顺式羟基索非那新非对映

目的使用沃特世(Waters)ACQUITY UPC2&trade 系统成功开发非对映体超高效合相色谱(UltraPerformance Convergence Chromatography&trade ，UPC2&trade )方法，用于四种氯菊酯异构体的基线分离。背景公众对杀虫剂使用的关注日益增长。目前使用的杀虫剂有25%为手性化合物。在这些杀虫剂中，手性在药效、毒性、代谢特性和环境方面起着重要的作用。因此，对立体选择性分离技术和分析测定杀虫剂对映体纯度的需要正在不断增长。氯菊酯是一种合成的化学品，广泛用作杀虫剂和驱虫剂。氯菊酯具有四种立体异构体(两对对映体)，由环丙烷环上的两个手性中心产生，如图1所示。因此，氯菊酯异构体的分离和定量测定颇具有挑战性。在分离氯菊酯方面，开发正相HPLC和反相HPLC的方法已经做出巨大的努力，但收效不尽如人意。我们在此展示，利用ACQUITY UPC2，在不足6分钟之内实现了四种氯菊酯基线分离。与HPLC方法相比，UPC2&trade 实现了所有异构体的完全基线分离，运行时间大大缩短；对于杀虫剂的生产厂家而言，进行日常非对映体分析UPC2不愧为理想之选。解决方案人们已经对各种手性固定相(CSPs)进行了评估，以利用手性正相HPLC和反相HPLC进行分离。Lisseter和Hambling报道了Pirkle型手性固定相用于正相HPLC条件下分离氯菊酯。总的运行时间大于30min，使用的流动相为含有0.05%异丙醇的正己烷(Journal of Chromatography，539 1991 207-10)。但是，顺式和反式对映体拆分并不理想。Shishovska和Trajkovska使用了手性ß -环糊精手性固定相，用于在反相HPLC条件下拆分氯菊酯，以甲醇和水作为流动相(Chirality，22 2010 527-33)。总的运行时间大于50min，反式氯菊酯对映体的分离度小于1.5。另外，正相HPLC条件下，CHIRALCEL OJ色谱柱也用于氯菊酯的分离(Chromatographia，60 2004 523-26)，我们的实验在表1中所示的条件下进行，得到了3个分开的色谱峰，如图2所示，该结果与文献报道一致。图3显示了利用ACQUITY UPC2系统对氯菊酯进行非对映体分离。所有四种异构体利用更短的OJ-H色谱柱在不足6分钟内实现了基线分离。实验结果总结于表2中。总的来说，与手性HPLC方法相比，当前的UPC2方法实现了更好的分离，且运行时间更短。总结利用沃特世ACQUITY UPC2系统成功分离氯菊酯得到了证明，在小于6分钟内实现了四种异构体的基线分离。与手性HPLC方法相比，UPC2方法具有更高的分离度和更短的运行时间。UPC2方法也杜绝了正相HPLC中有毒正己烷的使用。对于杀虫剂生产商而言，进行日常非对映体的分析，ACQUITY UPC2系统不愧为理想之选。

摘要北京大学人民医院胸外科杨帆团队和清华大学医学院生物医学工程系郭永团队合作，在《OncoTargets and Therapy》发表题为"Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of de novo EGFR T790M Mutation in Patients with Non-Small Cell Lung Cancer"的研究论文，该研究使用新羿TD-1数字PCR平台，验证了非小细胞肺癌病人中原发EGFR T790M突变与共存的致敏EGFR突变在等位基因上的顺反式关系（顺式排列指两个位点在同一条DNA分子上，反式排列则是指两个位点不在同一条DNA分子上，这两种不同排列方式导致患者对药物的敏感性不一样），并探索了福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本对检测原发EGFR T790M突变的影响。方法与结果该研究入组了300例中国非小细胞肺癌患者，所有病人都未使用过EGFR-TKIs。对于前250例患者（A组），通过外科手术获取肿瘤组织后快速冷冻后保存于-80℃；对于后50例患者（B组），获取病人的肿瘤组织和癌旁正常组织，并分别制作成冰冻肿瘤组织、FFPE肿瘤组织、冰冻正常组织和FFPE正常组织。对A组的250例冰冻肿瘤组织进行EGFR基因突变检测，并对同时检出T790M突变和致敏EGFR突变的样本进行等位基因顺反式检测。对B组的4种类型样本进行EGFR基因突变检测，分析4种类型样本中T790M突变比例。（详细流程见图1）300例冰冻组织EGFR检测结果如下表：图1 研究设计流程对3例为L858R+T790M双阳性样本。进一步构建了L858R+T790M双重检测体系，用总RNA分析L858R和T790M的顺反式关系，结果表明，这3例样本均为顺式关系，即L858R和T790M突变存在于同一条DNA分子上（图2）。图2（A）显示了野生型EGFR的NSCLC细胞系的FAM非特异性信号。（B、C、D）3例NSCLC患者，同时伴有原发T790M和L858R突变，用ddPCR方法检测两种突变的等位基因关系，B、C、D所示为EGFR的原发T790M（FAM标记）和L858R（VIC标记）的双阳性信号， FAM和VIC阴性信号以黑色表示。野生型EGFR L858R和野生型T790M突变的信号以蓝色表示。EGFR L858R突变阳性的信号以绿色表示。原发T790M伴随顺式L858R突变的双阳性信号以橙表示。对B组的50例病人的4种类型样本进行19Del、L858R和T790M检测，发现T790M在癌旁正常组织FFPE样本的丰度为0.1%-0.5%，而同样的冰冻组织的突变丰度均低于0.1%。这提示在用FFPE样本检测T790M突变时，需仔细确认判读的cut off。图3 FFPE肿瘤组织样本和FFPE癌旁正常组织样本中的原发T790M突变丰度研究结论1、中国NSCLC原发T790M突变发生率很低，在本研究中只有1.3%。2、本研究发现的3例L858R+T790M双阳性样本为顺式突变，数字PCR可以有效检出。3、福尔马林固定造成的人工突变会影响FFPE样本的T790M突变检测。所以使用ddPCR检测FFPE样本前，应仔细验证ddPCR检测体系的分析cut off值。作者介绍北京大学人民医院胸外科王迅主治医生为该论文的第一作者，北京大学人民医院胸外科杨帆教授与清华大学医学院郭永教授为论文的合作通讯作者。原文链接：https://www.researchsquare.com/article/rs-29659/v1

