扩增过程

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  • 游离DNA样本保存管，国盛医学IPA（RPA）恒温扩增整体解决方案
    可冻干的分子酶和预混液新冠疫情使得“核酸检测”家喻户晓，PCR检测作为金标准承担了无限重任。然而由于PCR是变温过程，对实验环境、仪器设备等有严格要求，具有一定的局限性，偏远地区、县级医院开展核酸检测非常不方便。恒温扩增技术由于其扩增期间反应条件温和、不需要特殊的仪器设备，能真正意义上实现分子POCT而更受瞩目。什么是IPA（RPA）？IPA（RPA）技术是在常温恒温条件下聚合酶介导的核酸快速扩增技术，在恒温条件下（39-42℃），特异性引物与重组酶形成的复合物结合DNA并沿着DNA链寻找引物的结合位点，完成定位后发生链交换反应并打开DNA双链间的氢键，单链结合蛋白（SSB）与单链DNA结合，阻止形成双链，之后DNA聚合酶从发生链交换的位置进行快速核酸扩增反应。图片来源于网络国盛医学IPA（RPA）技术优势国盛医学开发的性能领先的核酸快速扩增技术IPA（Isothermal Polymerase Amplification）可提供恒温扩增的整体解决方案，包含各类预混液试剂产品方案及完备的分子酶精制原料，助力新一代精准分子诊断快检方案的研发。
    供应商： 广东国盛医学科技有限公司
    品牌： 国盛医学
    价格： 面议
  • 游离DNA样本保存管品牌：国盛医学 DNA恒温扩增试剂盒（荧光款）
    存储条件：-25~-15℃下避光储存有效期：12 个月产品规格：液体：50测试/盒 100测试/盒 冻干：50测试/盒 100测试/盒 描述：本试剂盒是基于IPA技术（Isothermal Polymerase Amplification）开发的恒温核酸实时荧光扩增检测试剂，在恒温条件下(39-42℃)能扩增出目的DNA产物，当THF修饰的探针和目的DNA产物结合后，试剂中的Exonuclease III识别位点，切除THF残基导致荧光基团与淬灭基团分离发出荧光信号，可用荧光PCR仪获得实时荧光曲线。相比于普通PCR需要2-3小时，实时荧光PCR的1.5-2小时，而荧光恒温扩增仪只需要20 min，能够现场检测快速出具报告，极大缩短了检测时间。 产品特点：扩增快速：只需在39-42℃条件下恒温孵育15-30 min即可扩增至可检出水平；灵敏度高：可检测样本中少量的DNA，检测限可达到100copies/test；特异性强：可从含有多个不相关的复合基因组DNA的样本中识别并扩增单个DNA分子，抗干扰能力强；操作简便：操作方便，步骤简单，可适用于各种品牌的荧光定量 PCR 仪、恒温荧光扩增仪器等荧光检测设备；稳定性高：可定制冻干产品形态，常温运输，可在-20℃下保存一年。 产品应用：IPA等温扩增 公司介绍广东国盛医学科技有限公司（简称“国盛医学”）自2016年在广州成立以来, 始终秉承“健康才有国盛”的理念，聚焦精准医学领域，致力于成为体外诊断万亿市场中占66%份额的免疫和感染领域的精准诊断。目前，国盛医学具备原料(蛋白酶克隆纯化)、试剂盒、诊断耗材, 分子诊断仪器的自主研发、生产能力和分子诊断服务能力，是国内体外诊断领域中极少数的一家形成了研发-生产-服务。此外，国盛医学所下辖的国盛医学检验所是专注于分子诊断的第三方独立医学检验实验室，具备国家颁发的《医疗机构执业许可证》，同时已通过《临床基因扩增实验室》的准入验收，检测诊断业务涵盖免疫炎症、感染、肿瘤和生殖健康四大板块，服务内容有疾病风险评估、早期筛查、诊断、个体化治疗、复发监控，预后评估的全过程，为客户提供一站式检测服务。
    供应商： 广东国盛医学科技有限公司
    品牌： 国盛医学
    价格： 面议
  • ddPCR 通用扩增试剂
    ddPCR 通用扩增试剂专门针对微液滴数字PCR扩增体系特点而开发，采用了特异修饰的热启动DNA聚合酶，配合精心优化的稳定剂，使微液滴更稳定，扩增效率更高，重复性更好。经过优化使荧光信号的释放达到最佳效果，使扩增信号更强，检测更灵敏。适用于采用探针法或染料法对DNA进行数字PCR定量检测，适用于新羿数字PCR系统和其他数字PCR系统。产品为预混试剂形式，反应液配制时，只需加入模板、引物、探针、灭菌蒸馏水便可进行ddPCR反应，操作简单方便。可对单分子模板进行准确定量检测。
    供应商： 新羿生物（TargetingOne）
