流动式细胞仪

德国ibidi的ibiPore可以实时观察流动、剪切情况下的细胞侵袭、迁移、细胞相互作用等实验。对实验结果进行观察统计时，不需要将膜取下，也不需要将另一边的细胞擦掉（经常将膜擦破，导致实验失败），可直接将μ-Slide放于显微镜下观察统计。细胞可以通过两种方式，选择贴壁于氮化硅膜的上下两侧。可以把细胞种植在膜下边，避免自由落体的说法，大大提高了实验的准确性。21世纪注定是一个生命科学的世纪，科研工作者们如果想在这个世纪去决胜，能做到一点，不仅要好的idea，领先的技术，更需要得心应手的好工具。所谓工欲善其事必先利其器，今天为大家介绍德国ibidi的μ-Slide ibipore SiN (图1), 一款具有多孔氮化硅膜的μ-Slide载玻片，可用于实时观察流动、剪切力条件下的细胞侵袭、迁移以及细胞相互作用的可视化的“ transwell ”，更多应用请参阅文中（Intended Use的相关内容）。图1. ibipore及ibipore SiN氮化硅膜培养细胞的染色结果。图片背景为在ibipore氮化硅膜上培养细胞的荧光染色结果，规则排布的白色圆点为氮化硅膜的孔隙ibipore有上下两个独立的通道（见图2），两个通道 overlap 的区域由一个孔径大小均一的氮化硅膜隔离开（见图3）。两个通道可以分别培养细胞，通过两种方式，细胞可以贴壁于氮化硅膜的上下两侧。在细胞侵袭实验中，普通的transwell只能将细胞培养在上侧，这样所得到的实验结果并不能明确的说明是由于重力作用还是侵袭能力本身造成的。而ibipore考虑到这一因素，建议实验者在氮化硅膜的下侧进行细胞培养，检测细胞向上侧通道进行迁移的能力，进而巧妙的排除了重力作用对侵袭实验的影响。配合ibidi流体剪切力系统以及加热孵育系统，可以在流动、剪切力条件下实时的观察细胞的侵袭以及迁移等实验。德国ibidi公司为满足不同实验的需求设计了不同孔径的氮化硅膜（见图4）。ibipore与传统的transwell实验最大区别有三点：①. ibipore可以在上下两个通道中培养细胞，这样可以观察细胞向上的侵袭情况，排除以往实验中重力作用的影响；②. ibipore中间的氮化硅膜具有良好的光学特性，可以实时成像观察侵袭情况，也可以进行免疫荧光染色实验；③. ibipore可以配合ibidi流体剪切力系统，观察淋巴细胞等在流动状态下的侵袭情况。ibipore产品介绍ibipore产品特点：* 透过薄而多孔的薄膜获得卓越的光学性能* 有着广泛的应用，细胞可完全粘附到顶部-基底* 对于不同细胞类型有多种孔径大小可以选择应用：1.流动状态下跨内皮细胞迁移2.2D或3D凝胶内细胞层的共培养和传输分析3.顶部-基底细胞极性分析4.顶部-基底梯度的细胞屏障模型分析5.细胞迁移分析（例如，用于研究肿瘤侵袭或转移）在μ-Slide ibiPore IV型胶原涂层3μm孔径中人类内皮细胞的免疫荧光染色，相位对比度、DAPI（蓝色）、VE钙粘蛋白（绿色）和F肌动蛋白（红色）的叠加图像。技术特点：1.SiMPore的微孔氮化硅膜2.中间具有多孔光学膜的跨通道结构3.优异的光学性能，堪比盖玻片4.孔径大小0.5μm，3μm，5μm，8μm供选择5.中间膜0.4µ m（400 nm）6.使用工作距离0.5mm的物镜7.与ibidi泵系统（流体剪切力系统）完全兼容8.下部通道中明确的剪切力和剪切速率范围µ -Slide ibiPore SiN工作原理µ -Slide ibiPore SiN由插入两个通道之间的水平多孔膜组成。上部通道是膜上方的静态储液池。下部通道是灌注通道，用于对附着在膜上的细胞施加限定的剪切应力。上部通道和下部通道仅通过隔膜彼此连通。图2. ibipore组成示意图多孔膜由氮化硅（SiN）制成，这种材料具有非常高的化学和机械稳健性。400nm厚的氮化硅膜非常适合成像和显微镜观察，没有任何自发荧光或透明度问题（如玻璃）。SiN材料可以直接用于贴壁细胞培养，也可以选择用ECM蛋白包被。应用建议：孔径 & 孔密度什么是孔密度孔密度是指膜的空隙体积分数。是孔隙的体积除以膜的总体积。下面的图形为采用相同的放大倍数。图3. 不同孔径的氮化硅膜不同应用的建议孔径：不同的细胞大小和直径不同，根据具体实验请选择不同孔径图 4. 为不同应用推荐的不同孔径的氮化硅膜Intended Use经证实的应用这些应用已由ibidi研发团队或者我们的用户进行过试验。