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戴安离子色谱仪无法读取通道信息咋办
随着生命科学研究的深入发展,生物组织或体液中一些微量的物质越来越引起科学家们的浓厚兴趣。对于这些物质的分离分析常采用柱色谱、薄层色谱、液相色谱和质谱技术。但是对于那些具有重要生物功能而含量甚低(低于十万分之一)的物质,即使经过反复富集的浓缩,仍然得不到供研究所需要的纯品量。高效薄层色谱(HPTLC)除了与其它色谱技术一样具有分离能力之外,它独有的优点是能够在HPTLC板上进行原位反应和原位检测。即从生物组织中提取的混合物经HPTLC分离后,利用免疫反应具有的高度特异性,在HPTLC板上直接与给体(抗体或毒素)进行原位免疫反应,再与酶标记或同位素标记的第二抗体进行原位反应,最后与酶的底物反应使之生成有色物质以其定性。使用TLC扫描仪测定光密度进行定量。这是一种综合利用HPTLC的高分离效率,免疫反应的高度特异性,以及酶联显色的高灵敏性的原位分析方法。把传统的HPTLC和酶联免疫反应测定技术发展到一个崭新的水平。省去了纯化纯品的复杂步骤。为微量生化物质的研究提供了一种有用的检测方法。1 实验方法1.1 HPTLC分离 用于HPTLC-原位免疫分析的硅胶板除了具有好的分离性能之外,硅胶涂的必须牢固,以防止在实验中经多次洗涤硅胶脱落。Nagel(德国)公司的以塑料片或铝片为支持体的硅胶板具备这些性能。硅胶板的尺寸一般用10×0cm, 硅胶涂层厚度为0.5mm。对于展开剂的要求除了对要鉴定的物质有分离能力之外,要呈中性(pH6.8-7.2), 并且挥发性要好,在温和的条件下易于除去。目的是使HPTLC板上的物质保持免疫活性。1.2 HPTLC板的处理 在每一步原位免疫反应之前,都要对HPTLC板进行处理。目的是避免非特异性反应。将完成样品分离的HPTLC板经干燥后,放入一个塑料盒子中,用滴管缓慢加入0.1ml/cm2的含1%鸡清蛋白和1%的聚乙烯吡咯啉酮的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.2)。在室温下浸泡2h后移出浸泡液,用滴管沿塑料盒子壁缓慢加入磷酸盐缓冲溶液,轻轻摇动盒子2min后,用滴管吸出洗涤液。重复洗HPTLC板3-5次。1.3 原位免疫反应 将处理好的HPTLC板放入盛有反应介质和反应物的塑料盒子中,反应条件要根据实验内容而确定。例如检测糖脂抗原时,盒子中加入0.1ml/cm2含特异性糖脂抗体的缓冲溶液,HPTLC板上的糖脂与抗体在4°C下反应2h。又如检测病毒与受体结合能力时,盒子中加入含有病毒的缓冲溶液,HPTLC板上的受体物质与病毒在4°C下至少反应9h。移出反应液,HPTLC板经洗涤后,再与抗病毒抗体反应2h。1.4 免疫反应的鉴定 酶联抗体市场上有售。酶是作为免疫反应的示踪物,最常用的是辣根过氧化酶。最后将已形成抗原抗体复合物的HPTLC板,置于含有酶联抗体的塑料盒子中,在4°C下反应2h
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