建，在全球范围内以临床资源服务于医学科技产业转化，通过建设科技投资基金、SATOL生命科技加速器、SATOL全球医学创新创业中心，承办世界生命科技大会、全球医学创新创业大赛，以社群服务、基金投资、科研孵化三项核心业务来推动医学临床、科研、产业一体化发展，助力医学科技人才创新创业，在数字诊疗、生物技术、创新疗法等领域投资了一批优秀的科技企业。关于探针资本探针资本成立于2017年，是一家专注医疗健康与生命科技的精品投行，旗下业务包括财务顾问、直接投资、产业咨询和创新孵化。创始团队来自业内一线私募股权投资机构、财务顾问机构、管理咨询公司和医疗垂直媒体。自成立以来，探针资本每年均完成两位数的私募融资与并购交易，累计交易金额近百亿元人民币。在企业增值服务方面，探针资本团队拥有成熟的产业经验。2020年探针新医疗基金成立，截止目前已投资十余家业内头部公司。

DNA甲基化是哺乳动物基因组中最常见的表观遗传事件之一，即DNA中核苷酸与甲基基团的共价修饰[2]。DNA甲基化与人的生命进程有着密不可分的关系。细胞的增殖与分化、染色体完整性的维护或者X染色体的活性等等都离不开DNA甲基化的控制，DNA甲基化流程在胚胎发育中是无处不在的[1]。如果DNA甲基化进程出现异常，会导致生物体出现各种各样的疾病以及身体的生长缺陷或生理紊乱。DNA与蛋白质之间的相互作用如果出现异常，会影响基因的表达，从而引起人体内肿瘤的发生或者肿瘤的转移，这一切的源头都是DNA甲基化进程出现异常的结果[3]。DNA甲基化酶是肿瘤治疗靶点DNA甲基化酶是一种修饰酶，经常与限制性内切酶一同出现。在真核生物基因组以及原核生物基因组中，普遍存在DNA甲基化酶维持以及催化DNA甲基化过程的现象。DNA甲基化酶被广泛认为是一种治疗靶点以及预测生物甲基化过程的标志物，在单细胞水平上准确灵敏地检测DNA甲基化酶对于肿瘤医学上的临床诊断以及临床治疗甚至是生物学研究有着至关重要的作用。根据甲基化的核苷酸和位置被分为三组，即腺嘌呤的甲基化、胞嘧啶的4-N甲基化和胞嘧啶的5-C甲基化。所有已知的DNA甲基化酶在其甲基化过程中以s-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体。最常见的DNA甲基化不仅发生在胞嘧啶嘧啶环5-C位置的CpG位点上，还发生在对称四核苷酸5’-G-A-T-C-3’ 中腺嘌呤环的6-N位置[4,5]。传统DNA甲基化酶检测方法有局限 DNA甲基化酶活性的高灵敏度检测在基因调控、表观遗传修饰、临床诊断和治疗等方面具有重要意义。传统用于检测DNA甲基化酶活性的方法包括高效液相色谱法(HPLC)[6], 聚合酶链反应(PCR)[7]，凝胶电泳[8]，高效毛细管电泳(HPCE)[9]，以及使用同位素标记的s-腺苷甲硫氨酸甲基化检测[10,11]。尽管这些技术在实验室实践中被证明是有用的，但它们具有局限性。例如，大多数技术不仅使用笨重昂贵的设备，而且需要复杂的样品制备和数据分析所需的大量时间。同位素标记等技术是有效的，但它们往往需要费力的样品制备、同位素标记、复杂的设备和大量的DNA，使得它们不适合在医护点使用。所以，DNA甲基化酶活性检测迫切需要简单、便携、高灵敏度和低成本的检测方法。在最近的技术进步中，许多替代的DNA甲基化酶活性测定方法，如放射法、比色法、荧光法、电化学法等已被提出。此外，其中许多与纳米材料或酶结合，以显著提高它们的敏感性。放射法、蛋白质纳米孔等新型检测技术兴起 放射法：同位素标记作为最早检测DNA甲基化酶活性的方法之一，早期广泛应用于检测DNA甲基化酶和DNA甲基化的活性[12,13]。在由DNA甲基化酶催化的甲基化过程中，同位素标记的甲基部分转移到DNA上，从而赋予甲基化的DNA放射性。这种放射性可以很方便地用闪烁计数器或放射自显像仪来检测。可惜的是，放射性试剂的介入是限制这种试验在中央实验室进行的最大缺点。对无辐射DNA甲基化酶活性检测的研究导致了甲基化特异性PCR[14]、HPCE[9]和HPLC等替代品的发展[7,14]，而甲基化特异性PCR被认为是较好的方法。尽管非放射性，上述DNA甲基化酶活性检测需要庞大且通常昂贵的设备，冗长且耗时的样品制备和数据分析，以及繁琐的检测方案，这在临床实践中也比较难以实现全覆盖。比色法：比色法用于DNA甲基化酶活性检测依赖于颜色变化的目视观察或与DNA甲基化酶相关的吸收光谱的光谱测量。它们具有成本低、简单、可移植性和在某些情况下无需仪器的优点。虽然紫外-可见光谱法可以量化DNA，但甲基化和未甲基化DNA在紫外-可见吸收特性上的低灵敏度和不显著差异基本否定了紫外-可见光谱法直接检测DNA甲基化酶活性[15~17]。金纳米粒子：金纳米粒子(AuNPs)由于其表面的等离子体共振吸收的高消光系数且强依赖于粒子间距离，在DNA甲基化酶活性检测的比色法研究中引起了广泛关注。