质谱峰分析

巴西圣保罗州立大学的研究人员进行了一项研究，利用基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱成像（MSI）分析了工蜂大脑中蛋白质表达和分布的可能变化，该工蜂曾暴露于亚致死浓度的吡虫啉（LC50/100或1%的LC50）下。 在世界范围内使用杀虫剂进行作物生产已经非常普遍，其中一个相当令人关注的问题是，这些杀虫剂不仅对害虫有害，对于在作物授粉过程中起重要作用的昆虫也是有害的。由于杀虫剂的使用，在蜜蜂中报告了许多亚致死效应，包括对发育、觅食方式、喂养行为、学习表现和神经生理学的影响。所以，评估农药对蜜蜂可能产生的有害影响的毒理学研究很重要，可以帮助制定保护和传粉媒介保持策略。 图片来源于Pixabay研究旨在评估暴露于亚致死浓度吡虫啉（LC50/100: 0.014651 ng 吡虫啉 μL?1 饮食）对蜜蜂的大脑中某些蛋白质分布的影响。研究人员通过MALDI-MSI方法对这些蛋白质进行了鉴定。MALDI-MSI技术通过监测特定脑神经在特定时间发生的生物化学过程的时空动态来实现组织原位蛋白质组学分析。为此，研究人员将觅食蜜蜂暴露在含有亚致死浓度吡虫啉的饮食中8天，然后，在暴露的第8天搜集蜜蜂，并使用蛋白质密度图分析它们的大脑。 图：参与学习和记忆获取的酶的MALDI质谱成像结果。（a）蛋白激酶C；（b）14-3-3 Leonardo蛋白；（c）肌动蛋白-5C；和（d）转铁蛋白。 结果表明，吡虫啉的暴露导致了蜜蜂大脑的一系列生化变化，包括突触调节、凋亡调节和氧化应激的改变，这些变化可能对这些蜂群的生理产生不利影响。 最早的质谱成像技术是MALDI质谱分子成像技术，是由范德堡大学（Vanderbilt University）的Richard Caprioli等在1997年提出的。如今，作为质谱最年轻的应用，质谱成像技术已经在医学研究（如癌症病理）、生物学研究（如上述研究所示）、药物研究（如药物代谢）等诸多领域显示了巨大的价值，并得到飞速发展，成为质谱研究的一大热点。基于新一代宽谱定量飞行时间质谱平台QuanTOF，融智生物于2017年推出了QuanTOF质谱成像系统，该系统拥有强大的5,000Hz长寿命半导体激光器，以及自主开发的数据采集软件。2018年7月，融智生物宣布实现可达500像素/秒的成像速率，提升传统MALDI-TOF MS成像速率达10倍以上，普通样本成像只需几十分钟，使得质谱成像实现了“立等可取”。经过进一步的研发，目前QuanTOF质谱成像系统已经实现高达1000像素/秒的成像速率，在5-10微米的高空间分辨率下仍然保持极灵敏度。QuanTOF质谱成像系统使得质谱成像真正可用于临床病理分析、术中分析等领域，为广大人民造福。

气相色谱仪(GC)和气相色谱质谱联用仪分析化合物时，有时候会遇到色谱峰拖尾的问题，不但严重影响定量精度，甚至使分析工作无法进行。那么什么原因会造成色相色谱峰拖尾呢？　　进样口的问题　　1、进样口的温度不合适　　样品使用气相色谱仪分离时，首先进入进样口，在里面进行气化，所以要求进样口的温度要高于待测化合物的沸点，使化合物在进样口处充分气化。如果进样口的温度低于待测化合物的沸点，那么化合物就会气化不充分，也会导致色谱峰拖尾。并且，没有气化的化合物就会残留在进样口，污染进样隔垫和衬管，也可能响到其它化合物的峰形。高温有利用样品的气化，同时，也要考虑到样品的热稳定性，要保证样品在高温下不改变化学性质。　　使用气相色谱仪分离化合物，利用新的隔垫、衬管和柱子时，化合物的分离度和峰形都很好。使用一段时间后，化合物的峰形明显拖尾，这种情况下的主要原因就是进样口和色谱柱有污染。　　2、隔垫和衬管被污染　　进样口很容易被污染的两个部位就是隔垫和衬管。隔垫和衬管被污染后，化合物有可能与污染物结合或者发生反应，也会导致峰拖尾。这时候更换新的隔垫和衬管就会解决峰拖尾的问题。针对很容易拖尾的化合物，可以选择使用超惰性的衬管，不容易与化合物发生反应，有利于化合物的分离分析。必要时，还可以清洗一下衬管下面的分流平板。　　样品的问题　　1、样品浓度太高　　样品浓度太高时，样品的色谱峰就会有明显的拖尾，这种情况下可以稀释样品，或者把样品进样的模式由不分流进样改为分流进样，或者把分流进样的分流比调高一些，例如之前设置进样分流比为10:1，根据样品的实际浓度可以设置为100:1等。　　