小鼠骨髓瘤贴壁细胞系的培养操作步骤及应用！

                   小鼠骨髓瘤贴壁细胞系的培养操作步骤及应用！

一、背景

SP20-AG14小鼠骨髓瘤贴壁细胞系是由绵羊红细胞免疫的BA LB/c小鼠脾细胞和P3X 63A g8骨髓瘤细胞融合得到的。Sp2/0-A g14细胞不分泌免疫球蛋白，对20μg/ml的8-氮鸟嘌呤有抗性，对H A T比较敏感；Sp2/0-A g14细胞可以作为细胞融合时的B细胞组分用于制备杂交瘤；鼠痘病毒阴性。

二、细胞培养操作步骤

1、SP20-AG14小鼠骨髓瘤贴壁细胞系培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM（推荐iCell-0001）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）注意：圆形，悬浮生长，不要用力吹打(生长时会沉到瓶底）

3）SP20-AG14小鼠骨髓瘤贴壁细胞系培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

4）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、SP20-AG14小鼠骨髓瘤贴壁细胞系细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）SP20-AG14小鼠骨髓瘤贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。

该细胞轻微贴壁和悬浮培养的细胞，传代可以参考以下方法：

1.收集：将培养瓶中的悬浮的细胞收集到离心管中。用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。由于细胞贴壁不牢PBS润洗后细胞会脱落所以PBS也要回收到离心管中。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.将收集到的悬浮细胞、pbs清洗液中的细胞和消化下来的贴壁细胞以1000rpml离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）SP20-AG14小鼠骨髓瘤贴壁细胞系细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

三、应用

SP20-AG14小鼠骨髓瘤贴壁细胞系可以用于鸭圆环病毒Cap蛋白单克隆抗体及免疫胶体金试纸条的研制：

以Cap蛋白为研究对象,制备单克隆抗体,研发快速检测DuCV的胶体金免疫试纸条,实现DuCV的快速诊断与防治。

本研究中去除DuCV Cap的N端核定位序列(Nuclear localization signals,NLS),即去除Cap基因的5′端1-108 bp区域,保留剩余的109-774 bp区域,N端引入His标签,以便于抗原的纯化,最后将核酸序列克隆到大肠杆菌表达质粒p ET-28a中,质粒命名为p ET-28a-Cap,并转化到大肠杆菌BL21菌株中使Cap蛋白能够高效的表达。

最终得以确定其最佳诱导表达条件为在终浓度0.1 m M IPTG诱导剂中37℃诱导3 h,重组Cap蛋白主要以包涵体形式得到表达。使用弗氏佐剂制备的重组DuCV Cap蛋白免疫2只Balb/c雌性小鼠,ELISA检测2只小鼠的血清抗体效价均在1:20480,满足细胞融合的要求,分离提取免疫小鼠脾脏细胞和sp2/0细胞进行细胞融合,ELISA方法筛选能够分泌抗DuCV Cap蛋白的特异性抗体的阳性孔并进行亚克隆,最终获得了能够稳定分泌抗DuCV Cap蛋白的一株杂交瘤细胞株6A1。

Western bolt结果显示,6A1株单克隆抗体可以和重组DuCV Cap蛋白以及天然DuCV Cap蛋白能发生特异性的结合。对单抗6A1的Ig G类型鉴定结果表明6A1的Ig G类型为Ig G1亚类和Kappa轻链。将6A1杂交瘤细胞株注射到雌性Balb/c小鼠的腹腔用以大量制备单克隆抗体,间接ELISA检测结果表明注射杂交瘤细胞株小鼠腹水的抗体效价可达1:102400。

同时,用弗氏佐剂制备的重组DuCV Cap蛋白疫苗对2只健康新西兰兔进行免疫,制备抗DuCV Cap蛋白多克隆抗体,经3次免疫7天后使用间接ELISA方法检测兔血清的抗体效价,结果显示两只兔血清的抗体效价均达到了1:163840,经Western blot鉴定,该兔多抗对重组DuCV Cap蛋白以及天然DuCV Cap蛋白均能发生特异性的结合。

经过Protein A+G对小鼠腹水和兔血清进行抗体纯化,获得了高纯度的鼠抗DuCV Cap蛋白的单克隆抗体和兔抗多克隆抗体。进而以纯化的兔抗DuCV Cap蛋白多克隆抗体作为T线(2 mg/m L),纯化的鼠6A1单克隆抗体(64μg/m L,p H 8.0)作为胶体金标记抗体,以羊抗鼠Ig G(1 mg/m L)作为C线,组装胶体金检测试纸条。该DuCV抗原胶体金免疫层析试纸条在检测MDPV、GPV、DPV、NDV、AIV、DHV、FAd V和DRV中均不发生交叉反应,试纸条特异性良好,检测抗原的敏感度可达15.6μg/m L。

在39份的疑似感染鸭样品的检测中,分别用本次研究制备的胶体金试纸条与传统的PCR两种方法进行检测,检测结果符合率可达94.9%,检测结果准确度较高,同时经多次测试都表明试纸条有较好的重复性和稳定性,能够在10 min内完成对样品的快速检测。

总之,本次研究制备的基于DuCV Cap蛋白单克隆抗体的胶体金抗原检测试纸条可以实现快速、特异地检测临床样本中的DuCV,可用于DuCV的基层诊断和筛查工作。

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