组织包埋

包埋盒五大使用方法1.取材时将组织块放于写有该组织编号的一次性包埋盒中,上盖(不锈钢)脱水盒盖,放入脱水篮中进入脱水机或手工脱水。 2.将包埋底模存于烤箱的下层(或单独的一层)。 3.包埋时将脱好的组织连同脱水篮也放在内有包埋盒底模的同一烤箱内。打开脱水盒盖,将脱水盒盖放在一边,根据组织块大小选取包埋底模,用镊子在酒精灯上加热,夹取组织块放于底模内,上覆装组织脱水的写有该组织块编号的一次性包埋盒,倾倒石蜡少许,以不溢出为宜,少置片刻。 4.把冰箱冷冻室内的冰盒取出,将包埋好的蜡块,放于冰盒冷冻片刻约5min10min,冬季时间短,夏季时间长些,将蜡块从底模中取出,收集其余蜡块,将包埋盒两边的多余蜡除去,即可切片。 5.包埋盒底模及脱水盒盖分类整理好重新放入烤箱备用,本科把脱水盒盖装在脱水篮中,在下一次用之前用热水将蜡冲去即可再用。 通过这种方法不仅利于蜡块的保存,也节约了石蜡。

常用包埋剂及配方目前在电镜技术上使用的包埋剂种类颇多，但普遍使用的是环氧树脂，在免疫和细胞化学技术中还会使用到丙烯酸树脂。 环氧树脂（epoxy resin） 环氧树脂是一类具有末端环氧基的甘油多聚酯。它的分子中有两种反应基团，即环氧基团（epoxide group）和氢氧基团（hydroxyl group）。其末端基团易与含有活性氢原子的化合物如胺类（如DMP-30，DMAE，乙二胺等，又称催化剂或加速剂）反应，使单体首尾相连接形成长链聚合物。此外，在单体中的氢氧基团能与有机酸酐（如MNA，DDSA，九烷基琥珀酸酐，NSA等，又称硬化剂或固化剂）结合，使单体分子形成横桥。所以，环氧树脂以单体渗入细胞组织，而这种单体在一定的温度条件下，在硬化剂和加速剂作用下，就形成一个非常耐溶剂和耐化学腐蚀的交链稳定的三维空间聚合体。为了改善聚合体（包埋块）的切割性能，还会在环氧树脂包埋配方中加入增塑剂，以调节包埋块的韧性。 环氧树脂包埋剂对细胞微细结构有较好的保存性能，聚合后体积缩小较少，而且在真空中能经受较长时间的轰击。但它的操作不太方便，反差较弱。 环氧树脂的型号较多，常用Epon812，Spurr树脂（ERL-4206）等，现介绍最常用的两种环氧树脂 Epon812包埋剂 Epon812是一种进口树脂，它是一种长链的脂肪族环氧化合物，是目前国际上普遍采用的一种优良包埋剂，粘度为150-210cP。该包埋剂的配制方法甚多，但一般都按1961年Luft提出的配方进行。其配方如下： A液：Epon812 62ml DDSA 100ml B液：Epon812 100ml MNA 89ml上述配方若改变A液和B液的比例则可调节聚合块硬度，A液多则软，B液多则硬。通常冬天使用$A:B=2:8$；夏天使用$A:B=1:9$，可视组织的硬度和气候不同选择其比例。配制时可先分别配制A液和B液，然后将A液和B液按一定比例混合后，再加入$1\%-2\%$的加速剂，边加边搅拌，使其充分混合。为了方便操作，也有人将Epon812，DDSA，MNA三种成分按一定比例直接混合使用。Epon812的聚合温度为：37℃过夜，60℃24-36小时。 根据南方地区的气候条件，可用下列配方：Epon812 51ml DDSA 12ml MNA 37ml DMP-30 1.8-2ml聚合条件&室温过夜，60℃8-12hDDSA是十二烷基琥珀酸酐（Dodecenylsuccinic anhydride）的简称。它是一种可得到软性包埋块的长链脂肪族分子。 MNA是甲基内次甲基二甲酸酐（Methyl Nadic anhydride）的简称，又称六甲酸酐，它有两个链环，能获得较硬的包埋块。 DMP-30是2，4，6-三（二甲基氨基甲基）苯酚（2，4，6-Tris（dimethylaminomethyl）phenol）的简称。它能加速固化过程。 Spurr树脂（ERL-4206包埋剂） 这是1969年由Spurr推荐使用的包埋剂，所以也称Spurr树脂。它含有两个环氧基，是一种低粘度的环氧树脂。由于具有粘度低的特点，所以近年来一些实验室已开始使用它。其配方可按下表中各种成分的比例，即可获得不同性能的包埋块。