Endothelial Barrier Assays内皮屏障分析在膜一侧培养单层细胞。细胞可以在静止或者流动剪切力条件下培养。Co-Culture and Cell Barrier Assay共培养和细胞屏障分析在膜的两侧分别培养单层细胞。通过这种方法可以进行信号传递、共培养以及迁移实验（例如，分析药物通过上皮或内皮屏障的传递）。Apical-Basal Cell Polarity Assays顶端-?基底端细胞极性分析3D凝胶基质中的化学因子可以导向在膜另一侧培养的单层细胞的极性发生。Potential Use潜在应用以下示例将讲述该产品进一步的潜在应用。ibidi仍需在内部测试这些应用，因此我们无法提供特定的实验方案。但是，从技术角度来看，这些应用应该是可行的。Trans-Membrane Migration in 2D/2D跨膜迁移在膜的一侧培养单层细胞。可以观察悬浮的白细胞在流动状态下的滚动、粘附以及侵袭情况。Cell Transport in a 3D Gel Matrix细胞在3D凝胶基质中的传递3D凝胶基质中的细胞迁移：在流动状态下，观察白细胞的滚动、粘附以及向3D凝胶基质中肿瘤细胞方向的迁移情况。Application Examples 应用实例MDCK和NIH-3T3细胞的相差显微镜观察Madin-Darby犬肾（MDCK，左）和NIH-3T3（右）细胞在μ-Slide ibiPore SiN，孔径0.5μm的玻片中，无蛋白质包被。接种后，将细胞在静态条件下在培养箱中保持20小时。相差显微镜，4倍物镜。请注意，这张图像中的中心多孔区域看起来更暗，因为0.5μm的孔隙无法用低分辨率物镜分辨。流动条件下HUVECS的相差显微观察人脐静脉上皮细胞（HUVEC）在μ-Slide ibiPore SiN中，孔径3μm的玻片中，有纤连蛋白包被。将细胞接种并在具有ibidi泵系统/流体剪切力系统的流动条件（10达因/cm2）下在培养箱中保持12小时。固定后的相位对比显微镜，10倍物镜。流动下HUVECs F肌动蛋白细胞骨架的荧光显微镜观察人脐静脉上皮细胞（HUVEC）在μ-Slide ibiPore SiN，孔径5μm玻片中的免疫荧光染色，有纤连蛋白包被。将细胞接种并在具有ibidi泵系统/流体剪切力系统的流动条件（10达因/cm2）下在培养箱中保持12小时。绿色：肌动蛋白（鬼笔肽），蓝色：细胞核（DAPI）。荧光显微镜，20倍物镜。选择指南：ibidi跨膜分析实验解决方案参考文献：Salvermoser, Melanie, et al. "Myosin 1f is specifically required for neutrophil migration in 3D environments during acute inflammation." Blood, The Journal of the American Society of Hematology 131.17 (2018): 1887-1898. 10.1182/blood-2017-10-811851Rohwedder, Ina, et al. "Src family kinase-mediated vesicle trafficking is critical for neutrophil basement membrane penetration." Haematologica (2019). 10.3324/haematol.2019.225722Non-Recommended Applications不建议的应用因技术原因，本产品不适用于以下应用，应避免使用.本产品不适用于：1.上通道灌流2.两个通道的灌流3.跨膜流动4.筛选应用订购信息

