皱褶假丝酵母的形态特征与研究进展及其应用！

                      皱褶假丝酵母的形态特征与研究进展及其应用！

一、知识简介

皱褶假丝酵母(Candida rugosa)，旧称柱状假丝酵母(Candida cylindracea)，是一种半子囊无孢子、假丝状、单细胞、非致病的酵母菌。该酵母通常被认为是对人类和其它生命形式都是安全的。

在巧克力的生产过程中，皱褶假丝酵母起到了很大的作用。它能将种子内的这些糖转化为乙醇，并分解果胶质。

二、基本信息

中文名：皱褶假丝酵母

外文名：Candidarugosa

原名：柱状假丝酵母

特征：半子囊无孢子、假丝状、单细胞

应用：生产脂肪酶

致病性：非致病

三、菌株定义

皱褶假丝酵母(C. rugosa)，原名柱状假丝酵母(C. cylindracea)，是一种半子囊不产孢子的假丝状单细胞非致病酵母真菌。该酵母通常被认为是对人类和其它生命形式都是安全的。其所产的脂肪酶（C. rugosa lipase , CRL）广泛应用于传统与现代工业，如脂肪酸的生产、各种酯类的合成等，是当前世界上应用最广泛的商品化脂肪酶之一。

另外，在巧克力的生产过程中，皱褶假丝酵母起到了很大的作用。可可树的种子内含有大量的糖，非常适合皱褶假丝酵母的生长。它能将种子内的这些糖转化为乙醇，并分解果胶质。如果没有皱褶假丝酵母的参与，最终的产品是非常苦涩的。最终，皱褶假丝酵母会由于高浓度的醇而死亡，可可豆经过一些后续化处理如干燥，包装得到最终的产品。

四、脂肪酶分子量

大多数微生物脂肪酶分子量在 30-40 kDa 之间，而 C. rugosa 脂肪酶（CRL）和Geotrichum candidum 脂肪酶（GCL）分子量较大，约 60 kDa。CRLs 和 GCLs 是一类与胆碱酯酶（cholinesterase）结构类似的脂肪酶，都具有 α/β 水解酶的折叠结构和Ser-His-Glu 三联体催化中心。随着脂肪酶的纯化及基因克隆与表达研究的深入，发现两种属脂肪酶均存在基因多态性现象，在 C. rugosa 中发现至少有 7 种脂肪酶同工酶，G. candidum 为 2 种，这些同工酶在一级结构和理化性质上都存在差异。工业上广泛用作催化剂的 GCL 和 CRL 大多是混有几种同工酶的粗酶。

五、研究进展

1990 年，有研究首次报道了 C. rugosa lip1 的突变体核酸序列，到目前为止，先后从 C. rugosa 克隆出 8 个脂肪酶基因，研究者通过 Southern 杂交从 C. rugosa 基因组文库中分别得到 lip1~lip5 全长核酸序列，并预测 lip6 和 lip7 基因。其中 lip1、lip3、lip4 和 lip5 基因序列全长为 1650 bp，lip2 基因序列全长为 1647 bp。研究发现这些同工酶的基因均不含内含子，基因定位在 C. rugosa 的 I 号染色体上，成熟的脂肪酶包含 534 个氨基酸，分子量约为 60 kDa，等电点在 4.5~6.0 之间，具有不同的糖基化程度和底物特异性，但是基因的同源性高达 70%。随后 Xu 等从 C.rugosa (ATCC14830) 菌株中克隆得到 lipJ08 基因，全长 1650 bp，编码 549 个氨基酸，其中包含一个 15 个氨基酸残基的信号肽，成熟的脂肪酶包含 534 个氨基酸，与该菌株同工酶的一级序列比对，同源性高达 89%。研究发现 C. rugosa 不遵循常用的密码子系统，通常编码亮氨酸的密码子 CTG，在 C. rugosa 中编码丝氨酸 (Ser) ，包括在 CRL各组分中的催化位点 Ser209 也是由 CTG 编码。因此，C. rugosa 脂肪酶基因直接异源表达，得到的是无活性的蛋白。为解决这个问题，可以选择密码子使用模式相同的微生物作为宿主菌株或者将非常规密码子 CTG 改为 TCT 再进行异源表达。Brocca等首次用全基因合成方法将密码子 CTG 突变为 TCN，其中包括催化位点Ser209，合成了的 lip1 基因，并在 Saccharomyces cerevisiae 和 Pichia pastoris 中异源表达，都得到有活性的蛋白，且转入 P. pastoris 的转化子在 1-L 摇瓶中 pH 6.0 条件下，发酵 280 h 酶活达到 150 U/mL，且对 C8 和 C10 长度的脂类显示较高的水解活力。