2、样品的性质问题　　①化合物极性太强　　分析极性化合物或活性化合物时，其活性位点容易与流经途中的位点吸附而呈现出拖尾，这种情况下要求样品分析系统具有良好的惰性，例如使用超惰的衬管、干净的分流平板和惰性好的低流失色谱柱。　　②化合物的沸点太低　　早流出的组分一般是挥发性强、沸点低的组分，这类化合物拖尾严重时，主要原因在于化合物的沸点太低，可能在于溶剂聚焦效应不够，溶剂没有完全冷凝、有部分气化时，样品就进入了色谱柱，这样沸点低的化合物也就先进入色谱柱进行分析了，导致色谱峰拖尾。这种情况下可以降低进样口的温度、调整程序升温的初始温度在溶剂沸点10-25℃以下，让所有的化合物都在冷凝的情况下，整齐划一地进入色谱柱。　　③化合物的沸点太高晚流出的色谱峰一般是低挥发性、沸点高的组分，这类化合物的拖尾现象随着保留时间的增加而严重，主要原因在于化合物的沸点太高，在进样口气化不完全，或者色谱柱和传输线的温度偏低，引起样品在分析的过程中有部分冷凝，进而导致色谱峰拖尾。这种情况下，应该注意化合物的沸点，可以适当地提高进样口、色谱柱、传输线等处的温度可以改善拖尾现象。

贾伟、陈熙沃特世科技（上海）有限公司实验中心氢氘交换质谱法是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术。它在蛋白质结构及动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位及活性位点鉴定方面有着广泛的应用。随着氢氘交换质谱技术的不断发展，它正在成为结构生物学家及生物药物研发的重要手段。 氢氘交换质谱（HDX MS，hydrogen deuterium exchange mass spectrometry）是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术。其原理是将蛋白浸入重水溶液中，蛋白的氢原子将于重水的氘原子发生交换，而且蛋白质表面与重水密切接触的氢比位于蛋白质内部的或参与氢键形成的氢的交换速率快，进而通过质谱检测确定蛋白质不同序列片段的氢氘交换速率，从而得出蛋白质空间结构信息[1]。这个过程就像将握着的拳头浸入水中，然后提出水面并张开手掌。这时，湿润的手背表明它在&ldquo 拳头&rdquo 的结构中处于外表面，而较为干燥的手心表明它是&ldquo 拳头&rdquo 的内部。除样品制备外，氢氘交换质谱法的主要过程包括：交换反应、终止反应、将蛋白快速酶切为多肽、液相分离、质谱检测、数据解析。其中交换步骤需要在多个反应时长下进行，如0s、10s、1min、10min、60min等，以绘制交换率曲线，得到准确全面的信息。氢氘交换质谱技术在蛋白质结构及其动态变化研究[1]、蛋白质相互作用位点发现[2]、蛋白表位及活性位点鉴定方面有着广泛的应用[3]。 与经典的蛋白质结构研究方法相比，如X射线晶体衍射（X-Ray Crystallography）和核磁共振（NMR. Nuclear Magnetic Resonance）等方法，氢氘交换质谱不能够提供精确的蛋白空间结构，它直接提供的主要信息包括哪些氨基酸序列位于蛋白质空间结构的表面位置（包括动态变化中的）、可能的活性位点和蛋白-蛋白相互作用位点等。但是氢氘交换质谱技术有着其他经典方法不具备的优点：首先，可以进行蛋白质结构动态变化的研究是氢氘交换质谱的一个突出优点，包括变化中的活性位点及表位；其次，氢氘交换质谱在蛋白复合体构象的研究中也具有独到的优势；此外，氢氘交换质谱还具有对样品需求量小、纯度要求相对较低、研究对象为溶液环境下的蛋白质的天然构象而非晶体中构象等优势[1,4,5]。自1991年第一篇研究论文发表起，氢氘交换质谱技术不断发展，已经成为结构生物学及质谱技术中一个非常重要的应用领域[6]。但是氢氘交换质谱实验的复杂的实现过程在一定程度上影响了其应用的广泛度。主要的难点有：1、如何避免交换后氘代肽段的回交现象；2、实验控制的高精确性和重现性要求；3、交换后造成的叠加的质谱峰如何准确分辨；4、简易高效的分析软件需求；5、以氨基酸为单位的交换位点辨析。沃特世公司自2005年起，针对以上难点不断进行攻关，推出了目前唯一商业化的全自动氢氘交换质谱系统解决方案&mdash &mdash nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System(图1)。在全世界范围内，这套系统已经帮助科学家在包括Cell、Nature等顶级研究期刊中发表研究论文[7,8]。