早期的化学试剂只是指“化学分析和化学试验中为测定物质的组分或组成而使用的纯粹化学药品”。后来又被扩展为“为实现化学反应而使用的化学药品”，而的“化学试剂”所指的化学药品早已超出了这一范畴。有人认为“在科学实验中使用的化学药品”都可称为“化学试剂”。对化学试剂更全面的定义可以是：在化学试验、化学分析、化学研究及其它试验中使用的各种纯度等级的化合物或单质。HPLC级高纯液相色谱溶剂HPLC试剂具有以下优点：l低紫外吸收；l非挥发性物质、游离酸、游离碱和水份含量低；l可用于荧光检测。用途：用于液相色谱（LC）样品制备、LC样品分析、LC-MS分析。农残级试剂农残级试剂具有以下优点：l极低的农残背景值（≤5 pg/ml ），不挥发性组分极少；lGC控制（ECD-PND检测）质量可靠，稳定性高；l适用于分析有机氯农药、有机磷农药、多氯联苯；l（PCBs）及其他用GC/ECD和GC/PND检测的化合物；l符合各种杀虫剂残留量分析的要求和对低挥发性杂质的要求。用途：用于气相色谱检测（ECD、PND），用于有机氯、有机磷农药， PCBs及其他用GC/ECD和GC/PND检测的化合物。另外，还有专用于二恶英、呋喃、PCBs等化合物分析用的ENVISOLV ®试剂； 用于环境中高挥发性氯代烃的气相色谱色谱（ECD）分析、芳香烃的检测（FID）分析用的OEKANAL®试剂。光谱纯试剂光谱纯溶剂具有以下优点：l低紫外吸收、低红外吸收；l杂质含量低；l适用于UV、IR光谱分析。用途：用于UV、IR光谱分析优级纯试剂优级纯具有以下优点：符合国际标准要求，金属元素杂质含量低（大多是ppm级）。用途：优级纯试剂可用于大多数常规实验，这类产品还可应用于生产领域。特纯与合成试剂特纯具有以下优点：特纯（extra pure）或者合成（for synthesis）级别试剂的质量标准能够满足实验室常规溶液的配置或标准化生产使用（药物合成原材料等）用途：通常只检测一些重要应用的参数，比如，纯度、IR参数、水分含量和醚含量以及过氧化物成分。NMR核磁共振溶剂氘代溶剂广泛应用于化学研究领域，对于分析有机物分子结构的重要方法－－核磁共振波谱法是不可缺少。用途：核磁共振实验可以提供原子同其他分子中的原子的关联信息，包括分子的空间取向、三维空间结构。在蛋白质组学、染色体组学、药物研究领域有广泛的应用。对氘代溶剂有哪些要求？NMR对所用溶剂的氘代度反应很敏感，如用200兆赫光谱，使用氘代度在99.5％～99.8％就足够了，如果提高设备的等级，例如用600兆赫光谱，则需要更高氘代度的溶剂。基准试剂基准化合物必须是测试精度范围内的纯物质；基准溶液被用于检验和校准当量溶液、pH缓冲溶液；只有这样的物质才能反映检验测定当量溶液。衍生化试剂衍生法指借助化学反应将待测组份接上某种特定基团，从而改善其检测灵敏度和分离效果的方法。利用化学衍生反应达到改变化合物特性的目的，使其更适合于特定分析的过程，在仪器分析中被广泛应用。气相色谱用：为了增加样品的挥发度或提高检测灵敏度；高效液相色谱用：与样品组份进行化学反应，反应的产物有利于色谱检测或分离。紫外光谱用：使被测化合物带上特定基团，具有紫外吸收。红外光谱用：使被测化合物键合特定基团，具有红外吸收。荧光检测用：带上荧光发色基团。衍生化反应的目的：提高样品检测的灵敏度；改善样品混合物的分离度；适合于进一步做结构鉴定，如质谱、红外或核磁共振等。其他级别化学试剂超纯级(puriss+,puriss. p. a ): 金属元素杂质含量低，杂质含量控制在ppb或ppt水平，适用于无机痕量金属元素分析；合成级(for synthesis, purum, pure, extra pure):≥ 95.0%，满足实验室试验和合成用；工业级(technical grade)：≥ 80%，实验室和生产阶段的原料和辅料。

实验原理 ??血红蛋白具有类过氧化物酶活性，可催化H2O2释放新生态氧，使邻甲联苯胺氧化发生颜色变化，由无色最终变为蓝紫色。根据显色深浅与标准进行比较，可测出其含量。实验方法??材料：??1．2g/L邻甲联苯胺溶液??2．1%H2O2??3．10%醋酸溶液??4．分光光度计??方法：??1.抽取静脉血2-3ml，枸橼酸钠抗凝，离心分离血浆。??2．按下表进行操作，用分光光度计，波长为530nm，以空白管调零，测定测定管的吸光度。试剂 （ml）测定管空白管2 g/L邻甲联苯胺溶液0.50.5患者血浆0.02/1% H2O20.50.5混匀后室温放置10min10%醋酸溶液5.05.0室温放置10min??3.计算公式??血浆游离Hb(mg/L)=测定管吸光度/标准管吸光度×100实验结果计算??参考范围：0-40mg/L注意事项??1.一切容器避免血红蛋白污染；??2.采血要顺利，器皿要干燥，检测血浆要新鲜，及时分离，防止人为溶血；??3.邻联苯胺溶液具致癌性，检测时要小心，废液要妥善处理，以免污染；??4.双氧水要新鲜配置，浓度要准确。

