显微活体成像

大家好，今天给大家分享一篇近红外二区荧光宽场显微活体成像技术和应用的文章，本文的通讯作者是浙江大学的钱骏教授。传统的荧光成像技术是基于可见光波段（400~760 nm）和近红外一区波段（760~900 nm）实现的，但是由于受生物组织散射和自发荧光的影响，这些波段的光对厚样本、活体样本成像时，成像深度和空间分辨率受到了很大的影响。而近红外二区波段（1000~1700 nm， NIR-II）的光受生物组织散射和自发荧光的影响大大降低，因而用这个波段的光成像时，成像的深度和信噪比都显著提高。近年来，NIR-II荧光宽场显微术在高时间分辨率、高空间分辨率、高信背比和大深度组织穿透方面获得突破性发展，这些得益于荧光探针和成像仪器设备的开发和改进。作者在本文中通过介绍NIR-II荧光宽场显微活体成像的机制特点、演进历史、系统进展以及在不同生物模型上的最新应用，展现其临床试验的巨大潜力，使NIR-II荧光宽场显微成像术在基础研究和临床应用上得到更进一步的普及。1、NIR-II荧光活体生物成像近年来，研究者们展开了一系列的NIR-II荧光成像研究，实现了对活体生物样本的深层和功能性成像，尤其伴随着探测器性能的提升和荧光新探针的开发，NIR-II的活体荧光成像迅速成为热点。尽管NIR-II荧光成像应用日趋广泛，但其成像窗口的定义却并不统一。长期以来，NIR-II在学术界被定义为1000~1700 nm。然而，工业领域认可的典型短波红外波段为900~1700nm。浙江大学钱骏教授团队模拟了NIR区域（至2340 nm）中的光子传播，确认了活体成像中适度利用水对散射光子的吸收能提高信背比，并将NIR-II窗口扩展为900~1 880 nm，定义了2080~2340 nm为近红外三区。其中，1400~1500 nm和1700~1880nm分别被定义为NIR-IIx和NIR-IIc区域。图1：定义并扩展NIR-II窗口为900-1880nm2、NIR-II荧光宽场显微成像系统活体成像研究中，NIR-II的宏观成像不仅可以实现主动脉和微小血管循环检测，也可以实现各类器官的成像，如心、肝、脾、肺、肾、肝、肠、胆道等。但是，组织的微结构观察和检测需要更大倍率的成像系统，以提高生物组织的空间分辨率和对比度，实现生物微结构的清晰成像。钱骏教授团队与宁波舜宇仪器（SOPTOP）公司合作，开发出新型NIR-II荧光正置显微成像系统，将短波红外探测器与传统的荧光显微成像系统结合，可实现宽场激发、面阵探测，具备成像深度大、时间分辨高、空间分辨好、操作简便等优势，可实现深层组织的高倍探测，已满足商用要求。此系统先后被相关科研院所购置，已在宫颈癌靶向化疗、小鼠脑血管研究等领域得到应用和报导。图2：舜宇仪器 NIR II-MS 近红外二区活体显微影像系统3、NIR-II荧光宽场显微成像的应用基于NIR-II荧光成像的大深度、高分辨率等优势，诸多生物医学应用得以开发。其中，活体大深度显微成像不仅能够对脉管系统、组织器官清晰破译，而且能够获取生物体内生命活动细微过程的动态信息，具有对生理和行为动态观察的巨大潜力。NIR-II荧光宽场显微系统提供高时间分辨率和高空间分辨率，可实现脑血管实时解析成像，以及血流速度和心跳周期的测量。作者团队针对血流测速开展工作，静脉注射IR820（0.5 mg/mL， 200 μL）后，使用NIR-II荧光宽场显微系统监测小鼠脑血管结构和实时血液流动，实时获取150 μm深度处的毛细血管血流速度为725 μm/s。同时，研究人员使用NIR-II荧光宽场显微系统记录开颅小鼠头骨下方0 ~800 μm深度下脑血管图像，并在800 μm的深度下区分出直径仅6.1 μm（半高全宽）的毛细血管。图3：小鼠活体脑血管成像血管造影方法可提供血管状态的有用信息，用于监测疾病过程。NIR-II荧光宽场显微成像技术能以高时空分辨率实现深层组织血管可视化。