霍乱弧菌

导读霍乱弧菌是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高，属于国际检疫传染病。了解霍乱弧菌的复制原理能够帮助人们更系统的探索其感染机制。法国巴斯德研究所及华沙大学细菌遗传学系的科学家们在国际知名杂志Nucleic Acids Research上发表了一篇学术论文，揭示了霍乱弧菌的复制机制。（IF=16.971）应用亮点：▶ 揭示了霍乱弧菌的两条染色体的复制协调机制。▶ 通过naica微滴芯片式数字PCR系统对霍乱弧菌复制的关键调控基因进行定量检测并验证猜想。▶ 该研究发现的霍乱弧菌复制机制可能存在于所有弧菌科物种中，对于其他弧菌复制研究具有参考意义。研究背景：霍乱弧菌是引起霍乱的病原菌，它由两条染色体（Chr1、Chr2）以精心编排的顺序进行复制。研究发现只有在Chr1上的crtS 位点复制后才会触发Chr2启动。本研究提供了关于 crtS 如何触发Chr2复制起始的新思路，对Chr1-Chr2复制协调机制进行了深入探讨。研究成果：❶、crtS（位于Chr1上，启动子结合位点）和39m位点（位于Chr2上，启动子结合位点）通过与启动子RctB竞争结合影响Chr2的复制，crtS的存在降低了RctB与39m的结合。▲crtS 能够抵消39m位点的抑制作用。Chr2复制起点 (ori2)和39m 位点的序列比对。RctB结合位点以绿色（iterons，启动子结合位点）和红色（39m）表示。❷、RctB分为4个结构阈，研究发现其通过相同的DNA结合域与crtS和39m相互作用。进一步研究表明RctB域IV对于ori2（Chr2）起始位点的39m和crtS调节都是不可或缺的，并且RctB域IV的C端对于crtS协调两条染色体的复制至关重要。基于该调控模型，文章使用naica微滴芯片式数字PCR系统（Stilla Technologies）对霍乱弧菌中的（ori1 /ori2）和对照大肠杆菌中的（oriC / pORI2）进行定量，同时使用naica多重数字RT-dPCR (Stilla Technologies) 对来自指数生长培养物 (OD600 0.4) 的霍乱弧菌中的 RctB mRNA 进行了定量并证实了上述猜想的正确性。▲B、 pORI2 相对于大肠杆菌菌株染色体的拷贝数 (CN)，通过在 rctB 中插入终止密码子构建各种 pORI2缺失表达载体。C、在有和没有染色体 crtS 位点 (+/- crtS)的情况下，大肠杆菌中 pORI2 拷贝数的比率。D、Chr2 在非复制型霍乱弧菌中相对于 Chr1 (ori2/ori1) 的拷贝数。在所有突变体中，crtS位点被敲除，RctB结合位点被插入 Chr1 的 attTn7 插入位点（平均值±标准偏差）。最后文章解释了霍乱弧菌的复制机制模型：▲crtS 协调 Chr1 和 Chr2 之间复制的模型。RctB 结合位点以绿色 (iterons)、红色 (39m) 和蓝色 (crtS) 显示。OFF = Chr1：crtS 未被复制。Chr2：与39m位点结合的RctB主要通过红色箭头所示来抑制ori2的复制起始。ON = Chr1：crtS 已复制。RctB与复制的crtS位点的瞬时结合导致与39m位点亲和力降低（蓝色箭头），从而释放ori2。RctB与甲基化iterons的结合导致DNA解旋元件 (DUE) 打开，RctB寡聚化到单链DNA上（绿色箭头）。期刊介绍：Nucleic Acids Research (NAR)：1974年创刊，由牛津大学出版社经过同行评审公开出版的科学期刊。期刊主要发布涉及核酸代谢和/或相互作用的核酸和蛋白质的物理，化学，生化和生物学方面的前沿研究结果。最新影响因子16.971。

