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有人用液相做过甲砜霉素残留吗?能详细地说说吗?净化是如何做的吗?检测限是多少?
甲砜霉素(Thiamphenicol,TAP)是一种广谱抗菌素,其结构类似于氯霉素,能抑制革兰氏阳性细菌、阴性细菌和一些厌氧微生物,广泛应用于水产养殖当中并且会造成残留。因此,研究和建立检测方法成了当务之急。本研究以多克隆抗体和免疫分析技术为基础,根据酶联免疫原理,建立了快速简便的水产品中的酶联免疫检测方法。另外,还建立了相应的仪器检测方法。首先通过混合酸酐法合成甲砜霉素与牛血清蛋白偶联物,构建甲砜霉素完全抗原。通过紫外扫描、SDS-聚丙烯凝胶电泳和免疫动物实验,证明了产物合成成功。通过免疫新西兰白兔,得到抗 TAP 的抗血清,抗血清效价高达 1×106。此抗血清分别经过饱和硫酸铵沉淀法、离子交换法和反向免疫亲和层析法纯化后,得到单一特异性的抗体,平均亲和常数为 7.8×10-9mol/L。以此抗体为基础,设计了间接竞争两步酶联免疫检测方法,并优化了缓冲液浓度、pH、吐温 20 浓度等参数。此酶联免疫检测试剂盒检测限为 0.06 ng/mL,血液和组织回收率为 80~110%。通过重复性、检测灵敏度、准确性等指标来评估此方法,并与气相色谱法进行了比较,结果表明,此间接竞争酶联免疫检测方法各项参数均能满足实际检测的需要。建立和优化了甲砜霉素残留的高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-质谱法(HPLC/MS)和气相色谱-质谱法(GC/MS)的检测方法。方法的回收率分别为:HPLC 为78.6~95.4%;HPLC/MS 为 72.6~99.8%;GC/MS 为 85.6~101.5%,相对偏差均小于10% ,检出限分别为:HPLC 为 8.3μg/kg;HPLC/MS 为 0.1μg/kg;GC/MS 为 0.1μg/kg。结果表明,这些方法都能满足实际检测的需要。以高效液相色谱法(HPLC)为检测方法,研究了甲砜霉素在鲈鱼血液和可食性组织里的消除规律。鲈鱼单次口服 5 mg/kg(鱼体)和 30 mg/kg(鱼体)的甲砜霉素药物后,药物在血液中的达峰时间分别为 6 小时和 8 小时,药物平均滞留时间的分别为 11.1 小时和 11.9 小时;甲砜霉素在鲈鱼血液中的经时过程符合一级吸收二项指数方程:C=10.812(e-0.087t– e-0.274t),药物在鲈鱼血液中的吸收半衰期为 1.997 h,消除半衰期为 5.589h;连续 5d 口服 15 和 30 mg/kg(鱼体)的甲砜霉素,药物的吸收速率是一个常数,它在血液中的消除速率也是一个常数,这和单次口服结果一致,其消除速率方程分别为C血液=0.849e-0.494t ;C肌肉=1.461e-0.682t,药物在鲈鱼血液和组织中的的消除半衰期分别为1.016d 和 1.403d;通过 EMEA/CVMP/036/95 所规定的统计方法计算休药期,根据 95%的忍受限和最大残留限量,确定了5d和6d分别作为服用低剂量和高剂量药物的休药期。缩写符号说明ELISA 酶联免疫吸附测定法TAP 甲砜霉素TMS 四甲基硅烷BSTFA N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺TMCS [
(一)食品中氯霉素的限量1999年9月我国农业部发布了《动物性食品中兽药最高残留限量》,规定了氯霉素在所有食品动物的可食用组织中不得检出。2002年3月被我国农业部关于发布《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》列为禁止使用的抗生素。欧盟、美国等国家规定动物源性食品中氯霉素的残留限量标准为“零容许量”,即不得检出。(二)测定氯霉素残留的方法①酶联免疫法。采用间接竞争ELISA筛选法,在酶标板微孔条上包被偶联抗原,样本中残留的氯霉素和微孑L条上包被的偶联抗原竞争抗氯霉素抗体,加入酶标二抗后,加入底物显色,样本吸光度值与其残留物氯霉素的含量成负相关,与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数,即可得出样品中氯霉素的含量。该方法测定低限为氯霉素0.05/g/kg。⑦GB/T 22338--2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定——气相色谱一质谱法和液相色谱一质谱法测定水产品、畜禽产品和畜禽副产品中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素残留量。气相色谱一质谱法是样品用乙酸乙酯提取,4%氯化钠溶液和正己烷溶液液分配净化,再经弗罗里硅土(Florisil)柱净化后,以甲苯为反应介质,用N,O-I双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺一三甲基氯硅烷(BSTFA+TMCS,99+1)于70℃硅烷化,用气相色谱/负化学电离源质谱测定,内标工作曲线法定量。该方法测定低限为氯霉素0.1/μg/kg,氟甲砜霉素和甲砜霉素0.5μg/kg。液相色谱一质谱法是针对不同动物源性食品中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素残留量,分别采用乙腈、乙酸乙酯一乙醚或乙酸乙酯提取,提取液用固相萃取柱进行净化,液相色谱一质谱/质谱仪进行测定,氯霉素采用内标法定量,氟甲砜霉素和甲砜霉素采用外标法定量。该方法对氯霉素的测定低限为0.1μg/kg;氟甲砜霉素和甲砜霉素为O.1/μg/kg。