泰勒菌素残留

伊维菌素的危害及检测目的阿维菌素类药物（Avermectins，AVMs）由链霉菌的发酵产物中分离的大环内酯类抗生素，包括伊维菌素、多拉菌素、阿维菌素、爱普菌素等品种。阿维菌素类药物是目前兽医临床上应用广泛的兽用驱虫药，被广泛应用于牛、羊等动物，其作用机理是干扰害虫神经生理活动，致使害虫出现麻痹而中毒死亡。阿维菌素类药物虽然作用剂量小，但其脂溶性较高，残留时间长，世界卫生组织将其列为高毒化合物。该类药物的不规范使用和食物链富集，易引发运动失调、呼吸缓慢、中枢神经系统中毒等症状，甚至致人死亡，对人类健康造成严重威胁，所以应对动物性食品中阿维菌素类药物含量进行监测。我国农业农村部和国家市场监督管理总局2019年发布的GB 31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最 大残留限量》中明确规定了伊维菌素、多拉菌素、阿维菌素、乙酰氨基阿维菌素在动物靶组织中的残留限量。本文阐述了如何将伊维菌素从样品基质中分离提取出来，并经过净化后，转化成液相色谱-串联质谱仪可以检测的形式。以提取、净化为重点，依据国标GB/T 22953-2008，为检测人员和相关领域研究人员提供一定的参考。检测项目：伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿维菌素应用范围：河豚鱼肌肉、鳗鱼肌肉、烤鳗高效液相色谱法方法原理：河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中残留的伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残留用乙腈提取后，正己烷脱脂，中性氧化铝柱净化。样品溶液供液相色谱-串联质谱仪检测，外标峰面积法定量。前处理仪器：分析天平（感量0.1 mg和0.01 g）；组织捣碎机；匀浆机（8000 r/min）；离心机（4000 r/min）；超声波水浴；液体混匀器；固相萃取装置；氮吹仪。 检测仪器： HPLC-MS/MS+ESI源试样的制备与保存取样品约500 g用组织捣碎机捣碎，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记，于零下18 ℃冰箱中保存。制样操作过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化。 前处理方法1.提取准确称取2 g组织样品（准确至0.01 g）至50 mL离心管中，加入8 mL乙腈，匀浆机上8000 r/min均质20 s，4000 r/min离心5 min，上清液转移至50 mL离心管中；另取一50 mL离心管加入8 mL乙腈，洗涤匀浆刀头10 s，洗涤液移入前一离心管中，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，液体混匀器上振荡30 s，4000 r/min离心5 min，上清液合并至50 mL离心管，离心管中的沉淀再加入6 mL乙腈，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，液体混匀器上振荡30 s，4000 r/min离心5 min，上清液合并至50 mL离心管中，乙腈定容至25.0 mL刻度，混匀备用。2.净化向上述装有样品提取液的50 mL离心管中加入10 mL乙腈饱和的正己烷脱脂，涡旋振荡1 min，4000 r/min离心5 min，弃去上层正己烷，重复此操作一次，下层乙腈溶液待用。将中性氧化铝净化柱安置在固相萃取装置上，准确移取10.0 mL已脱脂的样品提取液至中性氧化铝净化柱中，控制流速在1 mL /min～2 mL /min，用2 mL×2乙腈淋洗净化柱，收集全部流出液，流出液转移至吹氮管中，50 ℃下氮气吹至干，用1.00 mL乙腈溶解残渣，并置超声波水浴中超声振荡10 min，0.2 μm滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。 国标解读及注意事项1.标准物质用乙腈配成100 μg/mL的标准储备液，在零下18 ℃保存。2.本方法通过乙腈提取，正己烷脱脂，中性氧化铝柱净化的方式进行目标化合物的提取净化。3.本方法采用洗涤均质刀头，三次提取的方式，提高目标化合物的回收率。4.氧化铝柱净化过程中除了活化溶液，其余溶液（上样液和淋洗液）都要收集。为保证净化效果，过柱时需要控制流速，使溶液一滴一滴地流下。可用商品化的中性氧化铝固相萃取柱替代方法中手工填充的中性氧化铝净化柱。5.由于该类化合物没有对应的同位素内标用于回收率的校正，所以本方法使用空白样品提取液配制基质标准工作液，进行定量。 参考文献GB/T 22953-2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法河豚鱼、鳗鱼中伊维菌素残留量测定的前处理流程图:

欧盟食品安全局审查多杀菌素的最大残留限量 据欧盟食品安全局(EFSA)消息，近日欧盟食品安全局对多杀菌素(spinosad)的最大残留限量(MRL)进行审查后，对该农药在部分产品中的最大残留限量提出了修订意见。 更多请见：http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/doc/2630.pdf

【科捷仪器】大环内酯类与氯霉素类药物是两类应用广泛的广普抗生素，由于这两类抗生素能够有效预防和治疗家畜传染病和寄生虫病的发生，有些还具有促进动物生长发育的功用。因此，为了降低养殖成本，提高经济效益，在家畜养殖中广为使用。但是，近年来由于在禽畜养殖过程中过量使用抗生素又不遵守休药期的规定，在牛羊肉、猪肉以及鸡鸭鱼肉中检测出了各种抗生素。这种残留可以通过食物链进入人体，进而对人体造成各种危害。红霉素、泰乐菌素等大环内酯类可致肝损害和听觉障碍。更严重的是长期大量滥用广谱抗生素会导致肠道微生物菌群被抑制，使人体产生抗药性，这种抗药性导致人类感染疾病之后治疗难度加大，治疗成本升高。　　为了保障人类的生命健康，世界各国卫生组织以及食品药品监督管理部门都已经将肉食品中各种抗生素残留量作了严格规定，并且以抗生素在肉食品中的残留量作为产品进口的贸易壁垒，如美国和欧盟对阿维菌素在肉食品中的最高残留限量为25ug/kg，泰勒菌素为100ug/kg，替米考星为100ug/kg，伊维菌素为40ug/kg。目前肉食品中大环内酯类抗生素常用液一质联用进行全面分析。氯霉素类药物常用气相色谱及液相色谱分析。而用高效液相色谱法同时分析肉食品中两类常见抗生素还未见文献报道。　　一、LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪配置LC-10Tvp高压恒流泵：2台SPD-10Tvp紫外检测器：1台 SCL-10Tvp 系统控制器：1台7725i手动进样阀： 1套 色谱工作站：1套 （VI2010、N2000、N3000选用）液相色谱柱：1支 （C18 4.6*250mn,5um）微量进样器：1支 （50ul/100ul） 进样支架 ：1只 （进样阀用）　　二、LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪特点　　LC-10Tvp梯度高效液相色谱仪是南京科捷分析仪器有限公司为了快速地满足多样化的客户需求，在原有的STI501液相色谱仪的基础上经过优化，利用美国先进技术开发设计，国内加工生产的的一款新型的液相色谱仪。LC-10Tvp等度高效液相色谱仪实现了人机对话，可实时对仪器的运行状态进行监控，并可对潜在和已出现的故障做出判断，同时提供在线解决方案。该仪器也全面实现了远程的准无人操作，大大提高了仪器的使用效率，同时通过高精度的AS1000自动进样系统，实现自动化进样，最大程度抑制了样品的交叉污染，提供样品分析精度。LC-10Tvp等度高效液相色谱仪可广泛应用于研究开发、医药检验、食品检测、化工分析、环境监测等众多分析领域。　　主要特点 丰富的功能&mdash &mdash 符合客户对分析的不同需求 硬件具有VP功能，记录维护信息和操作记录，符合GLP/GMP要求；系统控制器增具有时钟、温度计、湿度计等人性化设计的功能。 卓越的性能&mdash &mdash 满足客户对仪器的严格要求 检测器采用进口氘灯、光电池以及1200条/mm凹面光栅组成的双光束单色器；精密加工的双透镜流通池，控制波长调节的高精度微处理器以及双路高速的采样频率，确保了低噪声、低漂移及超高灵敏度等特点。 VI2010工作站符合多种法规要求。　　可靠的结果&mdash &mdash 满足客户对结果的准确要求 与进口仪器做对比试验,分析结果具有高度的一致性。　　简便的操作&mdash &mdash 便于客户对软件的熟练操作 软件采用多窗口模式，操作方便。 精美的外观&mdash &mdash 满足客户对仪器的视觉要求 外形精美，带来视觉上的享受。技术指标 LC-10Tvp高压恒流输液泵输液方式微体积串联双柱塞最大输液压力0～9999Psi流量设定范围0.001～9.999ml/min （以0.001ml/min步长调节流量）流量设定值误差&le 0.5%流量稳定性误差&le 0.2%RSD压力脉动小于15Psi （流量1mL/min，压力600～1600Psi 。）泵密封性压力为5400Psi，时间为10min，压降小于400Psi 。时间程序功能有尺寸W260× H130× D420mm重量11kg使用环境温度范围4～40℃ SPD-10Tvp紫外可见可变波长检测器 波长范围190nm～700nm波长示值误差&le ± 1nm波长重复性误差&le ± 0.1nm动态噪声&le ± 0.75× 10-5AU （甲醇，1ml/min，254nm，20℃ 。）静态噪音&le ± 0.5× 10-5AU （空池，响应时间1秒，20℃ 。）动态基线漂移&le ± 1× 10-4AU/h （甲醇，1ml/min，254nm，20℃ 。）静态基线漂移&le 0.5× 10-4 （空池，响应时间1秒，20℃ 。）