肽谱分析

中国药典和欧盟药典在蛋白质药物成品检验中规定肽图需要与标准品一致，因为属于鉴别项目，不需要定量比较，所以很多人觉得可以“依葫芦画瓢”尽力就好。事实上，生物类似药的肽谱是需要与原研药完全一致的，另外很多实验员在做肽谱分析时重现性很差，需要实验操作者综合考虑蛋白质本身、实验目的以及预期结果，需要实验员具备优质的样品前处理技术、强大的技术分离能力和信息，才能够获取最佳的蛋白水解消化物分离，并进行肽段的可靠表征分析。所以，别怪我没告诉你，肽谱分析真的“肽”重要了，也是难度很高的一个检测项目。干货太多，今天先从蛋白质酶解的独立开发方案说起。关于蛋白质酶解的独立开发方案，把浓缩过的“精华”给你图为蛋白质酶解的 5 大步骤样品前处理要“量体裁衣”根据蛋白质的大小或结构，样品的前处理方法不尽相同。 在特定的条件下，可能需要进行样品富集，或从所添加的物质和稳定剂（用于产品剂型中）中分离蛋白质，尤其是在这些添加剂会干扰肽谱分析过程时。针对这些流程，现已开发出许多方法，每种蛋白质均具有一套对应的纯化措施或处理方法。但是，酶解前通常会使用一些更常用的方法进行样品纯化，包括去除/富集、透析和凝胶过滤脱盐。去除和富集策略去除和富集策略分别被开发用于去除样品中的高丰度蛋白质或分离目标蛋白质。更多的时候，去除用于蛋白质组学应用，用以降低生物样品（例如，血清）的复杂性，此类样品中含有高浓度的白蛋白和免疫球蛋白。去除策略可以利用免疫亲和技术（例如，免疫沉淀、免疫共沉淀及免疫亲和色谱法）。另一方面，富集技术会根据独特的生化活性、翻译后修饰 (PTM) 或胞内的空间定位分离细胞蛋白的亚类。翻译后修饰（例如磷酸化和糖基化）可使用亲和配体（例如，金属离子亲和色谱 (IMAC) 或固定化凝集素）分别进行富集。为引入独特的蛋白质化学，其他技术需使用代谢或酶促结合修饰后的氨基酸或 PTM。利用透析和脱盐优化样品处理不论是简单的样品还是复杂的样品，常需要通过透析或脱盐对样品进行优化处理，以确保它们酶解过程的兼容性。例如，由于质谱法 (MS) 将测定带电离子，因此必须在 ms 前进行除盐（特别是钠盐和磷酸盐），最大程度减少它们对检测的干扰。透析和脱盐产物可进行缓冲液交换、脱盐或小分子去除处理，以防止对后续过程的干扰。透析是降低样品盐浓度的常规流程。具体步骤是先将样品装入透析袋（袋膜具有特定的孔隙）中，袋口打结，然后将其置入水浴或缓冲液中，通过扩散使盐浓度达到平衡。大分子无法扩散出透析袋，会留在袋内。如果使用水浴，袋内小分子的浓度会缓慢降低直到透析袋内外浓度相同。达到平衡后，即可撕破透析袋，将其中的溶液倒入收集容器中。虽然透析体积可达几升，但对于大量样品却并不实际，因为会需要几天时间才能将盐完全去除。凝胶过滤 (GF) 是最实用的实验室流程凝胶过滤 (GF) 是最实用的实验室流程，可在酶解前对样品进行脱盐。该方法是一种非吸附的色谱技术，可根据分子大小进行分子分离。脱盐可被用于完全去除或降低样品中的盐浓度或其他小分子量成分，而缓冲液的更换则会使用一种新的缓冲液替换样品中的缓冲液。凝胶过滤法是最简单的色谱操作法之一，因为样品均在度洗脱条件下处理。在其分析形式中，凝胶过滤法（也称为体积排阻色谱）可分离分子量差异大于两倍的分子（例如，蛋白质）。在这些应用中，目标分离物质的体积差异非常大（即蛋白质与盐相比）。通过选择凝胶过滤填料，可完全排除较大的分子，同时允许较小的分子自由扩散至 所有的孔隙中。色谱柱使用缓冲液进行平衡，它与样品的缓冲液可能相同，也可能不同。将样品加载至色谱柱后，再添加更多的色谱柱缓冲液（洗脱缓冲液），携带样品分子自上而下地流过色谱柱。较大的分子（不能进入填料的孔隙中）首先从色谱柱中洗脱出来，然后是扩散入孔隙的较小分子，相对于较大的分子，小分子的洗脱时间更长。如果洗脱缓冲液与样品使用的缓冲液不同，则较大的分子会从原始盐中替换出来，并被这种新的缓冲液洗脱，从而从最初的样品缓冲液中完全分离出来。一张图告诉你，化学裂解和酶解怎么选？裂解肽键的方法有两种 ― 化学裂解和酶解，但是到底怎么选，这取决于需要分析的蛋白质和您所期待的结果。一张图告诉你，如何选择酶解试剂。为使蛋白水解酶有效地裂解肽链，需要利用各种试剂对样品进行变性、还原和烷基化。而在酶解的部分还需要对酶解的 PH、酶解时间及温度、还有裂解酶的浓度等因素充分考虑。访问安捷伦《安捷伦生物色谱住关键质量属性应用文集》，了解更多信息。扫描下方二维码，关注“安捷伦视界”公众号，获取更多资讯。