    品牌： 新羿
    价格： 0
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扩增过程相关的仪器

  • QIAamplifier 96 PCR扩增仪 400-873-7896
    PCR实验已然成为生物实验室的日常，坚固耐用和低噪音排放才能成为实验室的永恒。结合QIAGEN在PCR试剂领域多年的精耕细作，最新上市的QIAamplifier 96助您找到PCR实验成功的捷径，带您享受QIAamplifier与AllTaq PCR Kits 联手获得一击即中的实验结果。QIAamplifier 96——为性能而生 简单易用：直观的软件和7 英寸彩色触摸屏 快速升降温：快达4℃/秒的升降温速率 快速扩增：45分钟内完成30个循环 高性能智能热盖：压力控制确保高可重复的结果 轻声细语：低于45分贝的噪音排放 线性梯度功能：20–99℃线性范围（高达20℃梯度及最小0.1℃精准调控）AllTaq PCR Kits——一种试剂涵盖所有扩增需求AllTaq PCR 是经反复优化的可超快速扩增的PCR反应试剂盒，45分钟内即可完成30个循环。试剂盒中含有小分子锁扣保护的热启动酶，提供了超高的特异性和卓越室温稳定性。使用过程无需优化反应条件，不同目标片段，不同模板含量，不同GC含量，可用同一退火温度，同一实验流程进行扩增。还能实现9kb的长片段扩增和双重扩增，结合超高灵敏度及可视化移液监测染料全方位助力实验成功。
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    厂商： 凯杰企业管理（上海）有限公司
    品牌： QIAGEN
    型号： 9002991
    价格： 7万 - 10万元
  • 自动基因扩增仪 400-860-8560
    无人值守 您的PCR实验自动完成 自动基因扩增仪 Biometra TRobot II 可与自动化平台整合来实现无人值守的全自动工作流程， 适用于96孔和384孔的样品通量，运行快速、温控精准、运行稳定，三面的开盖方式可匹配各种机械臂实现样品板的轻松取放，加密的数据传输能确保数据的完整性，提供多级用户权限管理，具有断电自动重启、自检等功能，在高通量NGS、大规模群体研究、疾病的全基因组关联研究、高通量分子标记筛选、药物筛选等方面都有很好的应用。 精准温控 温控精准：秉承耶拿公司三十多年的 PCR 研发制造经验，采用先进的Peltier 帕尔贴半导体温控技术，具有超高的温度准确性和均一性，提供快速高效、可靠稳定的 PCR 扩增速度快：运行速度快，不仅节省实验时间，还可提高扩增产物的特异性 型号齐全：有常规通量 96 孔和高通量 384 孔样品槽可选，有快速镀金银槽和常规铝合金槽可选 平整易清洁：样品槽四周平整光滑，无沟槽，极易清洁，不易积灰智能热盖 由于自动化 PCR 仪需要与机械臂配合来实现自动取放样品板，而与人相比，机械臂的灵活性会稍逊一筹，因此与普通 PCR 仪相比，如何保证机械臂能方便安全地取放样品板，是考察自动化 PCR 仪好坏的很重要的方面。 自动开盖：设计合理巧妙的弧形向上开盖方式，可轻松且安全地自动打开和关闭 PCR 热盖 三面开放：热盖打开后，形成完全敞开的空间，显露出完整的样品槽，既可以从仪器正面取放样品板，也可以从仪器左右两个侧面取放样品板，实现和市面上各类自动机械臂的完美兼容使用，方便整合进整个自动化平台 防止蒸发：热盖温度达到设定温度后，模块才会升温，确保样品管上方温度始终高于样品温度。热盖垂直向下施压，整板受力均匀，根据 PCR 板的高低不同可精细调节热盖接触压力，不仅有效防止样品蒸发，还为用户选择 PCR 板提供很大的开放性和灵活性，对耗材没有限制 安全制动：热盖带有安全感应框，碰到阻力会自行中断关盖程序，防止意外发生 经久耐用：无磨损的开关盖方式延长仪器使用寿命，并有助于整个自动化系统的稳定运行兼容多种自动化系统 耶拿公司不仅具有三十多年的 PCR 开发生产历史，还拥有三十多年的自动化工作站研制经验，在自动化系统设计和整合方面提供专业的产品和服务。 安全取板：经过数十轮的 PCR 循环和热盖高压后，样品板往往会紧密贴合在样品槽中，如果机械臂直接去取板，很难轻易取出。