作者及唐本忠院士课题组开发了一种近红外聚集诱导发射（Aggregation-Induced Emission ，AIE）纳米颗粒，借助NIR-II荧光宽场显微成像系统，对小鼠大脑中的光致血栓形成缺血（Photo-Thrombotic Ischemia， PTI）和血脑屏障（Blood–Brain Barrier，BBB）损伤过程实现了精确监测。图4：NIR-II荧光宽场显微成像系统用于血流动力学研究和小鼠脑血栓性缺血的实时跟踪肿瘤和炎症性病变的检测和诊断仍是临床的巨大挑战，而NIR-II荧光宽场显微系统亦可用于肿瘤的精准检测。唐本忠院士、钱骏教授等将AIE纳米颗粒TQ-BPN注射进入具有旧肿瘤（4周）和新肿瘤（2周）的小鼠体内，使用NIR-II荧光宽场显微系统来识别不同生长阶段的肿瘤。NIR-II荧光宽场显微系统凭借穿透深度大和成像实时的优点，能够清晰地原位显示肿瘤部位的EPR效应，这将有利于早期肿瘤检测和转移研究。图5：使用NIR-II荧光成像在肿瘤部位原位显示高渗透长滞留（EPR）效应除普通小鼠、大鼠外，大型灵长类动物（如狨猴）的NIR-II荧光成像技术的探索更有利于临床转化，对于这些动物神经活动和脑血流调节的研究，有利于揭开人类大脑疾病的神秘面纱。钱骏教授、高利霞教授及唐本忠院士等首次在非人类灵长类动物中进行了穿薄颅骨大深度脑血管显微成像。图6：高空间分辨率的狨猴穿颅脑血管显微系统NIR-II荧光宽场显微系统拥有高时间分辨率以监测动态生物过程，提供高空间分辨率以观察微小生物结构、精准定位药物分布，还具备大成像深度。同时，该系统对比其他显微成像系统（如共聚焦显微术、光片显微术）易于上手使用并且成本适中，便于在活体研究和临床实践中推广。通过相关研究团队的努力，实现了从小鼠、大鼠、狨猴到猕猴，从脑血管、肿瘤血管到炎症组织及离体细胞、组织切片等的NIR-II荧光宽场显微成像，证明了NIR-II荧光宽场显微成像技术的巨大潜力。综上所述，NIR-II荧光宽场显微成像技术不断在更大的成像深度、更优的信背比、更高的空间分辨率、更快的成像速度上得到创新、改进和突破。NIR-II荧光宽场显微成像系统有望在各种生物和材料研究实验室推广，甚至在医学机构和医院临床获得普及和应用。以上便是今天为大家分享的近红外二区荧光宽场显微活体成像技术与应用，其中所采用的实验设备均为宁波舜宇仪器的NIR II-MS活体显微影像系统。作为全球首款近红外二区活体正置显微成像系统，可以实现对近红外二区荧光探针的光学表征以及活体生物样品、厚生物组织等的大深度、高时空分辨成像，选择25X红外水镜时，活体成像深度≥1.4mm，空间分辨率≤2μm。其操作简便的系统，具备在医学研究、临床诊断和手术治疗领域作为活体成像的基础工具的潜力。本文为SOPTOP舜宇显微系统供稿。如有技术干货、科研成果、仪器使用心得、生命科学领域热点事件观点，欢迎广大相关行业朋友投稿。投稿邮箱：lizk@instrument.com.cn

中国科学院生物物理研究所欧光朔研究组在2012年12月期的Nature Protocols上发表题为Live imaging of cellular dynamics during Caenorhabditis elegans postembryonic development的文章，介绍他们发展的研究线虫胚胎后发育的荧光活体显微成像方法。　　胚胎后发育是生命体一个重要的发育时期。例如，线虫的959个体细胞中有400多个是在胚胎后时期产生的。观察线虫胚胎时期发育的显微成像技术相对成熟，而研究线虫胚胎后发育的活体荧光显微成像方法缺乏。　　该文章系统介绍了观察活体线虫胚胎后发育时期细胞动态的方法，并对可能的技术难点进行了讨论。欧光朔研究组将这项成像技术与线虫遗传学的结合，发现了迁移细胞的分子标识(Ou & Vale, Journal of Cell Biology, 2009)、 一种新的细胞不对称分裂方式(Ou et al., Science, 2010) 、自体吞噬基因在凋亡细胞降解中的作用(Li et al., Journal of Cell Biology, 2012)等。　　该项工作得到科技部、国家自然科学基金委和“青年千人计划”的资助。线虫Q神经前体细胞在L1幼虫时期迁移及产生子代细胞的简图