使用超高效合相色谱(UPC2)分析短杆菌肽Sean M. McCarthy, Andrew J. Aubin, 和 Michael D. Jones沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德)应用效益■ 快速分离短杆菌肽■ 载量线性响应■ 准确、高精度分析短杆菌肽的方法■ 有可能用于其它疏水性肽和蛋白质沃特世解决方案ACQUITY UPC2系统ACQUITY SQDACQUITY UPC2 CSH氟苯基色谱柱Empower&trade 3软件关键词超高效合相色谱、UPC2、疏水性肽、短杆菌肽简介用反相液相色谱(RPLC)分析疏水性肽和蛋白质难度很大，因为溶液中经常需要使用洗涤剂保持疏水性物质的稳定性，而这些洗涤剂容易发生聚集和/或沉淀，严重影响它们的回收，这些因素以及其它原因使得难以用RPLC分离疏水性肽和蛋白质。在本应用纪要中，我们为您介绍一种在ACQUITY UPC2TM系统上使用沃特世(Waters)超高效合相色谱技术分离典型跨膜肽-短杆菌肽的方法。短杆菌肽是由芽孢杆菌产生的一种常见和已被良好表征的跨膜肽物质，它被用作对抗革兰氏阳性和某些革兰氏阴性细菌的局部用抗生素，短杆菌肽包括通用组成为甲酰-L-缬氨酸-甘氨酸-L-丙氨酸-D-亮氨酸-L-丙氨酸-D-缬氨酸-L-缬氨酸-D-缬氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-X-D-亮氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-色氨酸-氨基乙醇的一族化合物，其中X取决于短杆菌肽分子，即分别占总短杆菌肽量约87.5%、7.1%和5.1%的革兰氏A(X=色氨酸)、革兰氏B(X=苯丙氨酸)和革兰氏C(X=酪氨酸)，1需要交替的D和L氨基酸单元构成_-螺旋状。我们研究了色谱柱化学品、流动相改性剂和梯度斜率对分离短杆菌肽的影响。采用优化方法分离市场上销售的非处方药物(OTC)，将测定的短杆菌肽浓度与标示量进行对比。采用质谱仪测定短杆菌肽的浓度，采用选择离子谱表征每种物质。在ACQUITY UPC2系统上使用我们的方法，可得到线性和可重复的结果&mdash &mdash 测定的OTC制剂浓度为标示量的98.4%。试验测试条件除非另有说明，以下是用于所有色谱最终方法的最佳条件。UPC2测试条件UPC2系统: ACQUITY UPC2检测器： PDA、ACQUITY SQD PDA @ 280nm,分辨率为6 nm(补偿400至500 nm)色谱柱： ACQUITY UPC2 CSH 氟苯基,3.0 x 100 mm, 1.7 &mu m柱温： 50 ° C样品温度： 15 ° CUPC2 ABPR: 1885 psi进样量： 1 &mu L流速： 2.0 mL/min流动相A： CO2流动相B： 含0.1%TFA的甲醇(除非另有标示)梯度： 20%至30% B，1.5minSQD条件离子源： ES+锥孔电压： 20 V毛细管电压： 3.7kV源温度： 150 ° C脱溶剂气温度： 500 ° C脱溶剂气体流速： 400 L/hr锥孔气体流速： 25 L/hrSIR: 922.6,930.3,941.9数据管理Empower 3软件样品描述用解硫胺素芽孢杆菌(短芽孢杆菌)制备的短杆菌肽从Sigma Aldrich公司购买，将样品溶解在甲醇中制成0.5mg/mL浓度的溶液，如需要，可用甲醇稀释。