大鼠骨髓单核细胞的背景与应用及培养操作步骤！

                  大鼠骨髓单核细胞的背景与应用及培养操作步骤！

一、背景

大鼠骨髓单核细胞是从大鼠骨髓中分离出来的一种骨髓单个核细胞。骨髓单个核细胞是骨髓中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。这些细胞在机体防御系统、炎症反应及免疫反应中起着重要的作用。在分离这些细胞时，通常采用密度梯度离心法，将一定密度的细胞按相应密度梯度分布，进而将各种血细胞与单个核细胞分离。

大鼠骨髓单核细胞是一种存在于大鼠骨髓中的细胞类型，也称为骨髓单核细胞系。这些细胞是一种多能性干细胞，可以分化为多种类型的细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞等。

骨髓单核细胞在免疫系统中起着重要的作用。它们可以吞噬和消化细菌、病毒和其他微生物，从而保护机体免受感染。此外，骨髓单核细胞还可以分泌多种细胞因子和趋化因子，调节免疫反应的发生和发展。

在医学研究中，大鼠骨髓单核细胞被广泛用于研究免疫系统的功能和疾病机制。例如，通过将特定的基因导入大鼠骨髓单核细胞中，可以研究这些基因对免疫系统的影响。此外，由于大鼠和人类的免疫系统存在一定的相似性，因此大鼠骨髓单核细胞也被用于研究人类免疫相关疾病的发病机制和治疗方法。

二、大鼠骨髓单核细胞培养操作

1)复苏大鼠骨髓单核细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)大鼠骨髓单核细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)大鼠骨髓单核细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

大鼠骨髓单核细胞可以用于Escherichia coli脂多糖对牙周靶细胞—成骨细胞和骨髓单核细胞的影响及其机制研究：

探讨了Escherichia coli LPS对成骨细胞和骨髓单核细胞的影响及其可能的作用机理和药物干预机制。

建立LPS诱导骨吸收模型，探讨了LPS诱导破骨细胞形成和骨吸收作用。结果显示LPS能诱导破骨细胞形成、骨吸收并激活Akt而导致p-AktSer473和p-AktThr308水平明显增加。而且PI3K的另一抑制剂Wortmanin可显著抑制破骨细胞形成和Akt的活化，并诱导成熟破骨细胞凋亡，表明LPS诱导破骨细胞分化、吸收和存活可能与PI3K／Akt信号通路激活有关。此外，本研究还探讨了葛根提取物-葛根素对骨形成和骨吸收的干预作用。

结果发现葛根素可明显促进骨形成并诱导Akt活化和核转位，且这种活化作用能被LY294002所阻断。同时，葛根素还可显著抑制LPS诱导的骨吸收和Akt活化，并促进成熟破骨细胞及其前体细胞-大鼠骨髓单核细胞凋亡。由此可知，葛根素可促进骨形成和抑制LPS诱导骨吸收，其机理可能与PI3K／Akt通路激活或灭活相关。

综上所述，本研究主要创新体现在：

1、本研究通过建立LPS诱导成骨细胞凋亡模型，论证了E．coli-LPS可抑制牙周靶细胞-成骨细胞增殖与分化而影响牙槽骨形成。

2、利用LPS诱导破骨细胞形成和骨吸收证实了E．coli-LPS可刺激牙周另一靶细胞-大鼠骨髓单核细胞分化为破骨细胞，并促进骨吸收，提示刺激大鼠骨髓单核细胞的分化、融合可诱导或加重牙槽骨吸收。

3、本研究通过对PI3K／Akt通路在E．coli-LPS诱导牙周靶细胞凋亡和骨吸收模型中的作用研究，为深入探讨LPS诱导的牙槽骨吸收和牙周炎发病机制提供一个新的信号通路，并为研制开发治疗该病药物提供新的作用靶点和一定的理论基础。

4、本研究还证实了葛根素可促进骨形成和抑制E．coli-LPS诱导的破骨细胞形成和骨吸收，因此葛根素可用于预防和辅助治疗LPS感染的牙周病，并为该药在牙周疾病上的应用提供了一定的理论依据。

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