随后 Tang 等采用重叠延伸 PCR 技术将 lip4 基因中 19 个编码丝氨酸的密码子 CTG 进行改造，分别在大肠杆菌和毕赤酵母中进行表达。lip4 有唯一一个皱褶假丝酵母脂肪酶糖基化位点 Asn-351，在毕赤酵母中表达的重组酶经过糖基化后，热稳定从 52 °C 升至 58 °C，但是催化性质与大肠杆菌中表达的产物没有明显差异。对两种重组脂肪酶活性测定，发现对长链酯(C16 和 C18)有较高的酯活力，对不饱和的长链脂肪也有较高的活性。

2002 年，Lee 等克隆 C.rugosa 的脂肪酶 lip2 基因利用 Overlap extension PCR技术将该基因中的 17 个编码丝氨酸的 CTG 密码子突变为 TCT，在 P. pastorisSMD168H 成功表达。该酶最适 pH 为 7.0，在最适温度为 30~50 °C，对 C12~C16 的对硝基苯酯有较高的水解活力，转酯和醇酯化效果最佳的底物分别是丁酸和 C18。同时，对三丁酸甘油脂和十二酸胆固醇酯活性最高。Ferrer 等将 lip2 用 AOX 作为启动子在毕赤酵母中异源表达，重组酶 LIP2 的表达量比原始 C.rugosa 菌株发酵 LIP2产量提高了 10 倍。

2005 年，Chang 等人应用 RT-PCR 技术从 C.rugosa(X64703)菌株基因组中克隆 lip1 基因，利用 Overlap extension PCR 技术将该基因的成熟肽 19 个编码丝氨酸的CTG 密码子突变为 TCT，以 P. pastoris KM71 作为宿主菌株，表达产物经纯化后，以三丁酸甘油酯为底物，酶活力为 253.3 U/mL。

2006 年，Chang 等将 lip3 中 18 个编码丝氨酸的 CTG 密码子用重叠延伸 PCR技术定点突变为 TCT；同时将 5’端 339 个碱基进行密码子优化，改造后的两段基因在毕赤酵母中表达出有活性的蛋白，密码子优化后表达的重组酶活力比未优化的提高 1.44 倍。重组脂肪酶的最适温度范围为 20~50 °C，最适 pH 4.0~6.0，对 C8~C12的 pNP 酯有较高的水解活力。

2011 年，Lee 等将 lip5 基因的 16 个编码丝氨酸的 CTG 密码子定点突变，在毕赤酵母中表达。重组 LIP5 在最适反应温度为 50 °C，最适 pH 为 8.0。研究底物特异性发现，重组酶对短链 pNP 酯(C4)、丁酰辅酶 A (C4)有较高的水解活性， LIP5与 LIP4 和 LIP2 都对短链底物有较好的水解作用。

六、脂肪酶应用

皱褶假丝酵母脂肪酶可以催化水解、醇解、转酯和酯化等多种反应，根据该酶的不同特性应用于工业的不同领域。CRLs 对甘油三酯中的 Sn-2 和 Sn-1/3 位酯键的识别和水解具有不同选择特异性且对底物的立体对映结构 1 位和 3 位酯键的表现出较高的识别特异性和对映选择性，因此，常用于制备对映体有机化合物，药物手性拆分，外消旋醇和酯的动力学拆分和催化合成大量药品，例如催化合成有光学活性的非甾醇类抗炎药(苯酮苯丙酸、萘普生、布洛芬)，生物碱类的光学异构体合成、抗生素、二级醇、生化抑制剂和前药等。Chen 等固定化 C. rugosa 脂肪酶后在环己烷中合成了(S)－布洛芬酯。利用 C. rugosa 脂肪酶对长链不饱和脂肪酸催化活性低这一特性，可以从鱼油中生产 EPA 和 DHA。除此以外，皱褶假丝酵母脂肪酶还被广泛应用于生物传感器、生物材料、生物降解和生物识别等领域中。

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