人眼脉络黑色素瘤细胞的应用及培养操作步骤！

                   人眼脉络黑色素瘤细胞的培养操作步骤及应用！

一、背景

人眼脉络黑色素瘤细胞分离自脉络膜黑色素瘤组织的贴壁多角形细胞样细胞，STR检测发现，三株人侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞C918、M619和Mum-2B为同一遗传背景，怀疑存在交叉污染。

二、细胞培养操作步骤

1、人眼脉络黑色素瘤细胞培养基及培养冻存条件准备

1）准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）人眼脉络黑色素瘤细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）人眼脉络黑色素瘤细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、人眼脉络黑色素瘤细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）人眼脉络黑色素瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3、轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）人眼脉络黑色素瘤细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1、细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2、1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3、将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

三、应用

人眼脉络黑色素瘤细胞可以用于Butein通过线粒体途径诱导人葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡：

探索Butein的细胞毒作用，研究在体外对人类葡萄膜黑色素细胞瘤可能的防止及治疗作用，并研究其对正常的人类巩膜成纤维细胞及视网膜色素上皮细胞的作用。Butein诱导葡萄膜黑色素瘤细胞生物学改变，线粒体膜电位的变化后释放细胞色素C，活化细胞凋亡蛋白酶9及3，通过这些研究阐明了Butein诱导黑色素细胞的信号通路。

1、方法三种人葡萄膜黑色素瘤细胞系(M17、SP6.5和人眼脉络黑色素瘤细胞)，视网膜色素上皮细胞及巩膜成纤维细胞与不同浓度的Butein培养，通过MTT评价Butein对细胞活力的影响，通过流式细胞仪分析细胞的凋亡，用JC-1酶标仪评价线粒体膜电位改变，酶联免疫吸附试验分析细胞凋亡蛋白3、8、9的改变。

2、结果Butein减少培养的人葡萄膜黑色素瘤的活性，呈剂量依赖效应(10、30、100μM)，SP6.5的半数抑制浓度IC50在13.3μM，M17在15.8μM，在转移的恶性人眼脉络黑色素瘤细胞有类似的剂量，为16.7μM，Butein在较低的浓度时选择性的抑制葡萄膜黑色素细胞的活性，而对视网膜色素上皮细胞及成纤维细胞作用较小，Butein通过增加线粒体膜通透性及增加细胞色素C及凋亡蛋白9、3（不通过凋亡蛋白8）活性诱导肿瘤细胞凋亡。

3、结论30μM Butein诱导培养的人葡萄膜黑色素细胞凋亡，所以即使都是通过同一通路引起凋亡，人葡萄膜黑色素瘤与鼠皮肤黑色素瘤细胞相比前者对Butein更加敏感。

本研究表明100-300μM Butein可以杀伤3种人葡萄膜黑色素细胞瘤细胞(M17、SP6.5和C918)。人眼脉络黑色素瘤细胞是转移性细胞系，也可被Butein抑制，表明即使是高度侵入性的葡萄膜黑色素瘤细胞系也对Butein敏感。10μM及30μMButein对正常的视网膜色素上皮细胞及巩膜成纤维细胞无影响，表明Butein对葡萄膜黑色素细胞的特殊抗肿瘤特性。用低浓度Butein培养细胞后，部分细胞被膜连蛋白染色，而不被EtD-III染色，提示存在早期的凋亡。用高浓度的Butein处理细胞后，大部分被膜连蛋白染色，一部分被EtD-III染色，提示凋亡已经处于晚期，细胞膜已经损坏。Butein损害了线粒体膜电位，增加了细胞色素C及凋亡蛋白酶9,3的表达，并呈剂量依赖性。而凋亡蛋白酶8没有明显改变。这表明Butein是通过线粒体途径引起葡萄膜黑色素细胞瘤凋亡。

总之，低浓度的Butein可以诱导人葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡而对正常细胞影响较小，表明在体外Butein对人葡萄膜黑色素瘤是一个选择性的有效的细胞凋亡药物。因为转移的黑色素瘤细胞对于传统的化疗药物有很强的抗药性，而Butein对转移的人眼脉络黑色素瘤细胞具有杀伤作用，所以Butein可能有望成为具有转移的黑色素瘤细胞的治疗及防治药物，由于Butein的生物利用度及血浆浓度的研究刚刚起步，有必要进一步改变剂型及研究其与其他抗肿瘤药物的相互作用。

北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！