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SNT 2668-2010 转基因植物品系特异性检测方法,这个方法对转基因的检测意义在哪方面?
第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法,各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火,产生短的,部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5‘末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA,需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA,所以模板一般选用poly(A)+RNA。Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3’端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2%,所以与使用随机引物相比,cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性,oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20,因为其热稳定性较好,适用于较高的保温温度。基因特异性引物(GSP)对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷,可以特异性地同RNA目的序列杂交,而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3‘最末端退火的扩增引物序列相同,或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象,为了成功进行RT-PCR,需要设计多于一个反义引物,因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。建议在20μl的第一链合成反应体系中使用1pmol反义GSP。提高逆转录保温温度为了充分利用GSP特异性的全部优点,应该使用有较高热稳定性的逆转录酶。热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性。比如,如果一个GSP退火温度为55℃,那么如果使用AMV或M-MLV在低严谨性的37℃进行逆转录,GSP所带有的特异性就没有完全利用。然而SuperScripⅡ和ThermoScript可以在50℃或更高进行反应,这就会消除较低温度时产生的非特异性产物。为获得最大的特异性,可以将RNA/引物混合物直接从65℃变性温度转移到逆转录保温温度,并加入预热的2×反应混合液(cDNA合成热启动)。这有助于防止低温时分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度转换。http://www.biomart.cn/upload/asset/2009/03/27/1237778966.gif图 逆转录温度对RT-PCR特异性的影响使用ThermoScriptTM和设计用来同人DNA聚合酶ε mRNA退火的GSP,由1μg Hela RNA合成cDNA。ThermoscriptTM加入到预热的反应混合液中,使用Platinum Taq DNA聚合酶对1/10的cDNA进行35个循环的PCR。减少基因组DNA污染RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法,如Trizol Reagent,会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。为了避免产生于基因组DNA的产物,可以在逆转录之前使用扩增级的DNaseⅠ对RNA进行处理以除去沾染的DNA。将样品在2.0mM EDTA中65℃保温10分钟以终止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合镁离子,防止高温时所发生的依赖于镁离子的RNA水解。为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开,可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比来源于沾染的基因组DNA的产物短。另外对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照实验,以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。
[font=宋体][font=宋体]双特异性抗体是含有两种抗原结合位点的抗体,可结合不同表位(通常在两个抗原上)。一般来说,一个抗原结合位点特异性结合靶细胞表面的抗原,而另一个则结合效应细胞表面上的触发分子,例如一种[/font][font=Calibri]Fc[/font][font=宋体]γ[/font][font=Calibri]R[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]CD3/T[/font][font=宋体]细胞受体复合物。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]双特异性抗体可以改变效应细胞对其自然靶标的特异性,并使其重定向,杀死它原本会忽略的靶标。不同的细胞毒性细胞表达不同的触发分子(受体)。因此,通过改变靶标和效应结合域的特异性,可针对大多数类型的靶细胞产生多种效应应答。或者,通过特异性结合血清免疫球蛋白,可以实现全范围的效应功能(即[/font][font=Calibri]ADCC[/font][font=宋体]、吞噬作用、补体激活和延长血清半衰期)。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]近日,市面上出现了用于治疗用途的两种双特异性抗体。由于其独特的作用机制,双特异性抗体受到了广泛的关注,越来越多的双特异性抗体不仅用于癌症研究,也用于其他疾病的临床试验。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]双特异性抗体的优缺点:[/b][/font][font=宋体]优势:[/font][font=宋体]①双特异性抗体将效应细胞直接靶向肿瘤细胞,增强其细胞毒性。[/font][font=宋体]②双特异性抗体可以同时识别两种分子,提高了抗体的选择性和功能性亲和力,改善了药物的安全性和有效性。[/font][font=宋体]③与两种单克隆抗体药物联合用药治疗相比,双特异性抗体药物减少了开发和临床试验成本。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]与单克隆抗体药物相比,双抗药物也存在不足之处,主要表现在:[/font][font=宋体]①存在重链、轻链错配现象,制备工艺难度高[/font][font=宋体]②双抗并非天然结构,存在使用过程中产生抗药物抗体的可能。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]双特异性抗体的制备方法:[/b][/font][font=宋体][font=宋体]制备[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/bispecific-antibody][b]双特异性抗体[/b][/url],科学界同仁已开发了诸多解决方案。杂交[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]杂交瘤法(也称为四源杂交瘤)是最早用于制备双特异性抗体的技术。基于两种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合,表达所需特异性的鼠[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]。然而,这种方法制备的功能性双特异性抗体占比低,为后续的抗体纯化和质控带来了巨大的挑战。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]通过使用分子克隆技术,双特异性[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]抗体由同一细胞系表达的两条不同重链和轻链组成。双特异性抗体的制备需要至少两个用于异二聚化重链的质粒和一个用于公共轻链的质粒。如果使用两个不同的轻链,则需要两个轻链质粒。一般建议[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]个单独的质粒上表达[/font][font=Calibri]HC[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]LC[/font][font=宋体],因为调整质粒比率是一种简单有效的方法。随后,通常要经历复杂的过程从异质稳定转染池中选择最理想的克隆细胞系,以用于大规模抗体生产。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]与稳定转染相比,瞬时转染无需将重组[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]整合至宿主基因组中,可以在数天内快速得到结果。人胚肾细胞([/font][font=Calibri]HEK293[/font][font=宋体])可用于双抗的瞬时表达,适合应用于双抗药物开发的早期阶段。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以查看:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/bispecific-antibody[/font][/font]