在日常色谱定量分析中,出现色谱峰形异变或鬼峰,不但严重影响定量精度,甚至使分析工作无法进行,本文汇总了各种峰形异变常见类型并加以分析,并给出可能原因,为大家提供一些参考。
鬼峰集锦
在怀疑峰形异变寻找可能原因、排除方法之前最好先做以下工作:
仔细核查操作条件,与分析方法要求是否一致;
和当初分析所存的标准色谱图对照,判断是否真出了问题;
逐项仔细观察仪器或设备工作状态,看有无操作失误而引起的出峰失常;
然后再依据以下15种异常峰形分析可能原因与排除方法。
气相色谱
1、台阶峰
(1)TCD热丝被样品中所含卤素、氧、硫等元素腐蚀;
(2)气体流量突变如:注射垫突然漏气,气路受阻等;
(3)记录色谱峰装置故障如:拉线松。
2、负峰
(1)TCD用氮做载气,由于待测组分在N2中浓度不同,热传导值呈现非线性而可能出现负峰,有时可以通过改变载气流量或进样量克服;
(2)操作ECD时进样量过大而出负峰,这是由于工作原理由电子捕获转变为电离检测,此时灵敏度还会大大降低;
(3)操作FID,低电离效率的溶剂(如,CS2)或杂质出现,使原基流较高的输出基线减小而显示为负峰;
(4)操作FID,在无极化电压,样品量较大可能出现负峰;
(5)操纵NPD、FPD时气流比不合适,溶剂或某些组分会出现负峰。
3、“N”或 “W”峰
(1)TCD操作,用N2作载气由于热传导率非线性引起;
(2)FID操作时,样品溶剂电离效率低(如,CS2),或气流比欠佳时;
(3)ECD操作时,由于检测器被污染,溶剂峰或待测组分含量较高,或脉冲电源有毛病。
4、舌头峰(前延峰)
(1)汽化温度偏低;
(2)载气流量小;
(3)进样量大,汽化时间长;
(4)汽化室被污染,样品有吸附效应;
(5)样品在柱头有冷凝或色谱柱被污染;
(6)进样技术差(挥发性组分的进样速度太慢);
(7)峰前出现了“鬼”峰。
5、拖尾峰
(1)色谱柱安装不合格,样品不能以“塞子”形进入色谱柱,柱与检测器安装的死体积太大;
(2)样品未能注射入柱头中(柱头进样方式);
(3)汽化管没有安装好或破损,样品只能脱尾进入色谱柱;
(4)气化室的温度低或偏高;
(5)载气流量偏低;
(6)进样量大;
(7)载气系统(如注射垫处)有漏气;
(8)进样器(汽化室),被样品中高沸点杂质或注射垫残渣污染;
(9)色谱柱被污染致使被分析组分和高沸点污染物作用;
(10)补充气未开或偏低;
(11)色谱柱温度偏低或失效;
(12)甲烷化Ni催化剂失效;
(13)进样技术差(如速度不合适);
(14)正好有干扰峰(鬼峰)出现(如误用被污染的注射针);
(15)无极化电压(FID),此时伴随灵敏度偏低;
(16)样品前处理有毛病。
6、出峰后基线下移
(1)样品量大,特别是溶剂改变了工作状态;
(2)FID被污染状况发生改变,或气流比发生变化;
(3)系统出现漏气,或出现堵塞;
(4)色谱柱被污染;
(5)样品处理不当,如:样品中有些物质和固定相发生作用。
7、基线漂移
程序升温时基流增加(漂移大),噪声增加
(1)色谱柱需重新老化或失效;
(2)新换载气纯度欠佳;
(3)过滤器失效;
(4)样品前处理不当,如:杂质干扰物太多;
(5)灵敏度太高;
(6)数据处理装置的判峰参数设置不合理。
8、圆顶宽峰
(1)样品量大超出了色谱柱容量;
(2)汽化温度低;
(3)色谱柱没按要求安装;
(4)检测器工作状态不对,如载气太小、没开补充气;
(5)数据处理装置的判峰参数(半峰宽)设置偏大。
9、平顶峰(未到满量程)
(1)样品量大,放大器量程高,衰减大,信号输出饱和;
(2)检测器已工作在饱和区;
(3)数据处理输入信号极性接错,或零点失调。
10、基线出现波浪状峰
(1)高灵敏度操作仪器未稳定之前;
(2)操作TCD、ECD时,柱箱或检测器箱温度周期变化;
(3)环境温度对仪器控温影响;
(4)电压不稳,对柱温控制精度影响;
(5)过温保护设置低于控制温度;
(6)压力(流量)调节阀失调,周期变化。
11、重峰
原来能分开的峰分不开
(1)色谱柱安装不合要求;
(2)色谱柱被污染,需重新活化;
(3)色谱柱寿命已到,需更换;
(3)新更换的气源,纯度不佳;
(4)滤器失效,重新老化或更换;
(5)色谱柱温度和载气流量需要微调优化(色谱分析一般允许);
(6)检测器工作状态变化(如ECD漏气、FID气流比欠佳);
(7)汽化室被污染,注射垫漏气;
(8)样品处理不当,杂质干扰物太多;
(9)进样技术太差;
(10)进样量超出了色谱柱容量;
(11)数据处理的判峰参数,半峰宽或斜率设置不合理;