目的采用沃特世(Waters)ACQUITY UPC2&trade 系统比较正相HPLC和UPC2&trade 方法分离联二苯酚对映体的效果。背景生物体由手性生物分子，如蛋白质、核酸和多糖组成；因此，它们对药物、食品、农药和废弃化合物中的对映体表现出不同的生物反应。因此，分离手性化合物，尤其是具有药物意义的化合物尤为重要。其重要性表现是以单对映体形式获批的手性药物数量不断增加。为符合FDA关于研发立体异构药物的严格指令，制药行业在进行药代动力学、药物代谢、生理学以及毒理学评价之前，已经加强手性纯化合物的制备。在过去的10年里，超临界流体色谱(SFC)已经显示出其作为分离立体异构体(包括对映体和非对映体)的巨大前景。与传统的手性高效液相色谱(HPLC，主要是正相HPLC)相比，超临界流体色谱(SFC)平均快了3-10倍。超临界流体色谱使用廉价的CO2和极性改性剂(如MeOH)作为流动相，减少有机溶剂的消耗和处理，使分析更高效，更环保。与正相色谱HPLC相比，超高效合相色谱(UPC2)能够实现联二酚萘更快的分离(为正相HPLC的9倍)，且每次分析成本大大降低。解决方案联二酚萘是一种轴手性有机物，如图1所示。联二酚萘样品采用正相HPLC和ACQUITY UPC2系统进行分离，两种方法的主要参数见表1。图2给出了采用正相HPLC(A)和UPC2(B)分离手性联二酚萘图谱。与正相HPLC中的第二个峰18min的出峰时间相比，UPC2的出峰时间为2min，使用UPC2速度增加至正相HPLC的9倍。正相HPLC的分离度(USP)为1.73，而UPC2为2.61。这种情况也说明了使用UPC2可以大大地节约每次分析的成本。UPC2方法使用2mL的甲醇洗脱化合物，但正相HPLC需要35.28mL正己烷和0.72mL甲醇。根据有机溶溶剂的用量计，使用正相HPLC每次分析大约需要2.85美元，而使用UPC2，每次分析仅需要0.08美元。UPC2图谱中的峰形比使用正相HPLC色谱得到的峰形性对称更好。正相HPLC的拖尾因子(USP)分别为1.33和2.18；而UPC2的拖尾因子分别为1.03，1.03。UPC2图谱中的色谱峰比正相HPLC色谱峰更高，更窄，意味着更高的灵敏度和峰容量。在UPC2中，由于使用超临界CO2作为流动相，超临界CO2固有的高扩散性和低粘度对分离产生巨大的影响。高扩散性减少了由流动相和固定相间的传质造成的色谱峰扩散。低粘度可实现最佳高流速而不产生明显的压降。况且，ACQUITY UPC2大大减小的系统体积使柱外的谱带展宽降至最小。总结ACQUITY UPC2系统展示了使用UPC2在2min内实现联二酚萘对映体的成功分离。与正相HPLC相比，UPC2速度快了8倍，且得到的色谱峰更高，对称性更好。ACQUITY UPC2大大减小的系统体积使柱外的谱带展宽降至最小。速度上的改善以及使用相对廉价的甲醇代替了正己烷可大大节约每次分析的成本(正相HPLC的2.85美元/次分析对比UPC2的0.08美元/次分析)。沃特世ACQUITY UPC2是实验室常规分离对映体的理想之选。