耶拿的自动 PCR 仪，设计了专利性的样品板自动抬离装置，取板前可自动将 PCR 板轻缓平稳地抬离样品槽，方便机械臂抓取 PCR 板并将其移出PCR 仪，避免卡板等意外的发生 兼容性好：基于合理的三面开放的开盖方式，智能安全的取板设计，以及低矮的仪器高度，占地面积小，能很好地与各种自动化机器臂配合使用，搭建成全自动 PCR 平台 适用性强：可通过耶拿公司提供的标配软件 TSuite 来独立控制 PCR 仪的自动运行，也可通过预置的驱动来兼容其他的自动化平台TSuite 软件提供自动 PCR 仪的全面功能，如创建程序、控制仪器运行、生成仪器运行状态和操作步骤的详细文档等。加密的数据传输能确保数据的完整性，提供三级用户权限管理功能，符合 GMP 规范各种运行和维修日志文件符合 GMP的法规要求，在发生故障时，日志文件还有助于快速排查故障原因仪器可独立运行，因此可通过 TSuite 软件预先优化好 PCR 程序，再整合入自动化系统，简化实验优化过程PCR 仪上带有仪器运行指示灯，可通过灯的颜色和状态来直观便捷地了解仪器的状态，无需再去查看软件界面，非常方便 耗材开放：可使用全裙边或半裙边的 PCR 板，可使用高缘板或低缘板，可使用封膜、硅胶垫或者塑料盖
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    厂商： 耶拿分析仪器（北京）有限公司
    品牌： 耶拿/JENA
    型号： Biometra TRobot II
    价格： 面议
  • TAdvanced 96 基因扩增仪 400-860-8560
    高效的热模块：高品质合金样品槽，表面有金色合金涂层，耐腐蚀，通过独特的设计和电子控制技术，实现银质样品槽才能达到的高效传热效果和快速的升降温速率，节省PCR扩增时间 精准的温度控制：通过智能的温度控制系统RAC实现快速的升降温变化、优异的温度准确性和均一性，以及高度的重复性，实际温度与设定温度相比，没有温度过冲或下冲的现象，以获得最佳的扩增效果 温度梯度功能：对于新的模板或引物，可非常方便获得最佳的退火温度（TAdvanced 96 G） 线性温度梯度工具(LGT)：实现准确的温度梯度设置和控制，极大地方便了PCR反应条件尤其是退火温度的优化（TAdvanced 96 G） 高性能智能热盖 (HPSL)：深凹的热盖设计可有效地将热量控制在热盖内，防蒸发效果极佳，升温快速，提供持续稳定的温度和压力控制，结实耐用，热盖打开后会自动停留在最适位置，方便样品的取放 多功能：具有专门的恒温孵育功能模块，设置模块温度、热盖温度和孵育时间，即可作为金属孵育器使用，耐用性强 静音技术 (WQT)：运行时非常安静，无噪声，运行时最大声音不超过 45 dB，为您提供舒适的工作环境 巧妙的散热设计：通过仪器后部和底部进行高效散热，仪器旁边可放置其他仪器，节省实验室空间 先进的用户管理系统 (AUM)：灵活的多层级用户管理系统，每个用户都可设定不同的个性化的使用权限 用户特异性的快速启动：通过程序预览和快速启动功能，无需繁琐的查找搜索，用户即可快速启动各自曾使用过的程序 仪器自检功能：系统可进行自动的检测诊断，自动记录仪器使用过程中的状态，提供各种运行和故障信息 舒适：超大的7英寸彩色触摸屏，水晶屏幕，高清显示，反应灵敏，符合人体工程学的设计，无反光，操作直观方便型号TAdvanced 96TAdvanced 96 G样品通量96 x 0.2ml PCR管，96孔板，12 x 8联管热模块材质高品质合金槽，表面有的金色合金涂层，耐腐蚀最大升温速率6.0℃/s平均升温速率5.5℃/s温度梯度模式--12列不同温度梯度控制温度梯度跨度--最大30℃，最小0.1℃温度梯度设置范围--20-99℃温度均一性±0.2℃温度准确性±0.1℃模块温度设置范围3-99℃热盖温度设置范围30-110℃热盖深凹设计的高性能智能热盖（HPSL），防蒸发效果明显好于普通热盖，提供持续稳定的温度和压力控制软件用户特异性的程序快速启动功能：每个用户可快速启动自己最近使用过的5个程序程序运行显示方式可在表格式和图形式之间方便切换--线性温度梯度工具（LGT）具有仪器自检功能，自动生成维修信息日志文件（SINF）具有断电自动重启功能仪器升降温速率可以调节可查看温度梯度图表可通过网络接口连接电脑进行软件升级三个层级的用户管理权限设置程序存储能力可设立30个用户管理账户，可存储350个PCR程序显示屏超大的7英寸彩色触摸屏，水晶屏幕，无反光静音技术超静音运行，最大运行声音不超过45dB接口USB接口，网络接口仪器常规指标重量15kg，尺寸277 x 264 x 457mm（W x H x D），工作功率850 Watt