一、目的学习维生素 c 的生理功能和性质，掌握用 2 ， 6 一二氯酚靛酚法测定维生素 c 的原理和方法。二、原理维生素 c 是一种水溶性维生素，是人类营养中最重要的维生素之一，人体缺乏维生素 c 时会出现坏血病，因此它又被称为抗坏血酸。此外维生素 c 还具有预防和治疗感冒以及抑制致癌物质产生的作用。维生素 c 的分布很广，尤其在水果（如弥猴桃、橘子、柠檬、山楂、袖子、草莓等）和蔬菜（苋菜、芹菜、青椒、菠菜、黄瓜、番茄等）中的含量更为丰富。不同栽培条件、不同成熟度和不同的加工贮藏方法，都可以影响水果、蔬菜的抗坏血酸含量。测定抗坏血酸含量是了解果蔬品质高低及其加工工艺成效的重要指标。维生素 c 在金属铜和抗坏血酸氧化酶存在下极易氧化，因此，在用铜制品做食品时，维生素 c 易丢失。此外在碱性溶液中，维生素 c 也易被破坏，而在酸性溶液中比较稳定。利用它具有的还原性质可测定其含量。还原型抗坏血酸能被染料 2 ， 6- 二氯酚靛酚氧化为脱氢型，该染料在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色，被还原后变为无色。因此用 2 ， 6 一二氯酚靛酚滴定含有维生素 c 的酸性溶液时，维生素 c 尚未全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色，当溶液中的抗坏血酸全部被氧化成脱氢抗坏血酸时，滴入的 2 ， 6 一二氯酚靛酚立即使溶液呈现淡红色。用这种染料滴定抗坏血酸至溶液呈淡红色为滴定终点，根据染料消耗量即可计算出样品中还原型抗坏血酸的含量。 三、仪器、试剂和材料1 .仪器（ 1 ）天平（ 2 ）组织捣碎机（ 3 ）微量滴定管（ 5ml)（ 4 ）容量瓶（ 50ml)（ 5 ）刻度吸管（ 5 ml, 10 ml )（ 6 ）锥形瓶（ 100ml)2 .试剂（ 1 ） 1% 草酸溶液：草酸 1g 溶于 l00ml 蒸馏水中（ 2 ） 2 ％草酸溶液：草酸 2g 溶于 l00ml 蒸馏水中（ 3 ）坏血酸标准溶液（ 0. 1 mg/ ml) : 精确称取 l0mg 纯抗坏血酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用）用 1 ％草酸溶液溶解并定容至 l00ml 。此溶液应贮存于棕色瓶中，最好临用前配制。（ 4 ） 0 . 05 ％ 2,6 一二氯酚靛酚溶液：称取 500mg 2, 6- 二氯酚靛酚溶于 300ml 含 104 mg 碳酸氢钠（ a. r ）的热水中，冷却后用蒸馏水稀释至 1000ml ，滤去不溶物，贮存于棕色瓶中， 4''c 冷藏可稳定一周，临用前以标准抗坏血酸标定。3 .材料新鲜水果或蔬菜四、操作步骤1 .提取抗坏血酸取新鲜水果或蔬菜 50g, 加入 50ml2 ％草酸溶液，用组织捣碎机打成匀浆。过滤取得滤液，滤饼可用少量 2 ％的草酸洗几次，合并滤液，记录滤液体积。2 . 2 ， 6 一二氯酚靛酚溶液的标定准确吸取 4 . oml 抗坏血酸标准液（含 0 . 4g 抗坏血酸）于 l00ml 锥形瓶中，加 16ml 1 ％草酸溶液，用 2 ， 6 一二氯酚靛酚滴定至淡红色（ 15 秒内不褪色即为终点）。记录所用染料溶液的体积，计算出 l ml 染料溶液所能氧化抗坏血酸的量。3 .样品滴定准确吸取样品提取液两份，各 20ml ，分别放入两个 100ml 锥形瓶中，滴定方法同 2 中的操作，另取 20ml 1 ％草酸作空白对照滴定。五、结果处理取两份样品滴定所耗用染料体积的平均值，代入下式计算 100g 样品中还原型抗坏血酸的含量：v 1 为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数；v 2 为滴定空白对照所耗用的染料的平均毫升数；v 为样品提取液的总体积；v 3 为滴定时所取的样品提取液的毫升数；m 为 l ml 染料所能氧化抗坏血酸的量（ mg ）（可由操作 2 计算得到）；w 为待测样品的重量（ g ）。六、注意事项（ 1 ）用本法测定抗坏血酸含量虽简便易行，但有下述缺点：第一，本法只能测定还原型抗坏血酸，不能测出具有同样生理功能的氧化型抗坏血酸和结合型抗坏血酸。第二，样品中的色素经常干扰对终点的判断，虽可预先用自陶土脱色，或加入 2-3 ml 二氯乙烷，以二氯乙烷层变红为终点，但实际上仍难兔产生误差。（ 2 ）用 2 ％草酸制备提取液，可有效地抑制抗坏血酸氧化酶，以免抗坏血酸变为氧化型而无法滴定，而 1 ％的草酸无此作用。（ 3 ）如样品中有较多亚铁离子（ fe 2+ ）时，也可使染料还原而影响测定，这时应改用 8 ％乙酸代替草酸制备样品提取液，此时 fe 2 ＋ 不会很快与染料起作用。（ 4 ）如样品浆状物泡沫过多，可加几滴辛醇或丁醇消泡。（ 5 ）市售的 2 ， 6 一二氯酚靛酚质量不一，以标定 0.4mg 抗坏血酸消耗 2ml 左右的染料为宜，可根据标定结果调整染料溶液浓度。（ 6 ）样品提取制备和滴定过程中，要避免阳光照射和与铜、铁器具接触，以免破坏抗坏血酸。（ 7 ）滴定过程宜迅速，一般不超过 2min ，样品滴定消耗染料 1 - 4 ml 为宜，如超出此范围，应增加或减少样品提取液的用量。（ 8 ）提取的浆状物如不易过滤，亦可进行离心收集上清液。

细胞解冻和培养指南冻存的ATCC细胞株和杂交瘤细胞株在运送过程中使用干冰保持低温。收到冻存细胞后，可以立即解冻复苏，去除二甲基亚砜（DMSO）后进行细胞培养。如果不立即复苏培养细胞，必须将细胞冻存管放置于液氮罐气相层存储。请不要将细胞存储在-130℃以上的温度。如果温度不够低，达不到-130℃，细胞活力会迅速下降。操作推荐ATCC推荐在操作冻存的ATCC细胞株时使用手套，工作服和防护面具以避免任何事故发生。检查包装，查看是否有任何破裂或渗漏。冻存的ATCC细胞株应处于固体状。将冻存的ATCC细胞株从有干冰的包装中取出，立即复苏培养，或迅速转移放置在液氮罐气相层在-130℃以下的温度存储。冻存细胞的复苏和培养1、先准备好细胞培养皿或细胞培养瓶，及产品说明推荐的相应细胞培养基。并在37℃水浴中预先温热细胞培养基。（请参阅：注1）2、小心取出装有细胞的冻存管，保持管盖拧紧，将冻存管盖以下的部分置于37℃水浴中并轻微的搅拌以帮助解冻。解冻过程应该尽快，大约短于2分钟或待最后一块小冰晶体刚融化，就应将细胞冻存管取出水浴。3、在水浴中取出的细胞冻存管表面喷洒70%乙醇配制的消毒剂，用无菌纸巾或纱布拭干。之后的操作步骤都应该遵循在无菌条件下生物安全柜中严格操作。4、小心拧开冻存管的顶部，将管内容物用1ml移液枪转移到含9毫升培养基的无菌离心管中。离心5到7分钟（125xg），小心吸去上清液以去除抗冻剂（二甲基亚砜），避免丢失细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于配好的完全培养基中。将细胞悬液转移到培养容器，轻轻摇晃使细胞均匀的分布。生长较慢的细胞株可重悬于5-8ml培养基并转移到T25培养瓶。生长较快的细胞株可重悬于12-20ml培养基并转移到T75培养瓶。5、将细胞培养容器置于细胞培养箱，在温度37℃，二氧化碳浓度5%的培养条件下进行孵育。细胞培养24小时后应在显微镜下观察细胞形态和生长状况。（请参阅：注2）*注1：虽然大多数细胞株可以在一种以上的培养基中生长，但细胞的特征有可能会在更换不同培养基时发生。为保证最佳效果，请从细胞培养一开始就使用ATCC推荐指定的培养基。*注2：某些细胞株，如杂交瘤株，可能需要几天的时间才从冻存状态下完全恢复正常生长。在细胞复苏培养第1天可能会呈现较低的细胞活力并产生一些细胞碎片。度过这一时期后，细胞会恢复并进入指数增长期。细胞培养贴士细胞株的生长有两种状态，贴壁细胞需要附着在一个表面进行生长（贴壁依赖性），悬浮细胞可在悬浮培养状态下生长（非贴壁依赖）。在细胞单层贴壁生长货悬浮生长中，都通常遵循四个特征性阶段：迟滞期、对数或指数期、静止或平台期及衰退期。

细胞是非常脆弱的，一不小心就会出现变数，提高细胞成活率提高实验成功率，要选择一款优质的血清。血清是细胞培养的天然培养基，血清选错了，细胞自然状态会受影响。据1997年出版的Medical and healthcare marketplace guide估测，欧美市场每年用于生物药物和疫苗生产的胎牛血清为50万升，价值10亿美元，而使用胎牛血清后所产出的产值为40亿美元，目前的生物技术产品和病毒性疫苗的生产大多数仍依靠细胞培养来表达产物和扩增病毒。牛血清的需求量以每年25%的速度增长。血清需求量不断增加的同时，对于血清质量的要求也逐渐提高。由于天然环境差和抗生素的大量使用，国产血清质量普遍不高。国内环境污染严重，同时饲养过程中抗生素极其滥用，有毒有害物质会大量残留在血清中，最终不利于细胞的生长。而进口血清中，除南美血清、北美血清外，就是澳洲血清了。澳洲血清来源主要是新西兰和澳大利亚，这是在北美血清禁运之后进入中国市场的。Ausbian血清就是一款在市场上认可度比较高的优质血清