含有短杆菌肽的非处方软膏是从当地药店购买的。将0.2g软膏溶解在10mL正己烷中，然后用5mL甲醇萃取短杆菌肽，去除甲醇层，用0.2-&mu m的烧结玻璃盘过滤，然后直接进样ACQUITY UPC2系统。结果与讨论我们系统性地筛选了四种色谱柱，测定哪种分离效果最佳，结果如图1所示，色谱柱筛选过程可在1小时内非常快速地完成。在我们设定的筛选条件下，BEH 2-EP和BEH色谱柱未检测到谱峰，由于其它色谱柱表现出合适的色谱性能，因而未对这两者的非洗脱原因深入研究，其中ACQUITY UPC2 CSH氟苯基色谱柱检测的色谱峰形最佳，因此采用该色谱柱继续研究。图1.通过短杆菌肽标准物的色谱峰形和保留时间筛选各种化学特性色谱柱。所有色谱柱规格为3.0x100mm，填装亚-2-微米填料；所有分离条件都采用流动相 A：CO2、流动相 B、含0.1% FA的MeOH、2 mL/min, 3%B至25% B，5min。为了分离短杆菌肽物质，对酸性改性剂的影响进行了研究，结果表明：使用三氟乙酸(TFA)可得到稍好的峰形，提高了短杆菌肽A和短杆菌肽C之间的分离度，结果如图2所示。已知TFA会抑制质谱电离，但每种物质的信号都足以定量检测治疗制剂，后续将对此进行讨论。对于要求更高灵敏度的应用，可能需要降低TFA浓度或使用甲酸，以达到希望的检测限值。图2.酸性改性剂对分离短杆菌肽的影响。当设置好合适色谱条件后，通过减少梯度时间优化分离过程，结果如图3所示，我们能够在1.5分钟时间内使每种短杆菌肽组分的分离度达到1.4或更高，在相同流速下通过减少运行时间增加梯度斜率，不但实现有效分离，同时还将短杆菌肽A的信噪比从336提高至605。图3.UV 280-nm痕量检测优化分离短杆菌肽A、B和C。我们测试了最佳分离条件，能够使用单四极杆质谱(SQD)检测每种物质，图4显示：每种物质都被质谱良好分离和检测到，另外每种短杆菌肽物质都显示含有绝大多数的M+2H离子，后续的研究将使用这些参数进行选择离子监测。图4：每种短杆菌肽物质的总离子图谱-A和加合离子图谱-B-D。选择强度最高的离子评估市场上销售的抗菌制剂中的短杆菌肽含量，对于多肽序列，红色残基是L型同分异构体，黑色残基是D型同分异构体。为了评估我们的方法是否适用于定量分析市场上销售的非处方药中的短杆菌肽，我们在ACQUITY SQD上使用选择离子监测，结果如图5A所示。我们绘制浓度-峰面积曲线，得到每种物质的校正曲线。结果发现：如图5B-D所示，每种成分在测试范围内都呈线性响应。另外还使用校正曲线测定了非处方药物中的每种短杆菌肽物质浓度。图5，图A-25.0、12.5、1.25和0.625mg/mL浓度的标准溶液中含有短杆菌肽物质的叠加选择离子谱。图B、C和D-每种短杆菌肽A、B和C各自的MS峰面积线性拟合图。使用开发的方法评估非处方药物中的短杆菌肽物质的浓度和相对丰度。如图6所示，重复分析结果表明：每种短杆菌肽%RSD值小，计算浓度与标签上的标称值相吻合；我们还发现短杆菌肽物质的相对丰度与文献报道的丰度非常吻合1。图6. 从抗菌软膏中萃取的短杆菌肽A、B和C的叠加选择离子谱重复进样分析的计算RSD值(N=3)在可接受限值以内，计算丰度与文献报道数值非常吻合1。结论正如本应用纪要所展示的，ACQUITY UPC2系统与ACQUITYUPC2色谱柱化学结合使用，可为短杆菌肽提供简单、准确和可重现的分析方法。该工作表明ACQUITY UPC2系统可用于分析疏水性肽，还可能用于分析疏水性蛋白质，例如膜蛋白。参考文献1. The Merck Index and Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals.13th ed. Whitehouse Station, NJ : Merck Research Laboratories 2001.