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    厂商： 耶拿分析仪器（北京）有限公司
    品牌： 耶拿/JENA
    型号： TAdvanced 96
    价格： 面议
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  • 【资料】PCR扩增过程中常见的问题及解决方法

    PCR技术具有高度的特异性、选择性、灵敏性，而且快速、简便、易于自动化，因此在临床医学工作中受到广泛的重视及合理的应用。目前在我国许多基层医疗单位均已相继开展PCR研究用应用工作。PCR技术很简单，原理也很清楚，因此有条件的单位都能较顺利地上马，但毕竟PCR技术是一种新生事物，受到许多条件因素的影响，所以要做得好也不容易。在PCR技术应用过程中会遇到这样或那样的问题，更甚至会得到与事实完成相反的结果。为了使我们能够顺利地开展PCR工作，更好地发挥PCR技术的工具作用，我们根据多年来PCR工作总结的经验，对PCR扩增过程中经常出现的一些问题进行简要的总结，提供给广大科研工作者作为参考，抛砖引玉，不足之处欢迎指正。 一、 假阳性扩增 在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性，而且扩增产物电泳条带亮度均一，这是扩增系统受到污染时最典型的一种表现，需仔细检查，排除污染源，一般应从以下步骤着手： ⒈ 试剂污染： 厂方提供的试剂或其中的某种组分在出厂或运输、贮存过程中受到污染。检测方法，可按试剂盒说明书将试剂分装好，直接置于PCR仪中扩增（不加阴性对照，可加适量蒸馏水），便可简单而有效地判断试剂是否已受到污染。 ⒉ 实验室污染： 这是最常见的污染源，由于PCR技术可以在几个小时内将模板中某些特异性序列扩增到数百万倍以上，扩弗产物可能在电泳等过程中污染[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]、操作台或随着蒸发所形成气溶胶而污染整个实验室。扩增产物又是最有效的模板，一旦出现产物污染其污染程度都较严重。判断方法：可以将实验中最关键步骤如试剂分装、样品处理等转移到一个新的环境中或转移到超净工作台中完成。当然，所用的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]、吸咀管（离心管）都应彻底更换。解决方法：实验室污染是PCR扩增过程中最易出现的现象，而且一旦出现污染，消除污染源又极其困难，往往需对整个实验室及实验器材彻底清洗处理，所以应该以预防为主，实验过程中严格遵守实验基本要求，样品处理与扩增产物及电泳应尽量分开，最好能在两个房间进行。扩增前处理所用的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]及扩增后点样用的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]应严格地分开，不可互换。PCR室应保持良好的通风、清洁、最好能专用。 ⒊ 采样污染： 在实验过程中，有时会出现一批结果阳性率很高，一批结果阳性率又下降很多，如此反复，这种现象大都是由于采样时污染所致，一般来讲正规试剂生产厂家，其试剂出厂时都要经过严格的质量检测、批间，特别是批内差异都极小，不致出现如此明显的反复，这种现象主要是由于收集样本的试管或吸管受到污染所致。PCR扩增非常敏感，而一般实验室对重复使用的试管所进行的洗涤方法往注不能去除痕量DNA，这些痕量DNA便成为PCR模板，出现阳性扩增结果，由于采样试管受污染程度不一，所以出现忽高忽低的现象解决方法建议使用一次试管及吸咀取样。 二、 假阴性扩增： 如果连续几次扩增结果都是阴性，或已知阳性样本出现阴性扩增结果，一般认为这是假阴性，出现这现象有以下几种原因： ⒈ 仪器故障： 出现全阴结果，首先考虑到仪器运转是否正常。正确判断仪器的工作状况，是排除假阴性其它原因的基础，仪器运转是否正常是PCR扩增最关键的步聚之一。判断仪器是否正常，首先要测定加热体的温度是否准确，波动范围是否答合要求，各孔之间差异是否符合要求，PCR扩增往往对仪器加热温度及各管间的差异要求有很高的精度，如果误差太大，势必出现假阴性。必须注意的是不能过信名牌，我们经常发现一些名牌机器温度差异高达二度以上。 ⒉ 试剂失效或无效： 了解机器是否正常，便可对试剂进行检测。首先要了解试剂是否超过有效期，试存放方法是否达到要求，如果试剂盒在有效期内，贮存方法是正确，那么就应该仔细、慎重地判断试剂是否是无效试剂或称不合格试剂。可以用已知阳性样本，或试剂盒提供的阳性对照，严格按说明书操作扩增一次，然后把扩增产物用双蒸水稀释1000倍，作为模板进行第二次扩增，判断结果，如果是阴性说明试剂无效或不合格，如果结果阳性那么可用以下方法判定试剂的灵敏度。