Q1: 荧光素的纯度对实验有成影响吗？A：有影响。99%以上的纯度较好。Q2: 甲虫荧光素和萤火虫荧光素之间有区别吗？A：二者之间没有区别。Q3: 如何溶解荧光素，其溶液稳定吗？A：荧光素钾盐在水中的溶解度为60 mg/ml，荧光素钠盐溶解度为100 mg/ml。荧光素游离酸是不溶于水的，但是在甲醇中的溶解度为10 mg/ml，在DMSO中溶解度为50 mg/ml。荧光素钠盐和钾盐的水溶液短期内存放于-80℃，对实验效果没有明显影响。有实验证明，将荧光素溶解于脱氧中的水中会更稳定些。对于一些较为敏感的试验，为了控制试验中的可变因素，较推荐新鲜配置的反应液 。例如，低浓度的荧光素酶或者并非最适的反应条件是需要高质量的底物才能进行反应 。Q4: 荧光素钠盐和荧光素钾盐有什么区别？A：目前的研究没有发现二者在使用效果上的区别，仅在物理特征上有些小的差别，如荧光素钠盐溶解度会高于荧光素钾盐。但是在体内实验研究中，有更多的研究者倾向于选择荧光素钾盐，据不完全统计，选用钾盐的使用人是钠盐使用人的3倍。Q5: 荧光素钠盐，荧光素钾盐，和荧光素游离酸之间有什么区别？A：游离酸不溶于水，在甲醇中的溶解度为10 mg/ml，在DMSO中溶解度为50 mg/ml，同样可用NaOH，KOH弱碱去调节溶液的PH值。荧光素的钠盐或者钾盐在使用过程中会更方便，尤其是在体内成像实验中，因其能够溶解在水中，反应毒性也会更小些。Q6: 为什么溶解荧光素钠盐或者钾盐的时候需用不含Ca2+或Mg2+离子的PBS，有无别的盐溶液可用来溶解荧光素？A：PBS，或者其他的磷酸盐缓冲液，或DPBS，常用来进行生物学研究或者细胞相关研究。PBS/DPBS为等渗溶液，PH为7.2-7.6之间。DPBS和PBS之间无差别，只是通常情况下，DPBS是不含钙镁离子。钙镁离子可能会抑制某些蛋白酶的活性。此外Mg2+是催化荧光氧化的重要因素，Ca2+是和腔肠素氧化有关的离子。其他的盐溶液也可用来溶解荧光素，但要避免溶液中的阳离对实验造成影响。Q7: 荧光素酶的发光特性？A：荧光素腹腔注射老鼠后约1 min后，能够表达荧光素酶的细胞开始发光，10 min后强度达到稳定的最高点，在最高点持续约20-30 min后开始衰减，约3 h后荧光素排除，发光全部消失，最好的检测时间是在注射后15-35 min内。其动力学曲线如下图：Q8: 怎么将荧光素注入小鼠体内，注射方法之间的区别是什么？A：荧光素可通过腹腔注射或尾部静脉注射注入小鼠体内。约1 min可扩散到小鼠全身。大部分情况下使用荧光素浓度为150 mg/kg。对于20 g的小鼠约使用3 mg的荧光素即可。对于腹腔注射来讲，扩散较慢，开始发光较慢，持续发光时间较长。对于荧光素的尾部静脉注射，扩散快，开始发光快，但发光持续时间较短。Q9: 荧光素底物可以透过血脑屏障吗？A：荧光素底物约280道尔顿，荧光素的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透细胞膜和血脑屏障。Q10: 荧光素酶的表达稳定性如何？A：通过稳定筛选等过程，荧光素酶基因是能够插到细胞染色体内的。当细胞进行分裂、转移、分化时，荧光素酶也得到持续稳定的表达，荧光素酶的半衰期约为3 h，故只有活细胞才能持续表达荧光素酶。

做细胞培养的实验人员来讲胎牛血清一定不陌生，那么胎牛血清参与细胞相关的科学实验都起到什么作用呢？胎牛血清，是胎牛血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。牛血清是细胞培养中用量很大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必需的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能：提供维持细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用，起酸碱缓冲的作用。胎牛血清中的贴壁因子有助于细胞贴壁，并提供结合蛋白，能识别并结合维生素、脂类、金属和其他激素等，能调节它们所结合分子的活力。除此之外，胎牛血清在细胞消化过程中提供蛋白酶抑制剂，在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。

做细胞培养实验经常会对血清冻融，怎么才能有效正确的利用血清也有对应的方法，今天分析如何融化血清让实验更好的完成。与4℃过夜法相比,三步法为什么对血清更好呢？重点有二！其一：关系到沉淀出现的几率！记得吗？血清在融化过程中，瓶子里冰块的底部你会看见亮亮的蛋白丝在下沉，如同蜂蜜溶于水时的亮线，这就是血清中大量的蛋白在快速融化，而水的熔点高于蛋白，融化的速度是比蛋白慢的。（回想一下高级冰淇淋和大棒冰的区别，你懂得！）试想，如果采用4℃过夜的方法，1瓶500毫升的血清融化好，大约需要10小时左右，蛋白先融化，沉降在瓶子的底部，水融化的速度比蛋白慢，于是造成大量蛋白溶于少量的水，此时就很容易有一些蛋白饱和析出，（大多是脂蛋白和纤连蛋白），这就是血清融化中产生沉淀的重要原因之一。采用三步法，只要2.5个小时，温和有效地加快了水融化的速度，另一方面，融化过程中可以间断轻轻摇摆瓶子，让蛋白在瓶中混匀。此方法不但节约了时间，而且最大限度减少了血清沉淀出现的几率。血清融化过程中，蛋白质会比水先融化。冰块底部亮亮的细丝就是融化中的蛋白其二：血清在培养细胞中，最重要的是利用它的活性的因子，因此，融化过程中最大限度地保留因子的活性，就变得非常重要。回忆一下，细胞复苏时，要保持细胞的活性，我们是要遵循“快融”原则还是“慢融”原则呢？快融！血清同样如此！三步法需要两个半小时，4℃过夜需要大约10个小时（冰箱一般设2-8℃，所以各实验室融化时间会稍有出入）。哪个速度对保留活性更好？不言而喻！

糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氢气、甲烷、二氧化碳等)；有些细菌只产酸不产气。不同的细菌可根据分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨，指示剂(溴甲酚紫)，倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色(pH6.8)变为黄色(pH5.2)。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。糖发酵试验通常采用试管、德汉氏小管、试管架及各种糖类试剂等多种试剂和耗材，操作繁琐，耗时较长。如何能够简便试验流程，节省时间呢？近年来，HiMedia公司的生产的糖发酵试剂盒在国ji上悄然流行。该试剂盒含35项糖发酵检查，其中A盒和B盒各含12项糖发酵试验，C盒含11项糖发酵试验和1个对照试验，通过微生物发酵反应，培养基颜色发生变化。A盒：乳糖、木糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、棉子糖、海藻糖、蜜二糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、甘露糖B盒：菊粉、葡糖酸钠、甘油、水杨苷、己六醇、肌醇、山梨醇、甘露醇、核糖醇、阿糖醇、赤藻糖醇、-甲基-D-葡萄糖苷C盒：鼠李糖、纤维二糖、松三糖、α-甲基-D-甘露糖苷、木糖醇、邻硝基酚-β半乳糖苷(ONPG)、七叶苷、D-阿拉伯糖、柠檬酸盐、丙二酸、山梨糖、对照待鉴定菌种应先进行分离和纯化。可在HiMedia营养琼脂或脑心浸膏琼脂上挑取一个菌落，接种在５ml脑心浸膏肉汤中，在35-37℃培养4-6小时，直到在620nm处，接种液浊度≥0.5OD。一些苛养菌可能需要孵育超过6小时，以保证接种液浊度达到0.5OD。无菌打开试剂盒，撕掉封条。每孔接种50μl上述菌液。也可用接种环划线。在35±2℃孵育18-24小时即可，显色结果与《结果诠释表》、《菌种标准表》比对后，从而对菌种作出鉴定，几乎包含所有的糖类发酵实验，一次性即可出实验结果，方便快