除科研需求外，沃特世氢氘交换质谱系统也受到众多国际领先制药公司的认可，并用于新药开发中蛋白药物活性位点及表位的研究工作中。氢氘交换实验中的回交现象将严重影响实验数据的可信度，甚至导致错误结果的产生。要避免回交需要做到两点：尽量缩短液质分析时间和保证液质分析中的温度和pH为最低回交反应系数所要求的环境。沃特世UPLC系统采用亚二纳米色谱颗粒填料，较HPLC使用的大颗粒填料，UPLC具有无与伦比的分离度。因此UPLC可以做到在不损失色谱分离效果的要求下，极大缩短液相分析时间的要求[9]。对于对温度和pH控制问题，在多年的工程学改进中，nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System已经实现了对酶切、液相分离等步骤的全程控制[10]。 对氢氘交换质谱实验精确性和重现性的要求是其应用的第二个主要难点。在实验中一般需要采集0s、10s、1min、10min、60min、240min等多个时间点的数据。如果进行人工手动实验，很难做到对10S-10min等几个时间点的精确操作。再考虑到重复实验的需求，人工手动操作会对最终数据可信度产生影响。而且实验过程重复繁琐，将给实验人员带来非常大的工作压力。nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System完全通过智能机械臂，精确完成交换、终止交换、进样、酶切等一系列实验过程，而且始终保证各个步骤所需不同的温度环境。这些自动化过程不但保证了实验数据的可靠性，提高了实验效率，也将科学家从繁琐的重复实验中解放出来。 氢氘交换实验的质谱数据中，随着交换时间的延长，发生了交换反应的多肽，由于质量变大，其质谱信号将逐渐向高质荷比方向移动。因此，这些质谱峰可能与哪些未发生交换反应的多肽质谱峰逐渐叠加、相互覆盖。相互叠加的质谱信号，不但影响对峰归属的判断，更会增加交换率数据的误差。因为交换率判断需要通过对发生交换的多肽进行定量，毫无疑问因叠加的而混乱的质谱数据将极大的影响对质谱峰的准确定量。这点对于单纯通过质荷比进行分析的质谱仪来说完全无能为力。但是，这个看似不可能完成的任务却被沃特世 nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System攻克了。这是因为，不同于其它常见质谱，沃特世的SYNAPT质谱平台还具备根据离子大小及形态进行分离的功能（行波离子淌度分离）。在数据处理时，除多肽离子的质荷比信息外，还可以通过离子迁移时间（离子淌度维度参数）将不同离子区分。因此这种SYNPAT独有的被命名为HDMSE的质谱分析技术可以将因质荷比相同而重叠的多肽分离开，轻而易举地解决了质谱信号叠加的问题，得到准确的交换率数据[11,12]（图2）。SYNPAT质谱平台一经推出就夺得了2007年PITTCON金奖，目前已经推出了新一代的SYNAPT G2HDMS、SYNAPT G2-S HDMS等型号，并具备ESI、MALDI等多种离子源。除氢氘交换技术外，SYNAPT质谱系统在蛋白质复合体结构研究中也是独具特色，已有多篇高质量应用文献发表[13,14,15]。 实现氢氘交换质谱技术的第四个关键点，是如何高效分析实验产生的多时间点及多次重复带来的大量数据。人工完成如此巨大的信息处理工作，将消耗科学家大量的时间。沃特世氢氘交换质谱解决方案所提供的DynamX软件可以为科学家提供简便直观的分析结果，并包含多种呈现方式。 在某些特殊研究中，要求对蛋白氢氘交换位点做到精确到氨基酸的测量，这是氢氘交换质谱研究的又一个难点。在常规的研究中采用CID（碰撞诱导解离）碎裂模式，可能导致氘原子在多肽内重排，而致使不能对发生交换的具体氨基酸进行精确定位。SYNPAT质谱提供的ETD（电子转移解离）碎裂模式可以避免氘原子重排造成的信息混乱，并具有良好的碎裂信号[16]。沃特世的nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System为氢氘交换质谱实验提供了前所未有的简易的解决方案，强有力地推动了氢氘交换技术在蛋白质结构及动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位以及活性位点鉴定方面的应用，正在成为众多结构生物学科学家和生物制药企业必不可少的工作平台。参考文献(1) John R. 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