导读自青霉素发现以来，抗生素已经成为人类对抗细菌的最有效武器，挽救了无数人的生命，但随着抗生素使用上的无节制，抗生素耐药性已成为一个重大的全球问题。因此了解微生物对抗生素适应的分子机制成为抗击抗生素耐药性（AMR）的一个重要途径。近日，法国巴斯德研究所的科学家运用转录组测序、naica微滴芯片数字PCR等技术证实VchM（霍乱弧菌特有甲基转移酶）参与应对氨基糖苷类抗生素的应激反应，这表明，DNA甲基化在氨基糖苷类抗生素的耐药机制中也发挥着重要作用，该文章刊载于《PLOS GENETICS》。应用亮点：▶ 运用naica微滴芯片数字PCR系统分析霍乱弧菌操纵子表达情况。▶ VchM缺失会导致生长缺陷，但却可以使霍乱弧菌对氨基糖苷产生应激。▶ VchM直接调节groES-2（伴侣蛋白编码基因）的胞嘧啶甲基化，从而改变其表达情况，影响霍乱弧菌耐药性。氨基糖苷（AGs，如：妥布霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素和新霉素）是一类针对细菌核糖体小亚基的抗生素，其破坏翻译保真度，增加细胞中错误折叠蛋白质的水平。而本文的研究主要针对霍乱弧菌对其的耐药性机理。科学家们在之前的研究中发现，特定DNA甲基转移酶基因突变（VchM）的霍乱弧菌相比WT具有更强的耐药性，这表明DNA甲基化可能在霍乱弧菌适应AGs中发挥作用。VchM编码一种Orphan m5C DNA甲基转移酶，导致5‘-RCCGGY-3’基序的胞嘧啶甲基化，虽然VchM的缺失会导致生长缺陷，但霍乱弧菌细胞可以在亚致死浓度和致死浓度的抗生素下对氨基糖苷应激。▲图1：霍乱弧菌ΔVchM对亚致死浓度氨基糖苷的敏感性较低。GAs类，TOB（妥布霉素），0.6 μg/ml、GEN（庆大霉素），0.5 μg/ml、NEO（新霉素），2.0 μg/ml；非Gas类，CAM（氯霉素），0.4 μg/ml和CARB（β -内酰胺类西林），2.5 μg/ml对于ΔVchM霍乱弧菌的转录组测序和遗传分析发现，ΔVchM菌株中有4个直接参与蛋白质折叠的基因被上调。包括groEL-1，groEL-2，groES-1，groES-2。通过naica微滴芯片数字PCR系统对基因表达进行验证分析发现，ΔVchM霍乱弧菌中groES-2的表达在不同时期均有较大上调。进一步通过缺失验证表明了groESL-2对ΔVchM的抗生素高耐受性的作用。▲图2：ΔVchM菌株中groESL-2操纵子上调(对数生长期，Exp, OD600 ≈ 0.3；指数生长期，Stat, OD600 ≈ 1.8–2.0)在groESL-2区域观察存在四个VchM甲基化基序存在。进一步对基序分析发现，破坏这些基序会导致groESL-2基因表达增加（如图3）。且基序破环越多，则导致的表达上调更加明显。同时，ΔVchM中的groESL-2基因表达一直高于基序突变，表明还存在其他因素与甲基化协同控制groESL-2表达。这些结果表明，在霍乱杆菌中，一组特定的伴侣蛋白编码基因受DNA胞嘧啶甲基化的控制，将DNA甲基化与伴侣蛋白表达的调节和对抗生素的耐受联系起来。▲图3：在WT中，groESL-2区域的VchM位点突变导致基因表达增加法国巴斯德研究所是世界上最著名的研究所之一，成立130余年来一直走在世界科技前沿，是微生物学、免疫学、传染病学等学科的起源地，曾开发出狂犬病疫苗、天花疫苗、流感疫苗、黄热病疫苗等多个造福人类的疫苗产品，并培养了10名诺贝尔奖生理学或医学奖获得者，实现研究、教育、健康、创新“四位一体”的研究机构。

中新网10月11日电 据香港《明报》报道，香港9日证实今年首宗霍乱个案，卫生防护中心10日表示，任职玛丽医院餐厅的54岁女患者本月5日到荃湾杨屋道街市购买海鲜进食。 　　香港卫生防护中心表示，该名54岁女子及另外3名家人，进食购自杨屋道街市的鱼、带子、蟹、蚬等海鲜后，她及32岁儿子于10月7日出现腹泻等病征，两人之后入住玛嘉烈医院，化验结果证实女患者粪便样本含霍乱弧菌O1小川型，现隔离治疗，情况稳定。　　本报记者10日到杨屋道街市观察，发现大部分海鲜摊档照常营业，有档主表示生意正常，无受事件影响。香港食环署表示已派员到杨屋道街市调查，取走有关样本化验。