  • PCR基因扩增仪的工作原理

    什么是PCR技术？ PCR（Polymerase Chain Reaction）技术，中文译为聚合酶链式反应，是一种在体外（试管、切片…）扩增核酸的技术。PCR的基本反应包括以DNA为模板的反应和以mRNA为模板的反应。 PCR技术是模拟体内天然DNA（脱氧核糖核酸）的复制过程。以扩增DNA为例，其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。

  • 【参数解读总结篇】基因扩增仪(PCR)的技术参数解读与使用

    【参数解读总结篇】基因扩增仪(PCR)的技术参数解读与使用

    【参数解读】基因扩增仪(PCR)的技术参数解读与使用PCR技术的基本原理PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。请您来解析：1、普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪四类仪器有何异同？http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/02/201502251536_536341_1608710_3.png2、我们应该如何根据检测需求来选购PCR的四类仪器？根据检测的定量要求来选择仪器类型。3、PCR的核心参数都有哪些？核心参数是温度控制。4、梯度PCR仪可以分离不同DNA的片段吗？与普通PCR的异同在哪？梯度PCR可以分离不同DNA片段,与普通PCR仪不同的地方在于。可以设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样可节省试验时间、提高实验效率，又节约实验成本。5、使用过程中常见的问题PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污 染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生. 一、污染原因 (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于 密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染. (二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染. (三)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物 污染，就可造成假阳就可形成假阳性. 还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样 枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题. (四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的 检验室，这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化 过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简 便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大. 二、污染的监测 一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施，防止和消除污染. 