如图1 所示，金纳米粒子表面包覆有双链DNA (ds-DNA)，其中一条链包含DNA甲基化酶识别序列和5’-硫醇末端。在DNA甲基化酶存在的情况下，如图1 B 所示，DNA甲基化酶被共价标记在ds-DNA中碱基环的6-C位置，因为在5-N位置缺乏一个质子阻止了β-消除，甲基化的DNA不能被核酸外切酶 ExoⅠ剪切，因此金纳米粒子仍然均匀地分散在溶液中 [18]。从而实现DNA甲基化酶活性的检测。结果表明，在526 nm处，金纳米粒子聚集物的吸光度与DNA甲基化酶的活性呈2 ~ 32 U / mL的线性关系，检出限为0.5 U / mL。图1. (A)基于ABP的比色生物传感器的示意图(B) DNA甲基化酶的检测机制 荧光法：荧光指吸收激发荧光团的光，以促进电子从基态到激发态，电子迅速地回到激发态的最低能级，然后当电子最终返回基态时，发出波长较长的光。与其他DNA甲基化酶活性测定法相比，荧光法检测DNA甲基化酶活性的优点是检测过程简单，灵敏度高，但其复杂的光学性能限制了其在集中实验室的应用[19~20]。图2. 基于外切酶的靶循环的DNA甲基化酶活性检测原理图电化学法：电化学生物分析技术的发展一直是现代分析化学研究的热点之一。电化学法用于DNA甲基化酶分析包括测量电流、电压、电荷和电阻等电量，以反映DNA甲基化酶的活性。与许多其他类型的DNA甲基化酶活性的检测相比，它们具有低成本、高灵敏度、执行现场监测的能力以及非常适合微型化和集成微制造技术的优点[22~23]。Zhi-Qiang Gao等人在2014年报道了一种简单、高灵敏度的DNA甲基化酶电化学活性测定方法。该方法采用电催化氧化抗坏血酸(AA)的信号放大手段，通过一个螺纹插层N,N -2(3-丙基咪唑)-1,4,5,8-萘二酰亚胺(PIND)电催化氧化还原Os(bpy)2Cl+ (PIND-Os)，包含5’-CCGG-3’ 对称序列的ds-DNA首先固定在金电极上。然后用DNA甲基化酶孵育电极，经过酶催化特定CpG二核苷酸的甲基化，然后用识别5’-CCGG-3’ 序列的限制性内切酶 Hpa II 剪切酶处理电极，从而实现DNA甲基化酶活性检测的目的[24]。图3. DNA甲基化酶活性的检测原理示意图蛋白质纳米孔：蛋白质纳米孔检测技术是在单分子水平上以低成本、无标签和高通量的方式研究生物分子的检测技术。近年来，纳米孔技术正从生物传感的角度进行研究[25]。应用于核酸特征鉴定、化学反应过程的测量、蛋白质分析、疾病相关蛋白状态的检测以及酶动力学的研究等[26]。α-溶血7素是一种蛋白质纳米孔，它自发地插入到脂质双层膜中，形成一个纳米孔[27]。当一个带电分子在外加电势下通过蛋白质纳米孔时，它会引起离子电流的瞬态变化，电流变化事件被记录下来。被分析物可以通过当前电流发生的频率进行量化，特征电流信号则可以揭示被分析物的各种特征[28~30]。该检测方法不需要对DNA探针进行任何化学修饰，既方便又节约成本，减少了样品消耗。 图4. 用于分析DNA甲基化酶活性的纳米孔试验的示意图 在过去的十几年中，DNA甲基化酶活性的检测取得了重大进展。有几种方法有希望可在临床检测，使得该方法在用于癌症诊断、预后和治疗方面显示出了希望。比色法依赖于颜色变化的目视观察或与DNA甲基化酶相关的吸收光谱的光谱测量，具有成本低、简单、可移植性和在某些情况下无需仪器的优点，但是检出限相对较高。荧光法检测DNA甲基化酶活性的检测过程简单，检出限相对理想，但其复杂的光学性能以及昂贵的仪器设备限制了其在生活中的应用。电化学法由于需要构建较复杂的反应电极材料而使得其在临床上受到了一定的限制。蛋白质纳米孔的检测方法不需要对DNA探针进行任何化学修饰，既方便又节约成本，减少了样品消耗，检出限相对较为理想，并且已经成功应用于人类血清样本。这类检测可能最终为常规DNA甲基化酶活性的检测和分子诊断打开大门，为疾病的管理和诊断带来新的前景。 作者：王家海、骆 乐 作者简介：王家海，博士，教授，硕士生导师/博士生导师，广州大学化学化工学院；分析化学专业；主要研究领域为“基于核算纳米结构为信号传导载体的纳米孔传感器”；在核酸探针和仿生纳米孔两方面开展了一系列分子识别的工作，也为将来进一步开展分析化学研究打下了坚实的基础，期间积累了多种前沿分析方法和技术：仿生纳米孔制备和检测；微纳米加工技术；核酸探针人工合成技术。参 考 文 献 [1] 陈晓娟,闫少春,邵国,等.人DNA甲基化转移酶的分类及其功能[J].包头医学院学报,2014,30(04):136-138.[2] Das PM, et al. 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