流式细胞仪在生命科学领域尤其医学中应用非常广泛，是一种能够对细胞进行相关处理的仪器，并且能够对细胞进行必要的分析。小编为大家介绍一下流式细胞仪的概念、发展历史、特点、分类、基本原理以及应用。　　流式细胞术与流式细胞仪的概念　　流式细胞术(flow cytometry , FCM)：是一种定量分析技术，是指利用流式细胞仪检测细胞特异性标记荧光信号而测定细胞的多种生物物理性质的方法，同时也是一项可以把具有某相同荧光信号特性的某些细胞亚群从多细胞群体中分离和富集出来的细胞分析技术。点击查看更多细胞流式仪　　流式细胞仪(flow cytometer)：是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术和抗原抗体检测技术为一体的新型高科技仪器 是以激光为光源、检测生物学颗粒理化性质的仪器。　　流式细胞仪的发展历史　　1、1934年，Moldavan使悬浮的红细胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来。这就是流式细胞仪的雏形。　　2、1965年，Kamentsky用紫外吸收和可见光散射两个参数同时测量未染色细胞，给出细胞中核酸的含量和细胞大小。奠定了多参数流式细胞测量的基础。　　3、1967年，Van Dilla和Los Alamos采用了层流流动室和氩激光器，开发出了液流束、照明光轴、检测系统三者相互垂直的流式细胞仪。这成为目前各种流式细胞仪的基础。　　4、1969年，Fulwyler利用静电墨水喷射液滴偏转技术，建立了流式细胞分选术。Ehrlich和Wheeless利用飞点扫描技术和缝扫描技术使零分辨率的流式细胞仪变成了低分辨率的流式细胞仪。　　5、20世纪70年代，随着Kohler和Milstein成功提出了单克隆抗体技术和荧光标记技术，为特异研究和分析细胞奠定了良好的基础。　　6、1973年，美国BD公司和美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界上第一台商用流式细胞仪FACS I。　　7、20世纪80年代，流式细胞仪的数据采集、存储、显示、分析日趋完善，随着样品制备方法的增加，新的荧光染料和细胞标记物的出现，使流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。　　8、20世纪90年代，与之配套的标本制备仪和自动进样器的问世，以及适合临床应用的单克隆抗体的增加，使流式细胞仪逐渐从科研单位进入医院的中心实验室和检验科，成为现代化的临床检验仪器的一部分。　　流式细胞仪的特点　　1、高速度：每秒可检测1 000-5 000个细胞。　　2、高灵敏度：每个细胞只要带有1 000-3 000个荧光分子就能检出，两个细胞之间有5%的差别就可区分出来，光散射的灵敏度为0.3um。　　3、高精度：在细胞悬液中测量细胞，比其他分析技术的变异系数更小，分辨率高。　　4、高纯度：分选细胞的纯度可大于99%以上。　　5、多参数：可同时定量检测单个细胞的DNA等多个参数。　　流式细胞仪的分类　　1、根据功能不同，可分为临床型和综合型(科研型)。　　2、根据有无细胞分选功能，可分为流式细胞分析分选仪和流式细胞分析仪。　　3、根据结构不同，可分为一般流式细胞仪(零分辨率流式细胞仪)和狭缝扫描流式细胞仪(高分辨率流式细胞仪)。前者的激光光斑为椭圆形，光斑直径大于被检细胞体积。后者激光光束为一条线状扁平光斑，直径在3-5um。　　流式细胞仪的基本原理　　1、将悬浮分散的单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后，放入样品管。　　2、在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，流动室充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出，成为细胞液柱。　　3、液柱与水平方向的入射激光束垂直相交，相交点称为测量区。通过测量区的细胞受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被成90℃角方向放置的光电倍增荧光检测器和前向角放置的光电二极管检测器接收，经过转换器转换为电子信号。　　4、电子信号经模/数转换输入计算机。计算机通过相应的软件储存、计算、分析，就可以得到细胞的大小和活性、核酸含量等理化指标。　　流式细胞仪的应用　　1、DNA倍体分析　　DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。特别地，它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。　　在该领域Partec公司的 CyFlow PA是一枝独秀。　　2、细胞生存能力实验　　使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合，后因细胞活力不同染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。　　