    在一定但不多的场合下，我们能听到电泳这个词汇。很多人的第1反应或许和小编一样，都以为是游泳的一种新方式。但是实际上，电泳和游泳是没什么关系的。不卖关子了，好奇的朋友就赶紧和小编一起来了解一下电泳是什么把！    一、电泳是什么    在一定的条件下，带电粒子在单位电场强度效果下，单位时刻内移动的间隔为常数，是该带电粒子的物化特征性常数[。不一样带电粒子因所带电荷不一样，或虽所带电荷一样但荷质比不一样，在同一电场中电泳，经必定时刻后，因为移动间隔不一样而彼此别离。分隔的间隔与外加电场的电压与电泳时刻成正比。 在外加直流电源的效果下，胶体微粒在分散介质里向阴极或阳极作定向移动，这种表象叫做电泳。使用电泳表象使物质别离，这种技术也叫做电泳。胶体有电泳表象，证实胶体的微粒带有电荷。各种胶体微粒的实质不一样，它们吸附的离子不一样，所以带有不一样的电荷。    二、电泳的作用    1、安全方面的效果奉献：电泳漆以水为溶解介质，无喷涂料的易燃易爆风险，大大地降低了涂装业火灾事故率，完结了涂装产业的安全！    2、对涂装工身体健康方面的效果奉献：有机溶剂是涂装业中损害身体健康的首要来源，而电泳涂装大生产中有机溶剂含量仅为1~3%，大大降低了大气污染和环境损害，安全卫生。    3、漆膜功能方面的效果奉献：电泳涂膜厚度均匀，附着力强，涂装质量好，工件各个部位如内层、洼陷、焊缝等处都能取得均匀、滑润的漆膜，处理了别的涂装办法对杂乱形状工件的涂装难题，大大地延长了商品的使用寿命。    4、生产功率方面的效果奉献：电泳涂装生产功，可整挂商品或大件商品过电泳槽电泳1~3min即可取得均匀完好的涂布，远远高于喷涂的也许长达数几小时才干完结的涂装，质优高产，自动化接连大批量生产，大大地提高劳动功率；也一起大大地降低了工作本钱！    三、电泳的工艺    1、除油。溶液通常为热碱性化学除油液，温度为60℃（蒸汽加热），时刻为20min左右。    2、热水洗。温度60℃（蒸汽加热），时刻2min。    3、除锈。用H2SO4或HCl ，例如用盐酸除锈液，HCl总酸度≥43点；游离酸度>41点；加清洗剂1.5%；室温下洗10～20min。    4、冷水洗。活动中冷水洗1min。 5、磷化。用中温磷化（60℃时磷化10min），磷化液可用市售制品。 上述工序亦可用喷砂→水洗替代。    5、钝化。用与磷化液配套的药品（由出售磷化液厂家供给），室温下1～2min即可。    6、阳极电泳。电解液成分：H08-1黑色电泳漆，固体分质量分数9%～12%，蒸馏水质量分数88%～91%。电压：（70±10）V；时刻：2～2.5min；漆液温度：15～35℃；漆液PH 值：8～8.5。留意工件收支槽要断电。电泳过程中电流随漆膜增厚会逐渐降低。    7、清水洗。活动冷水中洗。    8、烘干。在烘箱中于（165±5）℃温度下烘40～60min即可。

    Picogreen是一种极为灵敏的荧光核酸染料，常用于双链DNA的定量检测。历来DNA浓度的测定在cDNA文库的构建，DNA亚克隆、PCR产物的估测等领域中具有重要意义。疫苗等生物制品中残留微量DNA的检测更是直接关系到人类的健康。    常用的检测核酸的方法有:    1）紫外吸光法（A260），该法操作简便，但DNA样品中核苷酸、单链DNA、RNA和蛋白质对紫外吸收信号影响很大，还容易受到核酸样品中污染物的干扰，不能区分DNA和RNA，而且灵敏度低（ΔA260=0.1相当于5ug/ml的dsDNA）；    2）探针杂交法，该法是传统检测微量DNA的常用方法，基本能满足目前疫苗和治疗性生物制品的检测需求，但是该法耗时较长，操作繁琐，稳定性、敏感性和特异性较差；    3）Hoechst33258染料法，Hoechst33258是一种一定程度上特异于双链DNA的核酸染料，基本不受蛋白质的干扰，可以检测低至10ng/ml的DNA；在检测稳定性和灵敏度上仍达不到理想效果。    Picogreen dsDNA定量法：Picogreen仅在与DNA双链结合后才发出荧光，且所产生的荧光与DNA浓度呈正比，在存在ssDNA、RNA和单体核苷酸的条件下，可以选择性地检测低至25pg/ml的dsDNA。该分析在三个数量级范围内呈线性，且几乎无序列依赖性，可以精确地测量多个来源的DNA，包括基因组DNA、病毒DNA、小量提取DNA或PCR扩增产物。    相比传统的方法，Picogreen dsDNA Quantitation Reagent定量具有以下优势：    ①灵敏度高：数量级较UV吸光读数更敏感，可节省宝贵的样品；    ②特异性强：在等摩尔的RNA存在的条件下，对dsDNA具有特异性；    ③耐受性好：耐受较高浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白或琼脂糖，可以直接定量PCR扩增产物而无需从反应混合物中纯化DNA。    ④易于使用——只需在样品中加入染料，等待5分钟，然后读数即可，且适用于96和384孔板；与大多数基于荧光的酶标仪和荧光计兼容。    ⑤适用范围广：可适用于PCR的分析、芯片样品、DNA损伤分析、酶活性分析、基因组DNA定量以及复杂混合物中dsDNA的检测和病毒DNA定量等多种领域。    若每次分析体积为2 mL，1ml Picogreen定量试剂足够200次分析使用，若使用微孔板或96孔板检测，每次使用量200μl，则足够2000次分析。另外，我公司提供【双链DNA（dsDNA）定量检测试剂盒】方便客户选用。    储存条件：4℃避光干燥，有效期6个月。    注意事项    1）Picogreen定量试剂含有DMSO（已知有毒试剂），请小心操作；    2）尽管目前尚未有数据表明Picogreen具有诱变性和毒性，但是该试剂能结合双链DNA，请操作时务必小心。

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    人体是一个庞大的细胞王国，里面居住着约40-60万亿的居民——细胞。由于医学技术的发展，我们逐渐了解到免疫细胞与干细胞的重要性，它们都在各自的领域内发光发热。    可是，同样作为细胞，干细胞与免疫细胞又有什么区别和共同点呢？干细胞和免疫细胞又分别有什么作用？而如今大火的 干细胞治疗与免疫治疗又是什么？    今天，我们就来好好聊聊干细胞与免疫细胞的那些事。    能力不同    人体万金油——干细胞    干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的原始细胞。在一定条件下，可以分化成多种功能细胞或组织器官，因此也被称为“万用细胞”。    当我们还是儿童时，干细胞源源不断的分化成各种新生细胞，为我们的生长发育、骨骼肌肉的形成提供原材料。    在胚胎发展阶段，干细胞能分化成所有的特化细胞；在成体组织里，干细胞担任身体的修复系统，补充成体组织。    健康卫士——免疫细胞    比起干细胞，免疫细胞显得更加的争强好胜。在整个免疫细胞的大家族内，主要的功能便是围绕着清除其他细胞而展开，清除外来病原微生物、衰老细胞、突变细胞甚至癌细胞，都是免疫细胞的分内工作。    每个人体内都存在着一定数量的癌细胞，每天都有新的衰老细胞、癌细胞产生。正是因为免疫细胞能够及时的清除它们，我们才能免于疾病的侵袭和癌症的发生。    然而随着年龄的增加，免疫细胞以及干细胞的功能数量以及活力逐渐减退，但是不用担心，免疫细胞疗法以及干细胞疗法可以为我们保驾护航。    职位不同    免疫细胞疗法    通过激活或增强人体免疫细胞的免疫疗法已经是目前最火的癌症治疗方式。    除此之外，免疫细胞在癌症预防、抗衰老等领域的应用也正在研究中。    干细胞治疗    如果说，免疫细胞主要用于癌症治疗，那干细胞就更偏向于组织修复和慢性病治疗。以脂肪干细胞为例，除了在美容抗衰外还可以应用在各种疾病治疗方面。    在老龄化日渐严重的情况下，脂肪干细胞也进入临床用于治疗阿尔兹海默症。在脊髓损伤和关节坏死等器官损伤时，都可以采用干细胞进行修复和治疗。    不仅如此，在死亡率第一的心血管疾病中，脂肪干细胞也能针对急性缺血卒中进行治疗。    尽管干细胞和免疫细胞在来源和功能以及应用方面都各不相同，但它们都在为人体健康，抵御疾病方面做出了贡献。相信随着日后更深入的了解，干细胞及免疫细胞将应用于更广阔的平台。

