乳糖培养基的实验原理与质量控制及使用方法！

                    乳糖培养基的实验原理与质量控制及使用方法！

一、背景

乳糖培养基用于多管发酵法测定食品、纯净水和一次性使用卫生用品中大肠菌群的确证试验(GB/T4789.3-2003，GB/T4789.28-2003中4.10和GB15979-2002)。

二、乳糖培养基原理

蛋白胨提供碳源和氮源满足细菌生长的需求;乳糖是大肠菌群可发酵的糖类;溴甲酚紫是pH指示剂，酸性呈黄色，碱性呈紫色。

三、乳糖培养基使用方法

1、称取乳糖发酵培养基(乳糖复发酵培养基)30g，加入蒸馏水或去离子水1 L，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装于带有小倒管的试管中，每管9mL(检测药品时每管3ml)，115℃高压灭菌15min。

2、从平板上挑取可疑菌落接种乳糖发酵管，(食品)置36±1℃培养24±2h;(药品)置30～35℃培养24～48h。

3、观察结果。凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色阴性的无芽孢杆菌，即为大肠菌群阳性，(食品)查MPN表报告每克(mL)样品中大肠菌群的MPN值。

四、乳糖培养基质量控制

本品加热溶解后呈紫色，下列菌株接种后置36±1℃培养24h或者30～35℃培养24～48h，结果如下：乳糖发酵培养基。

五、应用

乳糖培养基可以用于产β-葡聚糖酶的重组大肠杆菌BL21（DE3）-pET28a（+）-bgl的诱导表达及发酵：

β-1,3-1,4-葡聚糖酶能够有效地降解植物和微生物细胞壁来源的β-葡聚糖,通过添加外源β-葡聚糖酶可有效解决啤酒酿造中麦汁过滤困难,啤酒的非生物稳定性降低等问题,在饲料工业中也可提高禽畜对麦类饲料养分的吸收效率。

目前啤酒工业及饲料加工业中使用的β-葡聚糖酶制剂,主要是利用真菌或芽孢杆菌经传统通风发酵而生产。近年来,将外源β-葡聚糖酶基因通过合适的质粒载体克隆到大肠杆菌中进行表达得到了广泛的研究和应用。

本研究室自行构建了重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl,该菌克隆了源自一株淀粉液化芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因,在乳糖或IPTG的诱导下可实现重组葡聚糖酶的表达。本文针对影响重组菌表达效果的因素(如菌体的生长状态、诱导剂的最优作用条件、培养基的组成等)对诱导表达条件进行了优化,并初步进行了7升规模的放大发酵实验。

所得的主要结论如下：

1、在25 mL起始pH为7.0的LB培养基中,接入10%(以0.35的OD值为分值)处于对数中期的二级种子液,37℃、200 r/min振荡培养至菌液OD值为1.0左右时加入诱导剂,此时β-葡聚糖酶相对酶活最高。

2、采用正交实验的方法优化了在LB培养基中诱导剂的作用条件,得到的最佳诱导参数为:IPTG浓度0.0336 mmol/L,乳糖浓度10 mmol/L,诱导温度24℃,诱导时间6 h。发酵清液酶活达到336.33 U/mL,较优化前提高44.3%,该酶活是原始菌的4.85倍。

3、利用Plackett-Burman design实验设计方法对初始培养基中各组分进行了主效应分析,其中的甘油、酵母粉、氯化钠为主效应因子。采用Box-Benhken实验设计,以及MATLAB7.0的响应面回归(RSREG)和NESS数据处理软件对实验结果进行分析,得到了三个主效应因子的最佳浓度及最佳培养基组成(g/L):甘油18.9,酵母粉45.6,NaCl5.3,胰蛋白胨5.0,KH2PO42.8,K2HPO4.3H2O

4、8。最优浓度下酶活预测最大值为2053.1U/mL,菌种在优化后的培养基中发酵12 h,酶活最高达到了2311.81 U/mL,超过预测值,与优化前相比,酶活提高了23.04%。4.7升规模放大发酵13 h,发酵清液中的酶活最高为4189.58 U/mL,与三角瓶发酵最优结果相比提高了81.23%,该酶活是原始菌在最优条件下的酶活(853.33 U/mL)的4.91倍。

以上结果不仅为重组菌的进一步放大发酵提供了可靠的参考依据,也预示了该重组菌有着较好的工业化应用前景。

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