3、计数外周血中检测网织红细胞　　使用TO染料能够特异性地与RNA结合，结合系数高达3000，故具有很好的性价比。　　4、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数，临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定。使用标准ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE标记CD34抗体，PE-CY5标记CD45抗体。　　5、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验　　检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义，因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体。　　6、血小板自身抗体检测　　血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。　　7、移植交叉配型　　原细胞毒实验，主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击，作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。　　8、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况：FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。　　9、细胞增殖状态检测　　核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量细胞增殖分裂状况，在评估肿瘤预后有重要意义。为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测。FITC标记PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或(并)PE-CY5标记细胞表面标志物。　　10、染色体分析　　流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料：Hoechest33258与核苷酸AT结合 Chromomycin A3与GC相结合。从而在双参数坐标上根据染色体ATCG含量的不同识别各种染色体。平时进行的染色体分析耗时且需要操作者极具经验，而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体，如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析。　　以上，就是小编为您介绍的流式细胞仪的概念、发展历史、特点、分类、基本原理以及应用。如今医疗的进步离不开医疗设备的发展与进步，流式细胞仪就是集中于测量发育异常的细胞遗传物质的数量变化，该设备的鉴定对种质资源、物种进化、物种分类、生态学研究、倍体育种等方面具有重要意义。

随着单细胞测序技术的快速发展，科研工作者们可对每个独一无二的单细胞进行分析，认识到细胞间的异质性，深入了解如胚胎发育早期的分化特征、肿瘤微环境中的非均质性、罕见循环肿瘤细胞的转录组等等以往传统高通量测序方法难以攻克的领域。单细胞分析的应用已进入百花齐放的时代，涵括神经生物学、癌症、免疫学、微生物学、胚胎发育、临床诊断等多个领域。单细胞测序分析的第一步，即是单细胞样品的制备，同时确保其生物完整性不被破坏。高质量的样品制备影响着后续单细胞分析成功与否。高活性、无细胞碎片且均一的单细胞悬液可使测序结果在完整性、真实性、数据可重复性得到提升。最常见细胞分离的方法可用MACS磁珠或流式细胞仪进行目的细胞分选与富集。单细胞测序流程利用流式细胞分选法富集目的细胞群体缩小研究范围，对单细胞群体可进一步精细化解读。尤其在研究罕见细胞族群，单细胞测序前先以流式细胞分选富集稀有细胞，可大大增加实验数据真实性与可靠性。