【知识分享】液相色谱柱选择指南，液相开发少走冤枉路！

在采用高效液相色谱进行分析方法开发时，色谱柱的选择直接影响了分离效果的好坏，选择合适的色谱柱可以缩短方法开发所需的时间，并且使方法更具稳定性。但是现在市场上色谱柱种类繁多，不同类型的色谱柱分离对象不同，因此，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。

本文结合以往经验及对色谱柱的一些认识进行了简要的汇总，从分离模式选择、样品信息、色谱柱参数三个方面进行简述，以期为方法开发时色谱柱的选择提供思路。

硅胶纯度对强极性化合物的分离最为重要，残留金属离子浓度、硅胶的杂质会影响化合物的峰形，硅胶表面的金属含量高会影响碱性化合物的峰形，易发生拖尾。纳谱分析采用的纳微科技UniSil硅胶，是利用高纯的有机硅烷试剂作为原材料生产制得，其金属含量都在10ppm以下，纯度高于国外高纯度色谱硅胶。 

增加色谱柱长度，可以在一定程度上提高柱效，但也会升高压力和导致峰展宽；含量测定、溶出检测等对于分离的要求较低，可选用较短的色谱柱，减少运行时间。内径大，提高载样量，但也会增加横向扩散，同样会导致峰展宽。内径小的色谱柱灵敏度较高，峰型更窄，但是载样量较小。如果载样量满足要求，需要更高更尖锐的峰提高灵敏度，可以选择更小内径，但压力较大，对系统要求较高。

• 短柱（15-100mm）运行时间短、柱压低；

• 长柱（150-250mm）分辨率高、运行时间长；

• 小内径（≤2.1mm）检测器灵敏度高；

• 大内径（3-21.2mm）载样量高、耐污染、寿命长。

粒径球形颗粒柱效高、重现性好、柱床结构均匀，不规则形柱床结构不均匀、流动相线速度不均匀，容易谱带展宽；当使用粘度较大流动相时，球形颗粒可降低柱压，延长色谱柱寿命。

纳谱分析采用的纳微UniSil硅胶微球在电子显微镜下呈现严格的单分散球形，而某国际品牌呈现不均一球形，表面缺陷清晰可见。

粒径指柱填料颗粒直径的大小，实际上色谱柱上所标的粒径是一个平均值，通常1.5-10μm。粒径小的色谱柱分离度较好，但色谱柱压力更大，如果5μm粒径的色谱柱分离度稍有不足，则同型号3μm色谱柱的分离度一般会提供令人满意的选择性。

目前纳谱分析主要可供选择的填料粒径如下：

• 1.8μm为快速液相色谱柱，匹配UPLC

• 3.0μm用于一般普通快速分析，常用于分离复杂的多组分样品

• 5.0μm用于常规分析

平均粒径越小，颗粒分布度越小，色谱柱柱效越高，但耐污染性能下降，反压亦越高。

表面积是指颗粒外表面与内部孔面积的总和，以m²/g表示，高表面积对于多组分样品的分离具有较强的保留能力、柱容量和分离度；表面积低的柱填料能迅速达到平衡状态，对于梯度洗脱尤为重要。

孔径是指填料颗粒的孔或腔的平均尺寸，范围是120～300Å，多孔色谱填料与目标物的作用绝大部分（＞95%）是发生在填料颗粒的内部，即孔内的，所以孔对于色谱填料也是最重要的参数之一，一款填料孔径大小(Pore Size)和孔径分布(Pore Size Distribution)，在绝大多数的色谱分离纯化中，起到关键性作用。大孔径的填料颗粒可以延长大分子溶质在填料表面的滞留时间，达到充分分离，改善峰形，所以大孔径填料适合分离大分子化合物或者水动力体积较大的分子；较小孔径提供较高的表面积，可用于较大的载荷量，并保留小的有机化合物，可用于小分子有机物到聚合物的分离。

样品分子直径小于平均孔径才能进入微粒内部，所选色谱柱孔径至少是样品流体学直径的4倍，一般根据样品的分子量选择适合的孔径。

• 分子量＜2000， 选择孔径80～180Å

• 分子量＞2000，选择孔径300Å，300Å全多孔色谱柱可用于分离蛋白质和多肽。

载碳量越高，固定相传质效应增加，高载碳量，有利于不易保留化合物的分离，水解稳定性好，重现性好；低载碳量，有利于分析有一定保留的化合物，降低溶剂损耗、减少运行时间。一般C18载碳量为10～14%，ChromCore 120 C18载碳量高达18%。可以通过增加碳键的长度或键合密度来增加载碳量，载碳量增加了有利于不易保留化合物的分离。