关于沃特世公司 (www.waters.com)50多年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用和可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。2010年沃特世拥有16.4亿美元的收入和5,400名员工，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。联系人：叶晓晨沃特世科技（上海）有限公司 市场服务部xiao_chen_ye@waters.com周瑞琳(GraceChow)泰信策略(PMC)020-8356928813602845427grace.chow@pmc.com.cn

安捷伦科技公司推出 AdvanceBio 肽图分析色谱柱新的 HPLC 和 HILIC 解决方案在生物药物开发中实现更快更稳定的分析 2013 年 5 月 13 日，加利福尼亚州圣克拉拉市 &mdash 安捷伦科技公司（纽约证交所：A) 今日推出 AdvanceBio 色谱柱系列的最新成员。新型 AdvanceBio 肽图分析 BioHPLC 和 ZORBAX RRHD 300-HILIC 色谱柱旨在为各种蛋白质、单克隆抗体、多肽和其他生物制剂的分离、表征和分析提供卓越性能。 两根色谱柱都能让用户体验前所未有的分析速度和高分离度结果。 安捷伦化学品业务部副总裁兼总经理 Anne Jones 说：&ldquo 我们非常高兴能够为我们的制药客户和其他生命科学研究人员推出这些潜力无限的新型色谱柱，成就他们对极致分析灵敏度和速度的追求。我们始终致力于提高生物色谱法的准确度和效率，可以从这些产品身上得到印证。&rdquo 新型 AdvanceBio 肽图分析色谱柱能够快速测定蛋白质的一级结构，还能以无与伦比的速度和灵敏度鉴定变异。事实上，与使用全多孔 HPLC 色谱柱进行常规肽图分析相比，使用该色谱柱得出准确结果的速度要快二至三倍，而常规肽图分析耗时长达 60 分钟。 每批 AdvanceBio 图谱分析柱均采用多肽混合物标样进行严格测试，确保适用性和高重现性，使其能鉴定复杂多肽图谱中的重要多肽。所有可用色谱柱可耐压 600 bar，使 UHPLC 仪器发挥出最佳性能。同时，用于 400 bar 的旧型号仪器时也有卓越表现。 应用 AdvanceBio 肽图分析色谱柱非常适合分析高度复杂的肽谱，能为许多蛋白消化物，包括 rhEPO 提供 100% 序列覆盖率，有 45 糖肽匹配。应用简报使用 Agilent AdvanceBio 肽图分析色谱柱进行 EPO 的高分辨率糖肽谱分析中对这些功能进行了一一探索。 ZORBAX RRHD 300-HILIC 色谱柱是目前市面上仅有的亚 2 &mu m、300Å HILIC 色谱柱。专门为寻求更快、更高分离度分离多肽、极性糖肽、蛋白质、抗体、偶合物、新生物体和生物制药的用户而设计。 亲水相互作用液相色谱 (HILIC) 专门针对亲水性糖肽变异体分析。使用该色谱分析极性糖肽可得到出色的峰形，而如果采用反相色谱柱分析则只能得到有限的保留率和分离度。1.8 &mu m 填料的 ZORBAX RRHD 300-HILIC 色谱柱能够实现耐压 1200 bar、快速分析以及卓越的准确度。它们为反相 HPLC 提供了正交和互补分离。应用简报利用 HILIC 和反相色谱分析促红细胞生成素的糖肽和糖型中深入探讨了这些功能。 关于安捷伦科技 安捷伦科技（纽约证交所：A) 是全球领先的测试测量公司，同时也是化学分析、生命科学、诊断、电子和通信领域的技术领导者。公司拥有 20,500 名员工，遍及全球 100 多个国家，为客户提供卓越服务。在 2012 财年，安捷伦的净收入达到 69 亿美元。如欲了解关于安捷伦的详细信息，请访问：www.agilent.com.cn。