线性范围&ge 104最小检测浓度&le 1× 10-9g/mL （萘/甲醇溶液）定性重复性RSD6&le 0.1%定量重复性RSD6&le 0.5%光谱带宽6nm流通池体积8&mu L光程10mm时间程序功能有尺寸W260× H130× D420mm重量11kg使用环境温度范围4～40℃　　三、实验　　1 仪器与试剂　　南京科捷 LC-10Tvp高压恒流泵　　SPD-10Tvp紫外检测器　　超声波清洗仪　　反相色谱柱C18　　固相萃取柱　　泰乐菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考标准品均为天津市科密欧化学试剂开发中心监制　　乙腈、正己烷均为优级纯　　其它试剂均为分析纯　　实验用水均为二次蒸馏水　　新鲜牛肉与鸡肉均为超市所购　　2 色谱条件　　C18反相色谱柱　　柱温25℃，流速1mL/min，进样量25uL，梯度洗脱条件A相为甲醇，B相为0.2mol/L磷酸二氢钠含10%(体积比)甲醇，调节pH为3.0，梯度洗脱程序：0-2min10%A，2-8min 10%-40%A，8-9min40%-10%A，检测波长入为275nm　　3 标准溶液的配制及标准曲线的制备　　分别准确称取各标准品0.01g（精确至0.001g），用甲醇分别溶解并定容至100mL，配制成100mg/L标准储备液，于一4℃冰箱中冷藏，测定时将各标准溶液混合后稀释成0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0mg/L的溶液。分别以泰乐菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数（r）。　　4 样品处理　　将新鲜牛肉及鸡肉分别匀浆后，于-18℃冰箱中保存。测定时，将匀浆冷冻保存的牛肉与鸡肉样品于室温下自然解冻。分别准确称取20.0g样品置于50mL具塞锥形瓶中，加入20mL乙腈，超声10min，转移至离心管，以5000r/min离心10min，收集上清液，离心沉淀物用上述方法重复提取2次，合并上清液。向得到的清夜中加入30mL正己烷，用力振荡5min，静置分层，弃去上层正己烷层。然后将溶液于40℃减压旋转蒸发至约2mL，氮气吹干后加入5mL甲醇一磷酸盐混合液超声溶解抗生素，最好定容至10mL。　　5样品净化　　将HLB固相萃取小柱用5mL甲醇、5mL去离子水活化后，将4得到的样品处理液上固相萃取柱(柱流速保持1滴/s），用10mL蒸馏水、10mL5%甲醇水溶液淋洗固相萃取柱，再用10mL甲醇洗脱，将洗脱液用氮气吹干后，加入流动相超声定容至5mL，最后，经0.22um滤膜过滤后进样。　　6方法的准确度、精密度、线性范围、回收率对于牛肉样品分别添加0.1、0.5、1.0mg/kg 3个水平的混合标准溶液，按照4与5样品处理及净化方法，每个水平平行测定4次，进行回收率实验，并且以3倍信噪比分别计算泰乐菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考在牛肉样品中的检出限，在测定条件下4种药物在0.1&mdash 20mg/L范围内均呈线性，线性方程与相关系数、平均回收率、相对标准偏差见表1 7 实际样品检测　　本实验分别对10份牛肉样品和10份鸡肉样品中泰乐菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考进行检测，没有发现牛肉样品中含有以上抗生素，但是在4份鸡肉样品中都不同程度检测到了泰乐菌素，最高为200ug/kg，最低为80ug/kg，平均含量为120ug/kg，高于我国动物性食品中兽药最高残留限量标准（100ug/kg）　四、结论　　 我国动物性食品中兽药最高残留限量标准规定泰乐菌素、替米考星、氯霉素、氟苯尼考在肉品中的最高残留量（MRL）分别为100、75、1.5、200ug/kg，本实验所测泰乐菌素、替米考星、氟苯尼考的检出限分别为20、32、16ug/kg均在最高残留限量以下，符合残留检测分析要求。由于氯霉素药物特殊性，欧盟对氯霉素的检出限要求为0.1ug/kg，美国FDA对氯霉素的检出限要求为0.3ug/kg，按照本实验方法，氯霉素检出限为19ug/kg，还未达到国际上的要求，这是因为提取方法和所用检测器所致。今后应该发展更加灵敏的方法以提高氯霉素。本实验方法的平均回收率较高（75%-87%），而且步骤简单、操作容易、重现性较好相对标准偏差为1.35%-5.41%，表明方法稳定可靠。 　　南京科捷（www.kj17.com）专业维修各类进口和国产的液气相色谱仪、高效液相色谱仪、紫外分光光度计、原子吸收分光光度计、红外光谱仪、核磁共振、原子发射光谱等分析仪器。欢迎来电咨询！公司地址：南京市光华路1号理工大学科技园孵化大楼二楼 联系电话：025-84372572 84372573 83312752 传 真：025-83738955QQ：175227100 E-mail: kj17@21cn.com njkj17@163.com网址：http://www.kj17.com