对照试验 1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性 对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳 性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳 性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳 定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照. 2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂 对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染. 3.重复性试验 4.选择不同区域的引物进行PCR扩增 三、防止污染的方法 (一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定 等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开. 最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区. 其实验用品及吸样枪应专用.实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA. (二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题.由于操作时不慎将样品或模板核酸吸 入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸 样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染. (三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先 配制好，然后小量分装，-20℃保存.以减少重复加样次数，避免污染机会.另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一 冰箱. (四)防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用. (五)设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病 原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照 及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照. (六)减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止. (七)选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前 应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要轻，以防管内液体溅出. 常见问题分析与对策 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低，可致

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  • qPCR扩增曲线的自述
    大家好！首先跟大家做一个自我介绍：我是扩增曲线，来自荧光定量PCR，是用于描述qPCR动态进程的曲线，我有两种形态，一种是线性图谱：横坐标是循环数，纵坐标是荧光强度值；另一种是对数图谱：横坐标是循环数，纵坐标是荧光强度值的对数。大家根据我来确定Cq值，最终确定初始模板的含量。新冠疫情以来，我可是发挥了重要的作用，诊断技术的金标准，骄傲的很呢。在引物、模板、缓冲液、酶等都充足的理想状态下，PCR扩增产物理论上是呈2的倍数增长的，所以我应该是长这个样子的：▲ 图1. 理论的扩增曲线线性图谱但是呢，理想很美好，现实却很骨感，随着PCR循环数的增加，DNA聚合酶的失活、dNTP和引物的枯竭等诸多因素影响了PCR扩增效率，实际的我是长这样的：▲ 图2. 实际的扩增曲线线性图谱不过S型的曲线，曼妙的身材，我还是很满意的。大家也根据我将PCR进程分为4个时期，分别为基线期，指数增长期，线性增长期和平台期。我的特征还是很明显的：基线期平整；指数期起峰，陡度较大；线性期慢慢趋于平整；平台期基本平整。▲ 图3. 