(12)放大器量程或衰减设置失误。
12、直角峰
(1)仪器输出负信号超出了数据处理的范围;
(2)数据处理装置零点未校正,或量程设置太大无法判断基线位置;
(3)数据处理装置输入信号极性接反,零点设置不对。
13、带毛刺峰
(1)仪器工作不稳定,噪声大于要求;
(2)数据处理装置的判峰参数,半峰宽和斜率设置太小;
(3)极化电压(FID)不稳。
14、峰消失
操作条件未变,原来能判别的峰不见了
(1)色谱柱被污染或失效;
(2)气路系统被污染(如气源纯度低,过滤器失效);
(3)注射垫漏气;
(4)注射针密封性差;
(5)数据处理的判峰参数,如:半峰宽和斜率设置偏大;
(6)进样方法不对。
15、“鬼峰”
(怪峰,多余峰,记忆峰)
(1)上一次进样的高沸点杂质峰自然流出;
(2)载气不纯过滤器失效使低沸点的污染物冷凝在色谱柱头,程序升温时正常流出;
(3)注射垫未经老化或无隔垫清洗而出的污染峰;
(4)汽化温度太高或严重污染至使样品某些组分分解;
(5)样品某些组分与被污染固定相产生了作用;
(6)色谱柱温度太高固定相分解;
(7)使用了被污染的注射针( 本身不合格,手摸或进过易污染的样品);
(8)样品前处理不完善或用错溶剂;
(9)样品中有空气;
(10)TCD、ECD等密封性差(漏气);
(11)电源不稳,对控温或放大器有不良影响;
(12)色谱柱堵塞物使用不当,如玻璃棉未按要求进行处理。
液相色谱
1.峰前或峰后有小峰的分析
产生原因大致分为以下几种情形
(1) 样品不纯。可改变不同的流动相和色谱柱 ,对样品进行分离比较 , 选择合适的分离条件。
(2) 分析柱或保护柱柱头塌陷。此情况较常见 ,可更换分析柱或保护柱后对峰形进行比较。柱头塌陷时往往所有的峰都会出现峰分裂 。对色谱柱再生和清洗可以改善分离效果。
(3) 色谱柱柱容量下降。当长时间使用后 , 有一些强保留组分吸附在柱子中 , 不大的进样量往往就会出现峰分裂。用强洗脱能力的溶剂清洗色谱柱 , 或更换色谱柱可使问题得到改善。
(4) 样品溶剂与流动相不匹配或进样体积过大。当样品溶剂比流动相极性大时 , 有时即使进样体积很小 , 也容易出现峰变形和裂分现象。建议用流动相溶解样品。
(5) 流动相不恰当。此情况较罕见 , 有些样品在特定的色谱条件下可能存在结构的动态平衡 ,而出双峰 , 这种双峰是无法分离完全的 , 改变色谱条件尤其是pH 值会使峰形正常。
(6) 样品分解。不稳定的样品在色谱分离过程中变成其他物质而出现双峰。这时需改变样品处理方法或色谱分离条件。
2.负峰分析
在色谱分析中有时会出现负峰或倒峰 , 如下图中的大峰的左下就有一负峰。出现这种现象可能是由以下几种原因引起的 , 可针对不同情况进行排除 , 进而使问题得到解决。
(1) 流动相吸收本底值过高。此时可适当改变检测波长。
(2) 进样过程中进入空气。进行排气处理 , 直到基线平稳再进样。
(3) 样品组分的吸收低于流动相。可改变流动相或改变检测波长。
(4) 配制样品的溶液与流动相不一样。重新配制样品 , 用与流动相一样的溶剂配制或稀释样品。
3.前沿、拖尾峰分析
拖尾:
1 干扰峰,优化条件分离 ;
2 色谱柱塌陷,更换色谱柱;
3 流动相pH不合适,调节pH值 ;
4 管路没有接好,存在较大的死体积,可以重新接一下。
前沿:
1 溶剂选择不合适,选择合适的溶剂 ;
2 样品过载,降低进样量;
3 柱温太低,升高柱温 ;
4 色谱柱损坏,更换色谱柱 ;
图谱前沿和拖尾的原因主要是流动相选择不合适,可以相应调整流动相的极性,或者适当加入酸来调整,可以得到较好的改善。一般来讲,酸碱在流动相中对于前沿和拖尾影响较大。柱前沿是可能因为柱超载,拖尾是可能因为样品被污染,选择合适的流动相,调节好pH能够改善这一情况。
前辈们总是会告诉我们,拖尾峰与柱子有关,可能是过载,稀释样品再做,或换新柱做。 有时候托尾峰往往是有机性相近杂质没有分开,此时,可以优化分析方法,或更换柱子试一试;也可能由于柱子使用时间太久柱效下降出现塌陷等原因;再有也会根样品本身性质有关,基团需要流动相中添加能与之结合优化峰形的化学物质,要根据具体情况而定。
4.色谱双峰产生的可能及判断和处理
液相上有一句经典的话说得好 “出两个峰肯定不是一种物质,出一个峰不一定是一种物质”。
而色谱双峰指的是明是一种物质,但在色谱图中出现双峰,而表明含二种物质。我将这种情况分为四种原因。
1)色谱柱