现今已有愈来愈多单细胞测序研究结合流式细胞分选，筛选目的细胞、过滤死细胞减少样本中無效细胞的比例，提高单细胞文库构建的成功率以及后续的数据质量，让单细胞测序更有深度与广度分析实验数据，推动进一步研究范畴。传统高压液滴分选仪分选单细胞传统液滴式流式细胞分选(Droplet cell sorter)，将目的细胞利用适宜的荧光标记。经荧光染色或标记的单细胞悬液，被高压压入流动室内，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。通过相应荧光检测及充电，获得目的细胞，实现单细胞分离。然而操作过程中，分选的细胞相继受到高压、充电带有电荷、减压的刺激，常导致分选的目的细胞在分类过程中的损伤和溶解，活细胞回收率不高；即使回收的活细胞也因分选过程受刺激影响细胞基因转录图谱表现，无法维持其生物完整性。传统高压液滴分选仪进行单细胞分选Adapted from Technologies for Single-Cell IsolationInt. J. Mol. Sci. 2015, 16美天旎MACSQuant Tyto 革命性的细胞分选仪专利的微芯片技术，精准地控制阀门开合以进行细胞分选，该仪器的特性在于整个分选过程在一次性使用的全封闭样本舱(cartridge) 中进行，且无需鞘液、避免了样本污染和残留风险。上样简单、自动进行分选设置，无需操作人员进行高强度与长时间的培训就能轻松操作。由于实际分选过程都在样本舱进行，不会损失珍贵的样本材料；阳性和阴性分选组份均可在无菌洁净操作台内轻松回收。细胞不会受到高压、电荷及减压刺激，不同于传统的液滴分选仪，这种温和的分选方法可最大保持细胞活性和功能，即使经过多次分选，细胞活性也不会受影响，充分表明这种阀门介导的分选机制具有温和性质。美天旎MACSQuant Tyto细胞分选仪与样本舱功能示意图。A. 美天旎MACSQuant Tyto细胞分选仪；B. 样本舱；C.独特微芯片技术的分选示意图。单细胞测序前，使用美天旎MACSQuant Tyto细胞分选仪（MQ Tyto）进行目的细胞分选富集。分选过程不受到高压、电荷、减压与剪切力刺激，作用温和不影响细胞生物功能完整性，维持细胞基因转录图谱表现，提高细胞存活率与回收率。位于美国加州大学(University of California, Irvine- UCI)的Dr. Kai kessenbrock研究团队致力于研究机体正常组织内环境稳态和乳腺癌中的细胞通讯。他们在单细胞水平上系统性分析研究乳腺干细胞微环境(stem cell niche)中细胞通讯的机制和乳腺上皮組織内的异质性，进一步加深对早期肿瘤发生过程中系统性变化的理解；最终目的是开发用于早期检测的生物标记物以及改善乳腺癌的治疗策略。Dr. Kai kessenbrock团队在FVB小鼠取出小鼠乳腺组织，分别以美天旎MACSQuant Tyto细胞分选仪(MQ Tyto)与传统液滴式流式细胞分选(Droplet cell sorter)分离乳腺上皮细胞(CD49f+/EpCAM+)后，标记建库并进行单细胞测序；比较两种不同的流式细胞方法分选后，所获得的测序数据真实性与可靠性，也进行分选后的细胞培养，观察细胞存活与功能。小鼠乳腺上皮细胞分离与单细胞建库 (Data kindly provided by Quy Nguyen, UCI)1. MQ Tyto可有效分选出不同乳腺上皮细胞亞型（Luminal 1, Luminal 2, Basal-like subtypes），基因转录图谱完整呈现。聚类分析与差异基因热图展示2. 经由MQ Tyto分选，每个单细胞可捕获更多的mRNA数量(UMI)，获得更多可分析的基因数(Genes)；显示MQ Tyto保留了细胞的完整性。质控图3. 传统液滴式流式(Droplet cell sorter)细胞分选后细胞应激基因表现明显上调。这主要是来自于细胞分选操作过程中所受到的外力刺激，而非原始组织环境细胞的真实表现。应激基因表现量展示4. 细胞分选后，持续培养七天乳腺上皮细胞并形成乳腺球(mammosphere formation)进行计数。结果显示MQ Tyto组形成更多的乳腺球，表示其MQ Tyto分选后的上皮细胞维持其功能性与高存活率。综上，利用MQ Tyto对目的细胞进行分离与富集，作用温和不影响细胞生物功能完整性，维持细胞基因转录图谱表现，提高细胞存活率与回收率，开启单细胞测序成功的第一步。