    胎牛血清和新生牛血清同为牛血清那么为什么人们一定要用胎牛血清而不用新生牛血清呢？想知道两者之间都有哪些区别？不妨看看以下小编归纳的几点内容。    1来源不同    胎牛顾名思义就是指还在母牛身体里的小牛，所以胎牛血清的采集工作，便是先从怀孕中的母牛身体里取出胎牛（通常5-8个月胎龄），之后对未发育完全的胎牛的心脏穿刺取血，完成采血的工作以后便再通过一系列的工艺处理获得胎牛血清。    而新生牛血清主要是采集已出生10天内的小牛，而且它们的发育相对于胎牛而言更加完全。    国产血清因为原料供应等原因，通常会选8个月以上，或足月刚出生的小牛取血，把它定义为类胎牛血清。但我们知道这时血清里的生长因子已经完全不同于胚胎发育时的生长因子。甚至于现在很多国产厂家已经把这类血清完全归类于胎牛血清，贴上胎牛血清的标签，卖着胎牛价格，却只起着新生牛的作用。    2组份与比例不同    虽然胎牛血清与新生牛血清的成分并不存在很大的差别，可是诸如促细胞生长因子和促贴附因子等组份并不相同，而且两者之间的激素以及其他活性物质的比例也不同。    胎牛血里的生长因子适合牛体内各种细胞生长，通常在8个月胎龄后慢慢消失。另外，胎牛血清的免疫球蛋白含量要远远低于新生牛血清，胎牛的血清相对来说比较纯，所以培养细胞的效果会更佳。    3.用途与用法不同    由于胎牛血清与新生牛血清存在细微差异，因此它们的用途与用法也不尽相同。    比如某些细胞只有使用胎牛血清才能顺利生长，但是有一部分的细胞并不是非胎牛的血清不可，新生牛血清可以完全满足这种细胞的生长需求。

    在体外研究和工业生产中，牛血清是常添加的细胞培养基成分。因其营养丰富，牛血清获得了广泛的应用。    但同时，牛血清也面临着伦理和科学的双重困境1。伦理上的困境是指胎牛血清在采集时，会使胎牛感到痛苦，因而是一种不人道的做法。科学上的困境是指牛血清给实验和生产带来的可重复性和安全性两大问题。前者是指牛血清含有许多未知成分，存在血清批间差异，后者是指血清可能含有不同量的内毒素、血红蛋白和其他不良因子，可能会有病毒、细菌、真菌、支原体等污染。    因而，西方近年来逐渐达成了共识，一旦有可替代的方法，则应不再使用牛血清。在选择细胞和组织培养基时，应采用“不……除非”的原则，即优先选择无动物源成分培养基，除非血清被证实为绝对需要。    全球也在逐渐开发无血清无动物源培养基。在这过程中，存在四类培养基，分别存在如下特点：    1）无血清培养基：可能存在动物/人组织或植物提取物。    2）无蛋白培养基：可能存在多肽组分。非完全限定。    3）无动物源成分培养基：含有植物、细菌或酵母成分。    4）化学限定培养基：成分完全明确。    化学限定培养基的特点是成分明确，成分可控；批间差异小；产物或代谢物容易分离；可避免使用动物。化学限定培养基常针对特定的细胞类型。    采用无血清培养基，对动物更好，也对科研更好。但开发无血清培养基工艺复杂。有时，化学限定的培养基对细胞的促生长性能不佳（和含血清配方相比）。    当然，也可通过添加一些关键成分或使细胞逐渐适应无血清培养基而逐渐克服。

    1、化学实验室基本要求    （1）进实验室必须穿工作服。    穿工作服必须达到100%，不得穿短裤镂空鞋进入实验室。其他防护措施，应符合具体实验要求。    （2）实验室必须保持整洁、有序。    地面无试剂、杂物，试验台干净整洁，通风橱整洁无试剂，洗缸配置合理，室内物品摆放有序不影响通行，冰箱、烘箱周围不得堆放易燃物。    （3）所有样品试剂必须有标签且明确清晰。    不使用无标签试剂。    （4）实验操作、药品管理、仪器使用、废弃物处理及用水用电安全要规范。    无违章冒险操作。试剂要分类存放数量合理且定期清理（含冰箱内药品），废试剂分类装桶回收严禁混装，不得将废试剂桶放在通风橱内，实验废试剂及实验垃圾要与生活垃圾分开处理。仪器不用时必须断电，特别是夜间不用的电脑、饮水机也必须断电，及时关闭不用的水龙头避免漏水。    （5）严格控制易燃、易爆化学品的储存数量，实验室中不得存放剧毒化学品。试剂无囤积情况，并放进相应柜内，常用试剂每日领取且当天用完，建立药品数据库。剧毒品当天领用，当天使用，剩余药品当天必须退库。    （6）严禁做有机化学实验期间脱岗。过夜实验应符合要求且要登记，应有人照看。    （7）单独一人不能在实验室做危险或有潜在危险的实验。    （8）钢瓶必须固定，实验室应按最低使用量放置钢瓶。装有易燃易爆、有毒有害气体的钢瓶必须做好相关防护。    （9）实验室不允许存放食品，不允许进食饮料食品、吸烟。    （10）通风橱移门尽量保持关闭。    2、危险化学品    化学品目前世界上大约有500-700多万种化学品，其中常用化学品有7万种。    危险化学品是指具有毒害、腐蚀、爆炸、燃烧、助燃等性质，对人体、设施、环境具有危害的剧毒化学品和其他化学品。    3、操作注意事项    实验前的准备    （1）用到的危化品查MSDS，清楚使用中的危险性；    （2）制定的实验步骤合理，仿照文献时，仔细斟酌其安全合理性，不确定，小量，缓慢升温，分批加料等方法。    （3）设备操作不清楚，请教师兄，师姐或老师，同时自己查设备的正确操作规程学习。    实验过程    （1）仔细观察反应得剧烈程度，设备的运行状态，现象是否正常，不确定时，缓慢升温，减小用量，查阅相关资料，确认后再操作；    （2）实验过程不得离开；    （3）自我保护：穿实验服，戴手套，防护眼镜，防护面具等，出现危险时首先确保自身安全    实验结束    （1）用到的所有物品正确归位，保管好样品，正确处理废液；    （2）正确关闭水电气，加热设备等，不能忘。    （3）作为实验室的一员，必须遵守实验室安全员的管理。