扩增曲线的各个时期如果大家在每次实验中都能遇到如此美丽的我，那就是“你好我好大家好”的欢快场景了。但是在实验过程中，大家可能会看到各种奇形怪状的我，分析不出原因，导致实验止步不前，因此茶饭不思，郁郁寡欢。其实主要还是大家对我不太了解。我，作为大家的科研小助手，单纯善良，心思简单，没有那么多套路的。之所以出现奇奇怪怪的我，都是有原因的。接下来可都是满满的干货吆！笔记要做起来了吆！一． 没有Cq值出现1. 反应循环数不够：一般设定在35个循环以上，也可根据实验情况增加循环数。2. 引物/探针设计不当或发生降解：优化引物/探针的设计；或通过PAGE电泳检测其完整性。3. 模板浓度低或降解导致：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；同时样品制备时尽量避免引入杂质和反复冻融。二．Cq值偏大1. 模板浓度低：建议提高样本的上样量。2. 扩增效率低：反应条件不适宜或引物探针设计不当，建议通过绘制标准曲线确认扩增效率，同时对反应条件和引物探针设计进行优化。3. PCR产物太长：一般采用80-150bp的产物长度。如果扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或优化引物。4. 反应体系中可能有PCR反应抑制物：建议将模板梯度稀释后加入反应体系，或者重新制备纯度更高的模板。三．扩增曲线末尾起跳，但没有完整扩增1. 可能存在污染：建议对样本进行复检。2. 如果是阴性对照，可能是引物二聚体或污染导致；如果是正常样本，说明浓度过低或者加样量不足。四．复孔重复性差1. 加样误差导致：定期校准移液器；同时可先配制除模板以外的其他试剂的预混液，然后进行分装再加入模板，其次加大模板上样体积，以上均可降低移液误差的影响。2. 模板浓度越低，重复性越差。建议提高模板量，使Ct值在15-30之间。现在大家对我的了解是不是又多了一些呢？是不是对qPCR实验又充满了信心呢？那就赶紧行动起来吧！Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统，没有他就没有我那么多标致的图片，快快申请试用，感受它的魅力呀！▲ 图4. Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统申请试用我们的仪器可以申请试用哦！关注“深蓝云生物科技”公众号，点击“云活动”→“试用中心”即可。图源：部分来源于网络，侵删
    时间： 2021-12-01
    作者： 艾普拜生物
  • PCR扩增得率低或者无扩增？一篇干货解决所有问题
    PCR实验时，我们有时候会遇到目的基因得率低，或者根本扩不出来的情况，不管是PCR的实验王zhe，还是初级实验小白，都需要逐个排查问题，那么我们需要考虑哪些因素呢？今天这一篇干货，帮您彻底解决问题。首先考虑的问题，是不是DNA模板的问题呢？ 如果模板质量太差？那么检查DNA模板的纯度和完整度，保证你的模板中不含有PCR抑制剂。在分离DNA时，尽量减少对DNA的切断或切刻。如有需要，可通过凝胶电泳检测模板DNA完整性。将DNA保存于分子级别的水或TE缓冲液 （pH 8.0）中，防止被核酸酶降解。 如果是模板浓度太低？建议使用DNA纯化试剂盒分离模板DNA时，应严格遵循试剂盒生产商的建议。查阅用户手册和疑难问题指南，改善较低的DNA质量。如果采用化学或酶促DNA纯化方案，应确保无PCR抑制剂残留，如苯酚、EDTA和蛋白酶K。使用70%乙醇再纯化或沉淀和洗涤DNA，去除可能会抑制DNA聚合酶的残留盐分或离子（如， K+, Na+等）。选择具有高合成能力的DNA聚合酶，这类聚合酶对土壤、血液和植物组织携带的常见PCR抑制剂具有较好的耐受性。 如果是DNA模板量不足？建议检查 DNA起始量 ，如有需要适当增加起始量。 选择具有高灵敏度 的DNA聚合酶用于扩增。适当增加PCR循环数。 如果需要扩增的目的片段比较复杂（如，高GC含量或含二级结构）？、建议选择具有相应的扩增试剂盒，比如适合高GC含量片段的PCR试剂盒。或者选择具有高合成能力的DNA聚合酶，这类酶对DNA模板的亲和力较高，geng适合扩增困难靶标。 使用 PCR添加剂或辅助溶剂 ，促进富含GC的DNA和具有二级结构的序列变性。增加 变性时间或温度 ，从而高效解离双链DNA模板。 如果目的片段太长？建议直接使用长片段设计的PCR试剂盒，或者确认所选DNA聚合酶的长片段扩增能力。