双光子显微镜是对深层散射组织进行活体观测不可或缺的仪器，以其远超单光子显微成像的穿透深度而受到生命科学和医学研究的广泛关注。然而，传统双光子显微成像的点扫描成像模式从根本上限制了其成像通量与三维感知速度，极易受复杂活体成像环境干扰，同时激发点巨大的瞬时光强会对活体生物样本造成持续性的非线性光损伤，导致高速三维成像时长严重受限，极大地制约了病理学、免疫学和脑科学的发展。2023年5月12日，清华大学戴琼海、吴嘉敏、祁海作为共同通讯作者在 Cell 期刊发表了题为：Two-photon synthetic aperture microscopy for minimally invasive fast 3D imaging of native subcellular behaviors in deep tissue 的研究论文。该研究首次提出了基于空间约束的多角度衍射编码，实现非相干光孔径合成；建立了双光子合成孔径显微术（Two-photon synthetic aperture microscopy，2pSAM），“化点为针”，通过多角度针状光束的扫描在实现高速三维感知的同时，将双光子成像光毒性降低了1000倍以上；融合了戴琼海院士团队2021年同样在 Cell 上所提出的数字自适应光学架构，具备高速多区域像差矫正能力，即使在恶劣复杂活体环境下依然保持近衍射极限的空间分辨率，并进一步提升了传统双光子成像的穿透深度。基于此，2pSAM能够在哺乳动物深层散射组织中非侵入式地观测大范围亚细胞级动态变化，将毫秒级三维连续观测时长从数分钟提高到数十小时，为系统性地研究大规模细胞在不同生理与病理状态下的交互作用打开了大门。交叉研究团队利用2pSAM在小鼠活体观测到了一系列新现象，包括急性脑损伤后脑组织内周的多细胞互作，神经元在超长时程连续观测下展现出对视觉刺激的表征稳定性与功能多样性，以及首次完整高速记录下了小鼠免疫反应过程中淋巴结生发中心的形成过程，为病理学、脑科学和免疫学的研究打开了新窗口。传统双光子显微镜使用“点扫描”的方案对三维样本进行扫描，类似于共聚焦荧光显微镜，由于双光子成像的非线性效应使其能够获得数倍于单光子成像的穿透深度。例如，双光子显微镜在小鼠大脑皮层的最大穿透深度可以达到1 mm。然而，这种点扫描方式严重限制了双光子显微镜的三维成像速度与数据通量，并且由于在聚焦点位置极大的瞬时光强带来了非常严重的非线性光损伤隐患。2pSAM采用了轴向景深拓展的“针扫描”方案，通过改变针状光束的不同倾角实现样本三维信息的多角度投影，类似CT一样实现快速三维成像；同时，受到雷达成像中合成孔径方法的启发，通过在像面处引入针孔所带来的空间衍射编码约束，实现了非相干光的孔径合成，将多角度信息融合为大数值孔径对应的高空间分辨率；进一步利用样本的时空连续性先验，有效避免了视角扫描带来的时间分辨率损失。这样一种全新的计算双光子成像架构，在保留双光子本身深层组织穿透能力的同时，将有效成像通量提升了三个数量级以上。图1. 双光子合成孔径显微术（2pSAM）系统图除此之外，样本引起的光学像差给显微成像带来的分辨率与信噪比损失十分严重，随着成像深度的增加这种降质尤为明显。目前双光子成像中的硬件自适应光学技术主要面临着以下一些问题：1、成像系统复杂、成本高昂；2、有效校正视场有限，大视场多区域校正速度缓慢。