微生物是对药品原料、生产环境和成品造成污染的重要因素，也是造成生产失败、成品不合格、对人类造成危害的重要因素。因此，分离得到的污染微生物，进行微生物鉴定，是十分必要的，也可为检验和生产提供有效的依据。　　1、形态学特征　　(1)细胞形态　　在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。　　(2)群体形态　　群体形态通常是指以下情况的特征：　　在一定的固体培养基上生长的菌落特征：包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等。　　在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征：包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等;在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况。　　在液体培养基中生长情况：包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生沉淀，有无气泡，培养基的颜色等。如是酵母菌，还要注意是成醭状、环状还是岛状。　　2、生理生化反应特征　　(1)利用物质的能力　　包括对各种碳源利用的能力(能否以CO2为唯一碳源、各种糖类的利用情况等)、对各种氮源的利用能力(能否固氮、硝酸盐和铵盐利用情况等)、能源的要求(光能还是化能、氧化无机物还是氧化有机物等)、对生长因子的要求(是否需要生长因子以及需要什么生长因子等)。　　(2)代谢产物的特殊性　　这方面的鉴定项目非常多，如是否产生H2S、吲哚、CO2、醇、有机酸，能否还原硝酸盐，能否使牛奶凝固、冻化等。　　(3)与温度和氧气的关系　　测出适合某种微生物生长的温度范围以及它的最适生长温度、最低生长温度和最高生长温度。对氧气的关系，看它是好氧、微量好氧、兼性好氧、耐氧还是专性厌氧。　　3、生态学特征　　生态学特征主要包括它与其他生物之间的关系(是寄生还是共生，寄主范围以及致病的情况)。在自然界的分布情况(pH情况、水分程度等)、渗透压情况(是否耐高渗、是否有嗜盐性等)。　　4、血清学反应　　很多细菌有十分相似的外表结构(如鞭毛)或有作用相同的酶(如乳酸杆菌属内各种细菌都有乳酸脱氢酶)。虽然它们的蛋白质分子结构各异，但在普通技术下(如电子显微镜或生化反应)，仍无法分辨它们。然而利用抗原与抗体的高度敏感特异性反应，就可用来鉴定相似的菌种，或对同种微生物分型。　　用已知菌种、型或菌株制成的抗血清，与待鉴定的对象是否发生特异性的血清学反应来鉴定未知菌种、型或菌株。该法常用于肠道菌、噬菌体和病毒的分类鉴定。利用此法，已将伤寒杆菌、肺炎链球菌等菌分成数十种菌型。　　5、生活史　　生物的个体在一生的生长繁殖过程中，经过不同的发育阶段。这种过程对特定的生物来讲是重复循环的，常称为该种生物的生活周期或生活史。各种生物都有自己的生活史。在分类鉴定中，生活史有时也是一项指标，如黏细菌就是以它的生活史作为分类鉴定的依据。　　6、对噬菌体的敏感性　　与血清学反应相似，各种噬菌体有其严格的宿主范围。利用这一特性，可以用某一已知的特异性噬菌体鉴定其相应的宿主，反之亦然。　　7、细胞壁组分分析　　细胞壁组分分析首先应用于放线菌分类中，把它作为区分“属”的依据之一。它比单纯用形态进行分类更全面。近年来，有人对18个属的放线菌的细胞壁进行了分析，根据细胞壁的氨基酸组成，将其分为6个细胞壁类型，又根据细胞壁的糖的组成分成4个糖类型，在此基础上，结合形态特征提出了相应的科属检索表。　　8、红外光谱　　一般认为，每种物质的化学结构都有特定的红外光谱。若两个样品的吸收光谱完全相同，可以初步认为它们是同一种物质。因此，红外光谱技术被应用到微生物的分类中。它先后对芽孢杆菌、乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌进行分类，近年来又应用于放线菌分类中。　　根据有关学者的试验表明，这种方法简便快速，样品少，结果较好，不仅可以初步了解各属菌的细胞成分的化学性质，同时也有助于微生物间系统发育关系的探索。但是它也有不足之处，借助于红外线光谱区分属内的种和菌株是困难的，但可以作为“属”的分类特征。

    客户提供    基因序列或蛋白质氨基酸序列    最终交付    约4 μg含有目的片段的高纯度冻干质粒DNA；    含有重组质粒的穿刺菌一管（TOP10）；    发货文件主要包括如下内容：测序结果、COA报告、sqd文件。    备注：默认合成克隆基因至pUC57载体    郑重承诺：对客户提供的核酸/氨基酸序列或基因合成的结果没有所有权，并承诺对结果严格保密，且不会以任何形式散布到第三方。    载体选择主要考虑下述3点：    1、构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。    2、载体的类型：    （1）克隆载体的克隆能力—据克隆片段大小（大选大，小选小）。尤其对于病毒载体来说，载体包装容量的大小是评估能否成功包装病毒的首要因素。    ①腺病毒可以插入长约8kb的外源基因。目前，我们包装过长度为7.5kb外源基因的腺病毒。    ②慢病毒的包装容量约为6kb（包含载体带有的其他抗性基因或报告基因），但是2kb以上的外源基因包装慢病毒难度就增加了，增大1kb会下降1个单位数量级的滴度，故2kb以上的基因包装慢病毒需要进行评估。此外，毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白（作为受体、转运蛋白行使功能）等由于其本身的功能，包装可能会有一定难度。    ③AAV的总包装容量是4.7 kb（包含载体中两个ITR约0.3kb +具体启动子 + 内含子约0.6kb + 具体荧光标签 + polyA约0.2kb），所以插入目的基因一般约2kb 左右。由于AAV包装容量有限，目的基因大于2kb，可考虑去除内含子，因为内含子只是有助于插入的目的基因稳定表达。    （2）确定表达蛋白的目的，然后再来选择优势的表达质粒。一般分为原核表达和真核表达质粒，前者主要用于体外纯化蛋白，如带His-tag的PET系列，带GST-Tag的PGEX系列，选用不同的表达载体，就得建立相应的纯化系统，包括缓冲液的配置、珠子/柱子的选择等等，还得考虑目的蛋白的可溶性，一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。这种原核纯化的蛋白一般用来制备单一的、需要量大的蛋白。真核表达载体一般是细胞、体内表达等需要时所用，只需要将它放到细胞或体内细胞即可，唯一考虑的是它的启动子的选择，常用都是cmv启动子的，表达效率较高，也有多种启动子经过改造的表达载体，一般用来表达需要调控表达时间及表达量的蛋白。    3、载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于连接，不产生阅读框架错位。    ①选分子量小的质粒，即小载体（1-1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；    ②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒    ③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；    ④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因。

    单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。    应用范围的选择。有的一抗只能用于 WB ( Western blotting）或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。    种属反应性的选择。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。    种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。

