HCC1806人乳腺鳞状癌细胞系的培养及研究动态！

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一、背景

HCC1806人乳腺鳞状癌细胞系是一种来源于胸部乳腺的上皮样细胞系。这种细胞系是从一名60岁的黑人女性患者的乳腺中分离出来的，该患者患有TNM IIB期2级棘层松解性鳞状细胞癌（ASCC）。

HCC1806人乳腺鳞状癌细胞系于1995年启动，花了10个月的时间来建立。这种细胞系具有贴壁生长的特性，是一种较为常见的细胞系，被广泛应用于生物医学研究，以探索乳腺癌的发生、发展机制，以及寻找治疗乳腺癌的新药物和新方法等。

在研究过程中，研究人员可以通过对HCC1806人乳腺鳞状癌细胞系的基因表达、细胞周期、细胞凋亡等方面进行深入研究，从而进一步了解乳腺癌的生物学特性，为临床治疗提供理论依据。

二、HCC1806人乳腺鳞状癌细胞系培养操作

1)复苏HCC1806人乳腺鳞状癌细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)HCC1806人乳腺鳞状癌细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)HCC1806人乳腺鳞状癌细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

HCC1806人乳腺鳞状癌细胞系可以用于MicroRNA-139-5p靶向调节SOX8抑制三阴性乳腺癌的机制研究：

SOX8及miR-139-5p在肿瘤调控中发挥的作用,有必要在TNBC中进一步探讨SOX8和miR-139-5p的关系,并寻找两者的调节机制。研究目的本研究旨在探讨miR-139-5p对TNBC病理发生和发展的调节作用,并探讨miR-139-5p通过调控SOX8表达,抑制TNBC发展的分子机制,为TNBC的诊断和治疗中新的生物标志物及靶点的探索提供理论基础。

研究方法：

1、研究SOX8在三阴性乳腺癌细胞中的表达模式实验选取两种常用的人类TNBC细胞系(HCC1806人乳腺鳞状癌细胞系和BT549),分别采用实时荧光定量PCR和免疫印迹方法(Western blot)检测其中SOX8在mRNA和蛋白水平上的相对表达量。

2、研究SOX8基因对三阴性乳腺癌细胞生物学行为的影响通过在HCC1806人乳腺鳞状癌细胞系和BT549细胞系中转染SOX8过表达质粒或microRNA-SOX8特异性短发夹RNA来增强或敲减基因表达,再用定量PCR和Western blot检测转染后细胞中SOX8 mRNA和蛋白的相对表达量,判断过表达和干扰的效率高低。随后分别进行CCK-8实验、克隆形成和Transwell实验,用于测定HCC1806和BT549细胞的活力、克隆形成能力和迁移情况,评估SOX8基因表达量改变对TNBC细胞增殖和迁移的影响。

3、SOX8对三阴性乳腺癌细胞凋亡及细胞干性形成的影响利用流式细胞分析SOX8过表达或干扰后,HCC1806人乳腺鳞状癌细胞系和BT549细胞凋亡的变化情况,同时用Western blot检测凋亡标志物Caspase3、Caspase9的表达水平。用体外成球实验鉴定两种肿瘤细胞自我更新能力即细胞的干性。

4、过表达SOX8对Wnt/β-catenin通路活性影响利用Targetscan、Starbase等网络软件,利用生物信息学方法预测出SOX8可能与Wnt通路受体FZD7的互补结合的位点,通过RT-PCR验证过表达SOX8对FZD7转录的影响。

5、miR-139-5p对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移的影响利用定量PCR检测miR-139-5p在HCC1806人乳腺鳞状癌细胞系和BT549细胞与正常乳腺上皮细胞MCF-10A中的表达量。分别在两种细胞中过表达miR-139-5p,观察miR-139-5p表达量,以及SOX8 mRNA和蛋白的表达量与未转染组相比发生的变化,从而揭示二者的关系。通过CCK-8、克隆形成、Transwell实验研究miR-139-5p过表达对细胞增殖和迁移的影响。6.miR-139-5p对三阴性乳腺癌细胞凋亡及肿瘤球形成的影响分别在HCC1806人乳腺鳞状癌细胞系和BT549细胞中过表达miR-139-5p,流式细胞仪分析检测细胞凋亡率,Western blot检测活性Caspase3、Caspase9表达量,用体外肿瘤细胞成球实验检测细胞干性。

研究结果：

1、三阴性乳腺癌细胞系中SOX8表达上调与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,SOX8 mRNA、蛋白在HCC1806人乳腺鳞状癌细胞系和BT549乳腺癌细胞系中的表达量均明显上调(P<0.05)。

2、SOX8可以促进三阴性乳腺癌细胞增殖和迁移与对照组相比,在转染microRNA-SOX8特异性短发夹RNA的HCC1806人乳腺鳞状癌细胞系和BT549细胞中SOX8 mRNA和蛋白表达量均显著下调(P<0.05);而过表达组细胞中SOX8 mRNA和蛋白的表达水平均明显增加(P<0.05)。结果表明SOX8基因过表达和干扰的效率较高,转染细胞系构建成功。过表达SOX8的HCC1806和BT549细胞的存活率与对照组细胞相比大幅提高(P<0.05);同时,SOX8过表达后,两种细胞的相对克隆数增加(P<0.05),表明TNBC细胞克隆能力增强。Transwell实验结果显示在SOX8过表达后,细胞迁移能力显著增加(P<0.05);另一方面,转染microRNA-SOX8特异性短发夹RNA的细胞显示出相反的结果。由此可知SOX8基因可以促进TNBC细胞增殖和迁移。

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