胰蛋白胨胆盐琼脂的应用与操作及注意事项！

                       胰蛋白胨胆盐琼脂的应用与操作及注意事项！

一、背景

胰蛋白胨胆盐琼脂是一种常用于大肠杆菌的膜过滤法选择性培养（ISO标准）的培养基。胰蛋白胨胆盐琼脂的成分包括：蛋白胨，氯化钠，胆盐，琼脂和pH缓冲液（pH值为9.0±0.1）。

二、胰蛋白胨胆盐琼脂操作步骤

1、按国家标准、SN标准、FDA标准或其它方法制备样品液；

2、称取36.5g的本品加热溶解于1000ml蒸馏水中，然后分装，在121℃的高压灭菌器中灭菌15分钟，之后便可备用。；

3、用3mm接种环取待测液体，划线接种到胰蛋白胨胆盐琼脂培养基上，做2个平板；

4、37℃培养18-24h，大肠埃希氏菌菌显无色菌落，产气肠杆菌和阴沟肠杆菌显黄色或无色。

三、胰蛋白胨胆盐琼脂注意事项

1、使用琼脂糖需要加温，请做好必要的防护措施，避免烫伤。

2、强烈建议您不要将琼脂糖粉末直接倒入沸水中，这样做会引起爆沸，溅出，致使浓度下降，还会造成结块而融化困难。正确的做法是称量一定量琼脂糖至三角瓶中，根据配制浓度加入一定量的缓冲液(与电泳缓冲液一致)，加盖硅胶塞（防止温度差别造成表面结膜），微波或其他方式加热至沸腾2分钟左右，戴手套小心取出，摇匀，使之完全溶解。

3、必须保证琼脂糖完全溶解，否则造成电泳条带不清，保证完全溶解的前提下，尽量缩短加热时间

4、室温凝固后，即可使用。如不立即使用请用保鲜膜封好，4℃冷藏，可保存5天。

四、应用

胰蛋白胨胆盐琼脂可以用于比色法快速检测食品中大肠菌群的研究：

大肠菌群是食品检验中最常用的指标之一。大肠菌群是指在37℃环境下能发酵乳糖，产酸产气的一群需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。目前普遍采用的大肠菌群的检测方法为多管发酵法。虽然传统的多管发酵法检测大肠菌群数具有准确、可靠等优点，但是在食品和水质的监测过程中，或在检测样品多和检测时间紧的情况下，由于其检测时间较长，已越来越不能满足实际监测的需要了。

利用大肠菌群的培养共性，对基于颜色特征识别的大肠菌群的快速计数法进行研究。

主要研究内容和成果如下：

1、对比色法检测大肠菌群的显色培养基配方进行设计，确定了以胰蛋白胨胆盐琼脂为基础，通过添加营养物质、酸碱指示剂、抑菌剂、表面活性剂等组分进行优化，筛选出显色培养基的最佳配方为：LST4.56g、溴甲酚紫0.03g、1.5%乳糖溶液0.1mL(培养40min后加入)、吐温0.2%，100mL无菌水。同时设计半固体琼脂培养基，通过对比不同琼脂含量对汽包的截留情况，确定了琼脂含量0.8%时观察菌体产气效果最佳，确保判断大肠菌群阳性结果的准确性。

2、对大肠菌群数目与培养液颜色之间的关系进行研究，通过测量经大肠菌群发酵产酸后培养基的颜色信息，采用线性或非线性拟合方法建立大肠菌群数目与培养基颜色信息之间的模型，最终确定BP神经网络模型能够得到理想的预测结果，并建立了大肠菌群数目与颜色对应标准比色板，适用于食品现场安全监察检测。

3、对固体类食品、生活饮用水大肠菌群快速检测方法进行研究，最终提供了的比色法定量检测技术与检测结果如下：

(1)检测技术：在无菌条件下准确称取25g固体样品，放入到装有50mL无菌生理盐水的锥形瓶中，置于摇床上160r/min振荡2min，混匀样品，用中速定量滤纸过滤样品匀液，再用50mL无菌生理盐水冲洗滤纸上残留的物质，收集滤液。无菌操作吸取6mL菌液通过滤膜进行浓缩，使菌体在过滤器中分布均匀，然后将微量移液管贴近滤膜吸取20μL菌液。准确称取4.56g月桂基磺酸盐胰蛋白胨培养基于100mL蒸馏水中，加热溶解，加入0.03g溴甲酚紫指示剂和2%的吐温试剂，振荡摇匀后以棉塞封口，放入灭菌锅中121℃温度下灭菌20min。取出置于无菌工作台上，待溶液冷却至37℃时调节pH值6.99。用无菌微量移液器吸取1mL培养基放入1.5mL离心管中，加入浓缩后的待检液20μL，37℃恒温箱中培养120min。培养40min后取出置于工作台上，加入1.5%的乳糖溶液100μL，盖紧离心管的盖子，置于恒温箱中继续培养。培养120min后，取出离心管，观察发酵液的颜色，对照大肠菌群数-颜色标准比色版读取大肠菌群数目的估计值。

(2)检测结果：该法在120min内即可得到检测结果，且比色法快速检测大肠菌群结果与国标法检测结果的比值为1.21，二者无明显差别，但国标法检测需72h，该法能明显缩短检测时间，具有一定的灵敏性和真实性。

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