    （一）天然染料    1、苏木精     苏木精是从南美的苏木（热带豆科植物）干枝中用乙醚浸制出来的一种色素，是最常用的染料之一。苏木精不能直接染色，必须暴露在通气的地方，使他变成氧化苏木精（又叫苏木素）后才能使用，这叫做“成熟”。苏木精的“成熟”过程需时较长，配置后时间愈久，染色力愈强。被染材料必须经金属盐作媒剂作用后才有着色力。所以在配制苏木精染剂时都要用媒染剂。常用的媒染剂有硫酸铝按、钾明矾和铁明矾等。    苏木精是淡黄色到锈紫色的结晶体，易溶于酒精，微溶于水和甘油，是染细胞核的优良材料，他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。分化时组织所染的颜色因处理的情况而异，用酸性溶液（如盐酸—酒精）分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。    2、洋红    洋红又叫胭脂红或卡红。一种热带产的雌性胭脂虫干燥后，磨成粉末，提取出虫红，再用明矾处理，除去其中杂质，就制成洋红。单纯的洋红不能染色，要经酸性或碱性溶液溶解后才能染色。常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，碱性溶液有氨水、硼砂等。    洋红使细胞核的优良染料，染色的标本不易褪色。用作切片或组织块染都适宜，尤其适宜于小型材料的整体染色。用洋红配成的溶液染色后能保持几年。洋红溶液出现浑浊时要过滤后再用。    （二）人工染料    人工染料，即苯胺染料或煤焦油染料，种类很多，应用极广。它的缺点是经日光照射容易褪色，苯胺蓝、亮绿、甲基绿等更易褪色。在制片中注意掌握酸碱度，并避免日光直射，也能经几年不褪色。    1、酸性品红    酸性品红是酸性染料，呈红色粉末状，能容于水，略溶于酒精（0.3%）。他是良好的细胞制染色剂，在动物制片上应用很广，在植物制片上用来染皮层、髓部等薄壁细胞和纤维素壁。他跟甲基绿同染，能显示线粒体。    组织切片在染色前先浸在带酸性的水中，可增强它的染色力。酸性品红容易跟碱起作用，所以染色过度，易在自来水中褪色。    2、刚果红    刚果红是酸性染料，呈枣红色粉末状，能溶于水喝酒精，遇酸呈蓝色。他能作染料，也用作指示剂。他在植物制片中常作为苏木精或其他细胞染料的衬垫剂。他用来染细胞质时，能把胶制或纤维素染成红色。在动物组织制片中用来染神经轴、弹性纤维、胚胎材料等。刚果红可以跟苏木静作二重染色，也可用作类淀粉染色，由于他能溶于水和酒精，所以洗涤和脱水处理要迅速。    3、甲基蓝    甲基蓝是弱酸性染料，能溶于水和酒精。甲基蓝在动植物的制片技术方面应用极广。他跟伊红合用能染神经细胞，也是细菌制片中不可缺少的染料。它的水溶液是原生动物的活体染色剂。甲基蓝极易氧化，因此用他染色后不能长久保存。    4、固绿    固绿是酸性染料，能溶于水（溶解度为4%）和酒精（溶解度为9%）。固绿是一种染含有浆质的纤维素细胞组织的染色剂，在染细胞和植物组织上应用极广。他和苏木精、番红并列为植物组织学上三中最常用的染料。    5、苏丹Ⅲ    苏丹Ⅲ是弱酸性染料，呈红色粉末状，易溶于脂肪和酒精（溶解度为0.15%）。苏丹Ⅲ是脂肪染色剂。    6、伊红    这类染料种类很多。常用的伊红Y，是酸性染料，呈红色带蓝的小结晶或棕色粉末状，溶于水（15摄氏度是溶解度达44%）和酒精（溶于无水酒精的溶解度为2%）。伊红在动物制片中广泛应用，是很好的细胞质染料，常用作苏木精的衬染剂。    7、碱性品（复）红    碱性品红是碱性染料，呈暗红色粉末或结晶状，能溶于水（溶解度1%）和酒精（溶解度8%）。碱性品红在生物学制片中用途很广，可用来染色胶原纤维、弹性纤维、嗜复红性颗粒和中枢神经组织的核质。在生物学制片中用来染维管束植物的木质化壁，又作为原球藻、轮藻的整体染色。在细菌学制片中，长用来鉴别结核杆菌。在   尔根氏反应中用作组织化学试剂，已核查脱氧核糖核酸。    8、结晶紫    结晶紫是碱性染料，能溶于水（溶解度9%）和酒精（溶解度8.75%）。结晶紫在细胞学、组织学和细菌学等方面应用极广，是一种优良的染色剂。他是细胞核染色常用的，用来显示染色体的中心体，并可染淀粉、纤维蛋白、神经胶质等。凡是用番红和苏木精或其他染料染细胞核不能成功时，用它能得到良好的结果。用番红和结晶紫作染色体的二重染色，染色体染成红色，纺锤丝染成紫色，所以也是一种显示细胞分裂的优良染色剂。用结晶紫染纤毛，效果也很好。用结晶紫染色的切片，缺点是不易长久保存。    9、龙胆紫    龙胆紫是混合的碱性染料，主要是结晶紫和甲基紫的混合物。在必要是，龙胆紫能跟结晶紫互相替用。医药上用的紫药水，主要成分是甲基紫，需要时能代替龙胆紫和结晶紫。    10、中性红    中性红是弱碱性染料，呈红色粉末状，能溶于水（溶解度4%）和酒精（溶解度1.8%）。它的碱性溶液中呈现黄色，在强碱性溶液中呈蓝色，而在弱酸性溶液中呈红色，所以能用作指示剂。中性红无毒，常做活体染色的染料，用来染原生动物和显示动植物组织中活细胞的内含物等。陈久的中性红水溶液，用作显示尼尔体的常用染料。    11、番红    番红是碱性染料，能溶于水和酒精。番红是细胞学和动植物组织学生常用的染料，能染细胞核、染色体和植物蛋白质，示维管束植物木质化、木栓化和角质化的组织，还能染孢子囊。    12、亚甲蓝或美蓝    亚甲蓝或美蓝是碱性染料，呈蓝色粉末状，能溶于水（溶解度9.5%）和酒精（溶解度6%）。亚甲蓝是动物学和细胞学染色上十分重要的细胞核染料，其优点是染色不会过深。    13、甲基绿    甲基绿是碱性染料。它是绿色粉末状，能溶于水（溶解度8%）和酒精（溶解度3%）。甲基绿是最有价值的细胞和染色剂，细胞学上常用来染染色质，跟酸性品红一起可作植物木质部的染色。

    活体光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光（bioluminescence）技术与荧光（fluorescence）技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，今天，生物发光标记物可以标记到任何一种基因上，使对基因功能的全面细致研究成为现实。而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记，利用荧光蛋白在外源光源或是内源发光照射下被激发产生的荧光作为检测信号。研究人员能够利用一套非常灵敏的光学检测仪器直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。    该技术可被广泛应用于标记细胞或基因的示踪及检测；基因治疗在活体动物体内直接的观察和检测；基因组、蛋白组学、药学及生物技术在活体动物内的研究；药物及化学合成药物的药物代谢及毒理学监测；食品菌落生长成像；皮肤医学中皮肤疾病的体内成像；法医鉴定；微孔板成像，例如：免疫分析、报告基因、基因探针和嗜菌作用分析等；荧光团的体内成像，例如：Alzheimer疾病研究中结合嗪的β-淀粉沉淀物分析；转基因植物中通过报告基因对生理周期节奏的研究；凝胶成像分析等等。    但在研究过程中，研究者们必须事先用基因技术进行荧光素酶基因标记，或者某种荧光报告基团标记。目前活体光学成像系统的知名制造商，如Berthold、GE、Xenogen、Photometrics、Carestream Health等，不仅为客户提供先进的仪器，也提供具体实验所需的整套解决方案，包括试剂、实验手册、特殊用途的质粒、细胞株、转基因动物、细胞处理和动物处理设施等配套技术支持。出色的多任务处理能力，人性化的整体设计，便捷精确的操作系统，使实验室影像分析领域进入了一个全新的时代。    下面以研究干细胞活体移植后的存活率为例，简介一两种内源性荧光色素标记的实验方法，供专业人士参考。    用荧光色素DiD标记 间充质干细胞    1. 先用胰蛋白酶消化待标记材料，使之成为一定密度的悬浮液；    2. 从细胞培养箱中取出间充质干细胞，吸取含原有培养基的细胞悬浮液进行标记；    3. 用10 ml Mg/Ca-free PBS （不含钙镁离子的磷酸缓冲液）清洗细胞，吸去PBS， 钙镁离子会影响胰蛋白酶的活性，必须小心；    4. 加入预热的0.05% 胰蛋白酶液，加液量以T75型瓶为例，每瓶加5ml， 确保瓶的表面被完全覆盖；    5. 在细胞培养箱中37° C 孵育约 5 分钟；    6. 然后在显微镜下确认细胞已经完全分散，如果有细胞贴壁情况，轻拍若干次或延长孵育时间直至酶解消化完全成功；    7. 加入等量含 10% FCS的培养基中和胰蛋白酶；    8. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散；    9. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中；    10. 400 RCF离心5 分钟；    11. 小心移去上清液，不要扰动细胞；    12. 将细胞重新悬浮于DMEM 并进行计数；    13. 需要待标记细胞在无血清DMEM溶液中的密度应为1x106 /ml ；    14. 每ml细胞悬浮液加入5 ?L DiD 染色液；    15. 用移液器将染色液与细胞悬浮液混合均匀；    16. 在6孔低附着性细胞板上37 °C 孵育20分钟；    17. 孵育完全后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中；    18. 400 RCF离心5 分钟；    19. 小心移去染色液，不要扰动细胞；    20. 用PBS清洗细胞，用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散；    21. 重复洗三次；    22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性；    23. 可以进行活细胞成像了！    用荧光色素ICG标记 人胚胎干细胞    1. 必须先准备好吲哚菁绿溶液（血容量、心输出量、肝功能测定剂）作为对照品 ，然后使之与转染试剂鱼精蛋白（抗凝血作用）混合；    2. 测出1ml吲哚菁绿溶液的活力，然后在100 ?L DMSO中溶解ICG；    3. 向混合物中加入 400 ?L Dulbecco的改良Eagles 培养基 (DMEM + 10% 胎牛血清)， 震荡均匀，吲哚菁绿溶液终浓度为2mg/ml；    4. 加入转染试剂鱼精蛋白，鱼精蛋白作为对照品的载体，使之能够有效进入细胞；    5. 在300 ?L ICG 和 300 ?L 无血清Dulbecco改良 Eagles 培养基中混入 5 ?L 硫酸鱼精蛋白溶液, 使之终浓度为 10mg/ml,；    6. 震荡5分钟使之形成复合物，标记溶液制备完毕；    7. 从 hESC 10mm Petri 培养皿中移去原有培养基；    8. 加入5ml预热的 DMEM；    9. 加入制备好的鱼精蛋白/ICG 溶液， 37 °C下孵育1h；    10. 孵育完全后移去染色液；    11. 用5 ml PBS漂洗培养皿以清除染色液；    12. 移去 PBS 再加入 5ml 0.25 % 胰蛋白酶液，37 °C下孵育5分钟使之酶解，适当震摇培养皿效果会更好；    13. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散；    14. 加入等量含 10% KSR的培养基中和胰蛋白酶；    15. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中，400 RCF离心5 分钟；    16. 在全培养基中悬浮细胞；    17. 如果还有细胞团块，可以移去原有培养基用10ml预热的全ESC培养基重新悬浮细胞，重复酶解再离心；    18. 在这一点上，鼠源饲喂细胞需从hESCs中分离；    19. 然后将细胞悬浮液移至涂布琼脂的10 cm 培养皿中；    20. 37 °C 孵育 45 分钟，注意不要晃动培养皿，如此鼠源饲喂细胞会贴壁而干细胞保持悬浮；    21. 从Petri 培养皿中移出已标记的单细胞人胚胎干细胞悬浮液；    22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性；    23. 可进行活细胞成像了！