使用专为 长片段PCR设计的DNA聚合酶。选择具有高合成能力的DNA聚合酶，这类酶能够在短时间内扩增长片段。降低退火和延伸温度，促进引物结合和提高酶热稳定性。根据扩增子长度，增加延伸时间。或者是引物的问题？ 考虑引物浓度是不是不是最you的？建议预实验优化引物浓度（范围通常为0.1–1 μM）。对于长片段PCR和使用简并引物的PCR，最小起始浓度为 0.5μM。 引物设计有问题？可以使用多种引物设计软件比如Primer Premier等，或者使用在线 引物设计工具 。确保引物针对目的片段具有特异性。 确认引物与正确的目标DNA链互补。也许是其他试剂的问题？ MgCl2 浓度太低？镁离子（Mg2+）作为DNA聚合酶活性的辅助因子，有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键。此外， Mg2+ 能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷，从而促进引物与DNA模板形成复合物。在PCR中，标准的 Mg2+ 终浓度范围为1–4 mM，建议优化滴定增量为0.5 mM。 Mg2+ 浓度过低会降低聚合酶活性，导致PCR产物较少或无PCR产物。另一方面， Mg2+ 浓度过高则会提高引物-模板复合物的稳定性，产生非特异性PCR产物，并增加由dNTP错误插入导致的复制错误。还有可能是PCR循环设置不理想呢？ 变性效果不理想？建议优化DN变性时间和温度。变性时间短、温度低可能无法获得良好的双链DNA模板解离效果。相反，变性时间长、温度高可能会降低酶活性。 退火效果不理想？尽量使用 梯度热循环仪 ，以1–2°C增量逐步优化退火温度。最jia退火温度通常比最低引物Tm低 3–5°C。当使用 PCR 添加剂或辅助溶剂 时，应调整退火温度。使用指定DNA聚合酶在其最jia缓冲液中的 推荐退火温度 。DNA聚合酶不同，则引物对的退火温度也不同。 延伸效果不理想？选择适合于扩增子长度的延伸时间。在扩增长片段（如，10 kb）时，降低延伸温度（如，降至68°C）可保持酶活性。使用具有 高合成能力 的DNA聚合酶，在较短的延伸时间内也能实现 稳定的扩增 。 PCR循环数不合适？调整循环数（通常为23-35个循环），以获得合适的PCR产物得率。如果DNA起始量低于10拷贝，则将循环数增加至40。
    时间： 2020-06-09
    作者： 上海远慕生物科技有限公司
  • 基因扩增仪 —— 小小身体，大大本领
    基因扩增仪 —— 小小身体，大大本领 别看它的样子小，其实本领真不少，明明可以靠颜值，偏偏选择拼“才华”，这位集“美貌”与“才华”于一体的成员就是我们的pc-96p梯度pcr仪。pc-96p 基因扩增仪是新一代快速实用的热循环仪，采用新一代半导体芯片技术，控温性能好，循环次数可达 100 万次以上，将定性 pcr产品的功能优化，强大的功能将满足更高要求的实验需求。便捷的软件操作ü 1024 x 768 像素高清8寸彩屏，程序显示、设置，一目了然，可轻松编辑、运行、保存程序ü 用户管理界面，可以注册独立账号，设置密码保护，方便保存实验程序ü 梯度计算器，为梯度pcr提供温度计算功能，省时省力ü block模式显示金属模块的温度变化，tube模式能模拟试管内试剂的温度变化ü 升级功能，软件扩展性强，可免费升级，满足未来实验技术发展需求 精确的温度控制ü 先进的半导体制冷技术和独特的 pid 温控技术，控温精度高、升降温速率快，温度均匀性更佳，减少样品台边缘效应ü 新一代半导体芯片技术，最快变温速率可达 5℃ /secü 6 个温区设计，精度优于传统梯度ü 拥有30℃的宽限梯度功能，满足苛刻的实验需求 三种运行功能ü 温度递增/递减范围设置为-9.9℃ ~ 9.9℃，满足touchdown实验需求ü 时间递增/递减范围设置为-599 s ~ 599 s，满足long pcr实验需求ü 梯度温度设置范围为 30℃~99.9℃，梯度可设置到30℃，满足梯度pcr实验 贴心的操作系统ü 热盖升温过程中，模块可保持在低温，提高扩增特异性ü 自动断电保护，恢复供电后自动执行未完成循环，保证扩增全过程安全运行ü 设定的程序支持机器内存和usb外存，也可通过usb导入程序 性能参数
    时间： 2022-07-22
    作者： yooning
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