如果你分析样品时发现每个色谱峰都双峰出现(出峰越快,双峰的可能性会减少),尤其采用单一纯物质时,可以肯定色谱柱出问题-柱头受损或柱头固定相变脏或流失。如果进样量少,原来色谱柱正常,色谱峰的形状多为一大峰带一小峰,不一定拖尾,这一般应是柱头受堵,将色谱柱反过来接,用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂,将堵在柱头的残留物冲掉,再反过来,一般情况下就行了。当然不反冲,正冲有时也会正常的。如果峰拖尾,双峰强弱相差不大,柱头固定相变脏或流失可能性更大,高频红外碳硫分析仪这是可以将进样那头拧开,将微孔滤片超声,柱头刮去一部分填料,重新填上新填料拧紧,不过这种活,需要一定技术,同时不能老干那种事,否则用不了几次,色谱柱就会应柱效很低而报废。
2)溶剂极性及进样量
许多HPLC分析者对此可能不以为然,一般的HPLC的书籍和文献都不会提到这方面的内容,而这确是双峰产生的一个很重要的原因。目前HPLC分析多为反相色谱,流动相多为甲醇、乙腈、水,加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解。最佳的溶解方法是用流动相溶解,但是很多情况是不一致的。当用溶剂极性强度大的试剂,如纯甲醇、纯乙腈,纯乙醇,而分析体系中以水为主,样品进样量大,如定量管为20μl,此条件下完全可以肯定,单一的纯物质出双峰,第二峰比第一峰小(每次都不太一样),且拖尾,保留时间会提前(相对进样量少而言),将进样量减少一半以上,峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大,而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。上面提到进样量造成双峰的一个原因,另一个原因是,进样量不一定大,但绝对量很大,色谱图上的双峰紧靠在一起,基本上齐高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色谱柱问题)。将样品稀释再进样就可以了,这是由于进样量过大,色谱柱过载造成的。
3)样品的特性
有些样品由于其化学结构的特点,存在互变异构现象,而这种互变异构体无法分开,而是以一个动态平衡存在。在色谱分析时,在一个特定的条件下,一种物质将出现双峰,双峰靠的很近,基本齐高,不拖尾,条件稍一变化,尤其pH,双峰现象将消失,如红霉素等。有的样品紫外的色谱图上看不到双峰,但在LC-MS下,用质谱检测器,其质谱的总离子流图上较明显,例如我分析过的农药啶虫眯(吡虫清)。
4)参数
记录的参数一般都内定的,不必修改,但GC和HPLC的参数是不完全一致的,例如C-R3A数据记录仪上的一般记录时间间隔GC为2ms,HPLC 为5ms,如果记录间隔时间缩短,一个峰将变为二个峰或更多。
5.鬼峰、倒峰、未出峰
6.峰裂分
裂峰产生原因的确定
• 样品基质复杂或分析多种样品——柱污染或部分阻塞滤片
• 流动相 pH>=7——由于硅胶溶解导致柱塌陷(除非使用专门的柱子)
• 溶剂比流动相的强度大——可能产生裂峰或宽峰,由样品量决定(溶剂化效应)
7.峰拖尾、峰展宽、峰前伸
峰拖尾原因的确定
• 评价柱选择——使用高纯度硅胶柱或不同键合技术柱
• 评价流动相效果——改变流动相pH和添加剂消除次级效应(流动相中组份与柱子相互作用)
• 减小进样量
• 消除柱外效应
• 冲洗柱子——检查柱子老化/塌陷
Q&A峰问答
进行HPLC分析时,怎样才能知道某一个色谱峰是否是单一峰呢?特别是分析中药成分的时候?标准品加入法、DAD、还有改变流动相的组成是否能说明呢?
1、多种不同原理的方法比较是首选。
2、其次采用DAD检测器进行光谱分析,如果提示不纯,估计有问题。纯度阈值受仪器、流动相等影响,所以只能作为参考。对于分子结构中差异有紫外吸收官能团的,DAD检测器一般还是可以准确判断峰纯度的,但对于结构中无紫外吸收的那些差异,DAD检测器就无能为力了,比如某肽链中的氨基酸差异、或者一些对应异构体,DAD也是无能为力的。
3、如果DAD不行,那么就需要采用质谱鉴别了,优选液质联用,如果是含盐流动相,可以采用收集不同时段的色谱流出物的方式,脱盐,进行质谱检测。
4、如果怀疑有异构体,这个就比较头疼了,非对应异构体需要二级(主要是对CID的能量有要求,可以打断侧链)的质谱才能判断侧链的区别。对应异构体的辨别目前好像只有waters的离子淌度质谱(没做过)有一定的分辨能力,但也不是万能的。
所以峰纯度判定需要结合化合物及可能杂质的结构特点,来合理选择。
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