其配方如下： Spurr树脂包埋剂配方 成分（g）标准硬度 硬 软 快速聚合配方 缓慢聚合配方 VCD 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 DER-736 6.0 4.0 7.0 6.0 6.0 NSA 26.0 26.0 26.0 26.0 26.0 DMAE 0.4 0.4 0.4 1.0 0.2 聚合时间70℃（h） 8 8 8 3 16 混合时间（天） 3-4 3-4 3-4 2 7 VCD是二氧化乙烯环己烯（vinylcyclohexene dioxide）的简称。它的分子小，粘度低，聚合块硬度大。 DER-736是diglycidyl ether of a polypropylene glycol的简称。它属于脂肪族，分子小，有低粘度性质，可调节包埋块的硬度。 NSA是nonenylsuccinic anhydride的简称。它是一种特殊的硬化剂，应避免暴露在潮湿的大气中，以防环氧或酐链的水解作用。 DMAE是dimethylaminoethanol的简称。它是催化剂，增加催化剂的比例，可以缩短聚合的时间。 Spurr树脂最终硬度可用DER-736的量来调节。配制时，先把前三种成分混合后，最后才加入DMAE，但从开始到混合完成，达到淡黄色状态需3-7天。此包埋剂在$70\,^{\circ}\mathrm{C}$，一般8小时即可完全聚合，用陈旧的包埋剂时，则聚合时间会减少。因Spurr树脂嗜氧，聚合时不要加盖。包埋剂最好是用新鲜配制，但为了方便，可预先配制好保存在低温和防潮的环境中。Spurr树脂与Epon812树脂相比粘度低，操作方便，但毒性比Epon812树脂大，所以操作时要更加小心，此外，Spurr树脂各成分间的分子量大小差异较大，在组织中的渗透速度不一，容易个别成分造成渗透不均，而导致局部聚合不完全，染色效果不佳。 丙烯酸树脂（acrylic resin） 丙烯酸树脂无色透明的，由丙烯酸衍生物聚合而成。丙烯酸单体粘度低，可以在低温下渗透及聚合，因而能满足免疫和细胞化学技术低温操作的要求。其聚合方式有两种，热聚合和紫外线照射聚合。但它对脂类等成分的抽提比环氧树脂严重，为此它也需要在较低的温度下使用才可能减少抽提作用。此外，聚合前后丙烯酸树脂的体积变化较环氧树脂大（体积大约收缩$10-20\%$），并且它在电子束的照射下稳定性比环氧树脂低，放热的聚合过程可引起组织细胞结构的损伤，致敏性也比环氧树脂强，使用时要小心防护。一般来说，除了免疫和细胞化学技术外，超微结构的研究并不推荐使用它。在电镜中使用较多的丙烯酸树脂有伦敦白胶（LR White）和Lowicryl系 列的树脂。 伦敦白胶（LR White） 伦敦白胶含有7种不同的丙烯酸单体和2种增塑剂，引发剂是BPO（dibenzoyl peroxide），加速剂为N，N-dimethyl paratoluidine，但具体的配方和成分没有报道。它的粘度低，渗透能力强，可用于较大的组织块或致密的组织，由于它有一定的亲水性，方便水性染料进入，染色效果佳，使用非常方便，通常买回来的是已经混合好的试剂，它的有效期仅为12个月。伦敦白胶可以微溶于水，因而可以采用部分脱水方案，但不能使用丙酮作为脱水剂。氧气会抑制聚合反应的进行，因而聚合时要在模块中注满包埋剂并盖紧盖子。为了方便运输和储存，也有未加BPO的伦敦白胶（uncatalysed LR White）出售，这种试剂需要加入催化剂（9.9g催化剂/500gLR White）充分搅拌并室温放置24小时以上才能使用。Lowicryl系列包埋剂 Lowicryl系列包埋剂是专为低温包埋设计的包埋剂。它有两种类型：一种是极性树脂，K4M和K11M；另一种是非极性树脂，HM20和HM23。极性树脂亲水，使样品保存在一个水性的环境中从而较少蛋白质变性，且染色的效果较好。而非极性树脂的切割性能比较好。两种树脂通常都在隔绝氧气的情况下低温紫外线照射聚合。Lowicryl系列包埋剂全部以试剂盒的形式出售，有详细的说明书提供参考。