小鼠小胶质瘤细胞的培养操作步骤及应用研究！

                   小鼠小胶质瘤细胞的培养操作步骤及应用研究！

一、背景

小鼠小胶质瘤细胞是由E·Blasi建立于1990年；此细胞源自C57BL/6小鼠小胶质细胞。由小鼠小神经胶质细胞经逆转录病毒介导转染v-raf/v-myc获永生化。BV-2细胞保留有小神经胶质细胞多种形态、表征和功能特征；免疫组化结果显示，BV-2细胞为MAC1、MAC2阳性；而MAC3、胶质细胞原纤维酸性蛋白、半乳糖脑苷脂为阴性。膜表面表达envgp70抗原；在形态学、表型及功能上有吞噬细胞的特征。

二、小鼠胶质细胞瘤培养步骤

1、小鼠胶质细胞瘤培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；2mM L-谷氨酰胺;10mM HEPES;双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

三、应用

小鼠小胶质瘤细胞可以用于杨梅黄酮对小鼠及人脑胶质瘤细胞体外抑制作用的研究：

应用小鼠脑胶质瘤GL261细胞及人神经胶质瘤U251细胞通过体外实验探究杨梅黄酮对胶质瘤细胞的抑制作用。主要从以下三个方面进行研究,分别是杨梅黄酮对GL261细胞与U251细胞增殖及凋亡的影响;杨梅黄酮对胶质瘤细胞迁移及侵袭能力的影响;杨梅黄酮对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外成管能力的影响。为进一步研究杨梅黄酮对胶质瘤的治疗作用及机制奠定实验基础。

（一）杨梅黄酮对胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响

1、杨梅黄酮对胶质瘤细胞活性的影响通过CCK-8实验检测杨梅黄酮对GL261细胞与U251细胞活性的影响。结果显示,对于GL261细胞,杨梅黄酮在浓度为20μM时即可对其活性产生抑制作用,与对照组相比有统计学差异(p<0.01),随浓度升高,抑制作用更明显,并且作用48h表现出比作用24h更强的抑制作用。对于U251细胞,在杨梅黄酮浓度为240μM时对其活性产生抑制作用(p<0.05),随浓度增加,抑制作用更明显,并且作用时间延长(48h)也可增强其对U251细胞活性的抑制作用。说明杨梅黄酮对胶质瘤细胞的活性抑制作用具有剂量-时间依赖性。

2、杨梅黄酮对胶质瘤细胞增殖的影响通过流式细胞术检测杨梅黄酮对两种细胞周期的影响。结果显示,杨梅黄酮可增加两种细胞G1期的比例,将细胞周期阻滞于G1期,从而抑制细胞的增殖。进一步通过Western-blot实验检测细胞周期蛋白,结果显示杨梅黄酮可抑制U251细胞周期蛋白Cycline D1的表达。

3、杨梅黄酮对胶质瘤细胞的凋亡诱导作用通过Hoechst 33342染色观察杨梅黄酮对GL261细胞与U251细胞的凋亡诱导作用。荧光显微镜下观察可发现杨梅黄酮可使两种胶质瘤细胞凋亡小体出现的比例增加。进一步通过流式细胞术检测杨梅黄酮对GL261细胞与U251细胞凋亡的影响,结果显示,杨梅黄酮可增加两种细胞早期凋亡与晚期凋亡细胞的比例,与相应的对照组相比均有统计学差异(p<0.05),说明杨梅黄酮可诱导胶质瘤细胞的凋亡。

（二）杨梅黄酮对胶质瘤细胞迁移及侵袭的影响

1、杨梅黄酮对GL261细胞与U251细胞迁移的影响利用Transwell实验检测杨梅黄酮对GL261与U251细胞迁移的影响。结果显示,对于GL261细胞,杨梅黄酮浓度在5μM时即表现出对其迁移的抑制作用(p<0.05)。并且随浓度增加,抑制作用更明显。对于U251细胞,在杨梅黄酮浓度为100μM及200μM时,均表现出与平行对照有统计学差异(p<0.001)的对U251细胞迁移的抑制作用。

2、杨梅黄酮对GL261细胞与U251细胞侵袭的影响为研究杨梅黄酮对胶质瘤细胞侵袭的影响,我们在Transwell小室底部铺上Matrigel以模仿细胞外基质,然后进行实验。

结果显示,杨梅黄酮可减少穿过小室的GL261细胞与U251细胞的数目,与相应的对照相比,细胞数目差异具有统计学意义(p<0.05)。通过逆转录PCR检测杨梅黄酮对胶质瘤细胞MMPs m RNA转录水平的影响,结果显示杨梅黄酮可降低GL261细胞内MMP-2、MMP-9的m RNA水平,也可降低U251细胞内MMP-2、MMP-9以及MMP-14的m RNA水平,与相应的对照组相比有统计学差异(p<0.05)。

（三）杨梅黄酮对HUVEC体外成管能力的影响利用CCK-8试剂盒检测杨梅黄酮对HUVEC增殖的影响,通过HUVEC的迁移及在Matrigel上成管检测杨梅黄酮对HUVEC成管能力的影响。

结果显示,杨梅黄酮可抑制HUVEC的增殖,且具有剂量-时间依赖性。划痕实验显示,同对照组相比,杨梅黄酮可抑制HUVEC的迁移(p<0.001)。在成管实验中,与对照组相比,杨梅黄酮可明显减少诱导形成的小管的长度(p<0.05)。

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