2pSAM通过激发光编码获得了超精细的四维空间角度光场数据，能够使用数字自适应光学架构（DAO），无需在光学系统中增加额外的波前传感器或者空间调制器，就能实现信号采集与自适应像差校正的解耦，在后处理端完成大范围多区域自适应光学，显著提升在复杂成像环境中的空间分辨率与信噪比。图2. 双光子合成孔径显微术（2pSAM）结合数字自适应光学（DAO）与传统双光子显微镜（TPM）面对复杂成像条件下的结果对比。从左至右依次为：正常条件下拍摄，物镜校正环不匹配情况下拍摄，物镜为水镜且缺乏浸润水的情况下拍摄，物镜与样本之间增加散射胶带后进行拍摄长时间的激光照射会对活体样本产生严重的光毒性。研究团队发现，传统双光子显微成像由于使用飞秒激光激发与高NA会聚，在样本局部会产生巨大的瞬时光强，由此所产生的非线性光毒性在以往被极大地低估了，而一旦在长时程成像过程中，就会不断积累损伤从而影响细胞正常状态。与之对比，2pSAM化点为针，通过轴向景深拓展，在保持同样荧光激发效率的前提下，将瞬时峰值功率降低了1000倍，从而有效解决了非线性光损伤的问题。一方面能显著减少荧光探针的光漂白，对于同一类易淬灭染料，在同样激发光强下，传统双光子仅能拍摄几十个三维体，而2pSAM能够连续拍摄几十万个三维体而没有明显的信号衰减。除此之外，团队还对小鼠脑皮层中的小胶质细胞与脑损伤过程中的中性粒细胞进行了连续成像测试，发现即使使用较弱的光强，传统双光子显微成像在连续拍摄半小时以上时仍会导致大量细胞凋亡，而在2pSAM成像过程中细胞保持了正常的表型，并且相比于对照组结果无明显差异。团队通过一系列在体与离体实验充分证明了2pSAM能够将传统双光子成像的光毒性下降三个数量级以上，为长时程高速活体组织成像打开了新窗口。图3. 小鼠大脑急性开窗损伤后的皮层免疫细胞成像，TPM（左）与2pSAM（右）光漂白对比（GIF图)图4. 离体B细胞（GFP，蓝色通道）连续拍摄实验：使用PI标记细胞凋亡（红色通道），对比TPM（左）与2pSAM（右）的光毒性（GIF图）生发中心（Germinal center，GC）是次级淋巴器官中的动态组织区域，是被抗原激活后的B细胞在趋化作用引导下聚集形成的结构，也是产生高亲和力抗体及形成长期免疫记忆关键场所。但是由于GC形成的随机性和免疫细胞本身对光损伤的敏感性，完整的GC形成过程从未被高速长时间的清晰记录过。借助2pSAM，得以首次完整清晰地观测到了免疫反应下GC形成的全部过程。研究人员将带有荧光标记的抗原特异性B细胞回输到小鼠体内，随后将抗原接种到腹股沟附近以诱导引流淋巴结中生发中心的形成，并于免疫后90到110个小时内（生发中心未形成期），在大视场下持续地对淋巴结中抗原特异性B细胞的动态行为进行追踪，成功揭示了GC形成过程中B细胞的分裂增殖是GC形成的主因，辅助以周围活化B细胞的聚集。由于拍摄时长达十余小时，淋巴结本身会产生剧烈的形变，2pSAM通过多视角信息能够进行实时轴向聚焦位置反馈，实现自动对焦，有效避免了长时程拍摄过程中的样本漂移。 图5. 小鼠腹股沟淋巴结免疫反应后生发中心形成过程的完整观测和记录（GIF图）研究人员进一步借助2pSAM在患有创伤性大脑损伤（Traumatic brain injury，TBI）的小鼠和正在接受视觉条纹刺激的GCaMP转基因小鼠进行脑皮层组织的细胞动态观测。在TBI小鼠受伤区域磨薄颅骨后观测到了外周免疫细胞中性粒细胞在浸润后与内周星形胶质细胞的相互作用，如通过直接接触定向产生迁移体（migrasome）来传递物质和信息。对GCaMP转基因小鼠开颅恢复2周后进行视觉上的条纹刺激，进一步证实了长达数小时内小鼠视觉皮层神经元钙信号对不同方向条纹选择性表达的持续性和稳定性，同时也通过长时程功能数据挖掘出了多种单细胞水平的神经响应类型，体现了神经元的功能多样性。这些现象对于传统双光子显微镜而言都极具挑战，特别是会由于光毒性本身导致会导致细胞异常表现，比如会导致神经元在长时程拍摄过程中响应强度不断下降。