小鼠结肠平滑肌细胞的背景与应用及作用研究！

                  小鼠结肠平滑肌细胞的背景与应用及作用研究！

一、背景

小鼠结肠平滑肌细胞分离自结肠组织；结肠在右髂窝内续于盲肠，在第3骶椎平面连接直肠。结肠分升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠4部分，大部分固定于腹后壁，结肠的排列酷似英文字母“M”，将小肠包围在内。结肠横切面由内到外依次为：黏膜(上皮层、固有层、黏膜肌层)，黏膜下层(疏松结缔组织)，肌层(内环形、外纵行两层平滑肌)，外膜(纤维膜或浆膜)。结肠平滑肌细胞主要分布于黏膜肌层和肌层的内环形、外纵行平滑肌；结肠运动少而缓慢，对刺激的反应也较迟缓。结肠平滑肌在食物消化与吸收、肠道运动和物质分泌、诱发全身炎症反应以及细胞内信号转导途径等研究中起着重要的作用。

结肠平滑肌细胞原代分离培养3天后，可见细胞贴壁伸展，细胞形态大小不一，呈梭形、不规则形、三角形或扇形，核卵圆形、居中；2周后细胞汇合，多数细胞伸展呈长梭形，胞浆丰富，有分枝状突起，细胞平行排列成单层或部分区域多层重叠生长，高低起伏；细胞密度低时，常交织成网状；密度高时，则排列为旋涡状或栅栏状。传代后细胞生长较快，4-6天即可汇合，并保持上述形态学特征和生长特点。

结肠平滑肌运动活性受到神经递质、胃肠激素和药物等因素的调节。随着现代胃肠动力学研究的进展，对胃肠运动的研究已从器官、组织水平发展到细胞、分子水平，要求在胃肠道单个平滑肌细胞标本上来完成各种电生理、药理和分子生物学等实验。体外培养细胞，由于影响因素单一，是研究细胞功能以及相应的细胞信号转导机制的基础。

二、小鼠结肠平滑肌细胞培养操作

1）复苏小鼠结肠平滑肌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）小鼠结肠平滑肌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）小鼠结肠平滑肌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1、细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2、4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

小鼠结肠平滑肌细胞可以用于脑源性神经营养因子对小鼠结肠平滑肌细胞的重构作用：

通过引入BDNF基因敲除(BDNF+/-)小鼠,观察BDNF+/-小鼠结肠SMC超微结构的改变及结肠组织平滑肌α-肌动蛋白(smooth muscle a-actin,α-SMA)表达水平的变化,并应用BDNF和TrkB受体阻滞剂(K252a)体外干预C57bl/6小鼠结肠SMC,检测SMC形态及α-SMA、相关信号通路蛋白、细胞内钙离子浓度的变化,研究BDNF是否可以直接引起小鼠结肠平滑肌细胞的重构,进而影响肠道动力。

方法：

1、实验选用健康野生型C57B1/6(BDNF+/+)小鼠和BDNF基因敲除(BDNF+/-)小鼠：电镜检测BDNF+/+小鼠和BDNF+/-小鼠结肠平滑肌细胞超微结构的差异；利用Western blotting方法检测BDNF+/-小鼠和BDNF+/+小鼠α-SMA表达水平的差异。

2、培养原代小鼠结肠平滑肌细胞：细胞免疫荧光鉴定原代结肠SMC是否有TrkB受体的表达；BDNF及K252a分别干预结肠平滑肌细胞,根据干预不同,分为三组①对照组②BDNF组K252a组,三组细胞均于干预24小时后进行后续实验；细胞免疫荧光检测BDNF及K252a干预后结肠平滑肌细胞形态的改变；Western blotting检测干预后SMC中α-SMA,TrkB-PLC-Ca2+信号通路蛋白表达量的变化；钙离子成像检测BDNF和K252a干预下SMC中细胞内钙离子浓度的瞬时改变。

3、统计学处理：采用SPSS 17.0软件,计量资料以x±s表示。BDNF+/-小鼠和BDNF+/+小鼠结肠组织α-SMA表达水平、干预前后细胞内钙离子相对荧光强度值的比较采用独立样本t检验；BDNF和K252a干预SMC,对照组、BDNF组及BDNF+K252a组细胞核大小、细胞密度、α-SMA表达水平、TrkB信号通路蛋白表达水平总体采用单因素方差分析,若总体差异有统计学意义,以Bonferroni法进行组间两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

结果：

1、与BDNF+/+小鼠相比,BDNF+/-小鼠结肠平滑肌细胞细胞间隙增宽,充填了大量的胶原纤维；平滑肌细胞的边界呈多个球状突起；胞体内肌丝的密度减少；

2、与BDNF+/+小鼠相比,BDNF+/-小鼠结肠α-SMA表达水平明显降低；

3、小鼠原代结肠SMC表达TrkB受体；

4、在BDNF作用下,免疫荧光结果显示SMC细胞核体积增大,细胞密度增加,骨架蛋白荧光强度增强,BDNF+K252a干预组细胞的形态改变相反；

5、BDNF组SMC中α-SMA蛋白表达水平明显高于对照组和BDNF+K252a组;

6、BDNF组结肠平滑肌细胞中TrkB-PLC-Ca2+信号通路蛋白表达水平明显升高,且在BDNF干预下SMC内钙离子浓度明显升高,K252a可阻断以上变化。

结论：

1、BDNF+/-小鼠与BDNF+/+小鼠相比,结肠平滑肌细胞的超微结构和功能均发生了改变。

2、小鼠原代结肠平滑肌细胞表达TrkB受体,且BDNF干预SMC后,小鼠结肠SMC的形态和功能均发生了改变,K252a可以阻断以上变化。

3、BDNF可能通过TrkB-PLC-Ca2+信号通路引起小鼠结肠平滑肌细胞的重构,进而影响肠道动力。

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