    一、样品的浓缩    生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：    1、减压加温蒸发浓缩    通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。    2、空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。    3、冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。    4、吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡luo酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。    5、超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。    二、干燥    生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。    三、贮存    生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。    1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。    2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲ben、苯甲suan、lv仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、peng酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。    3、贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。

    核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶。不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶（RNase）。    催化RNA水解的一种核酸内切酶。反应产物是单核苷酸和寡核苷酸。不同核糖核酸酶催化产物的低聚核苷酸组成有差别。核糖核酸酶T1使之产生单核苷酸和以3'-鸟苷酸为组成的或末端为3'-鸟苷酸的低聚核苷酸。核糖核酸酶T2使之产生单核苷酸和以3'-腺苷酸为组成的或末端为3'-腺苷酸的低聚核苷酸。    绝大部分的核糖核酸酶需要二价阳离子作为辅因子(例如Ca，Mg等)。因此活性可因乙二胺四乙酸(EDTA)的存在而阻断。胰核糖核酸酶是3'-嘧啶核苷酸由红酵母发酵液提制而得的核糖核酸酶，其药用油膏可局部外用于治疗外伤及关节疼痛。    有催化活性的核糖核酸（RNA）。是1981年切赫（T.Cech）最先发现的，以后由他命名，尚无统一的中文译名。和酶（蛋白质催化剂）相比，细胞内的RNA催化剂是极少的。现在已知的几十种天然RNA催化剂的绝大部分参与RNA的加工和成熟。按它们的作用方式可分为剪切型（把RNA前体的多余部分切除），和剪接型（把RNA前体的内含子部分切除并把不连续的外显子部分连接起来）。根据所作用的底物不同，又可分成自体催化和异体催化两类。绝大多数RNA催化剂以自身为底物进行自体催化，可以是自我剪切，也可以是自我剪接。RNA催化剂比酶的催化效率低，有的RNA催化剂具有多种酶的功能。如原生动物四膜虫的rRNA前体的内含子序列具有核糖核酸酶等5种酶的活性，其水解RNA的速率为每分钟两次，而胰RNA酶的作用速率则为每秒钟数千次。切赫和阿尔特曼（S.Altman）因对RNA催化剂研究的突出贡献，共获1989年度诺贝尔化学奖。    1.由红霉素产生的蓖的发酵液提取。    2.以牛胰为原料，稀硫酸匀浆后用硫酸铵分级沉淀，再经重结晶、羧甲基纤维素柱层析得产品。    3.以牛胰为原料稀酸抽提后用硫酸铵分级沉淀，在乙醇中重结晶制取。

    在免疫沉淀IP&免疫荧光IF如何正确的选择Flag标签抗体?    Flag标签系统是已被公认的用于表达、纯化以及检测融合蛋白的表达系统，广泛应用于Western blotting、免疫细胞组化、免疫共沉淀、流式细胞术、蛋白纯化以及蛋白相互作用、蛋白分离等多个研究领域。Flag标签是一个与重组蛋白相融合的由8个亲水氨基酸(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)组成的多肽片断。FLAG标签只有8个氨基酸组成，因此它不会占据其他表位与结合域，避免导致融合蛋白的功能、分泌性以及转运发生改变。由于它的亲水性特点，FLAG标签倾向于定位在融合蛋白表面，因此更易与抗体结合以及被肠激酶酶解。    由于Flag标签可位于蛋白质的C端或N端，这一系统已用于各种细胞类型，包括细菌、酵母和哺乳细胞。由于Flag标签系统的纯化条件是非变性的，因此可以纯化所有有活性的融合蛋白。EarthOx的Anti-Flag Tag Monoclonal Antibody可以用于检测和Flag标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测Flag融合表达蛋白等。比如在免疫荧光IF的实验里，同时配合EarthOx的Dylight 549荧光二抗，使用该抗体可以准确的定位出Flag融合表达蛋白在细胞内的位置。另外，做融合表达分析前，通过免疫共沉淀技术获得Flag融合表达蛋白也是非常重要的一步，因此选择一个合适的、可用于免疫共沉淀(Immunoprecipitation，IP)Flag标签抗体也是很必要的。EarthOx的Anti-Flag Tag Monoclonal Antibody不仅能应用于细胞内定位的IF实验，同样还能应用于IP实验。1:200甚至更高的IP实验稀释比率，也说明了该抗体本身的具有很高的效价，同时，因为是单克隆抗体，因此特异性也很高。高效价所对应的高稀释比率也意味着超高性价比。    除了上面所说的IP和IF实验，Flag标签抗体的基本应用还包括WB实验，EarthOx的Anti-Flag Tag Monoclonal Antibody在该应用中同样表现优异。说明书的推荐起始稀释比例是1:1000，但在实验中，在1:10000的稀释比率下也表现优异(EarthOx也进行了50000次以后的稀释，仍然显示出很好的条带显示，没有在说明书里列出)。因此EarthOx的Flag标签抗体不但能通过WB实验很好的满足融合蛋白表达量的分析，并且在免疫荧光IF、免疫沉淀IP的试验中也有很好的表现，能满足Flag标签融合蛋白的细胞内定位以及纯化的需要，而且其高效价和特异性，远远比其他Flag抗体具有更高的性价比。

    在所有RNA实验中，关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。    在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。    外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。    一、 防止RNA酶污染的措施    1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或geng长时间。    2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。    3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。    4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。    5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。    6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。    二、常用的RNA酶抑制剂    1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。    2. 异硫氰酸胍：目前被认为是有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。    3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。    4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。    5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑回复在操作严格，RNA量较多时，不用也可以的。RNA量少或者是微量时，使用抑制剂就很必要了。

    一、实验目的    1．熟悉常用微生物培养基的配制方法。    2．学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物稀释分离、划线分离接种。    3．用平板划线法和稀释法分离微生物。    4．认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。    二、实验原理    (一)微生物的分离与纯化    土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此，土壤是微生物多样性的重要插所，也是发掘微生物资源的重要基地，可以从土壤中分离、纯化得到许多有价值的菌株。    从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的是平板分离法。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对雪养、酸碱度、浓度和氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某些抑制剂抑制其他菌生长而利于此菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物．再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直至得到纯菌株。    (二)平板菌落计数法    平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞．统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。    平板菌落计数法虽然操作繁琐，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染程度的检测。    三、实验材料    土样10g，未知菌变形杆菌单菌落平板和无菌水．    取液器(5m1、l000ml各一支)，培养箱，培养皿(20个)，无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，5ml、1ml无菌吸头（移液管），记号笔，酒精灯，火柴，试管架，牙签，。    四，实验步骤    (一)培养基的制备(提前准备)    按以下步骤制备牛肉膏蛋白胨平板培养基，每组20个平板。配方参见附录I．    1．培养基的制备原则：适当的营养成分；合适的酸碱度，配制后经灭菌手续方可使用．    2．培养基配制的基本程序：称量一溶化一测定及矫正pH一过滤一分装—灭菌备用(若配制固体平板培养基，则先灭菌后再倾倒平板备用)。    3．培养基制备过程    (1)称量：按配方及配制的总量计算各种成分所需的量分别称取。    (2)溶解；将各种成分放入三角瓶(三角瓶体积要大于所装培养基体积2倍为宜)中，加自来水(一般配完全培养基用)或蒸馏水至所配培养基的总量，在微波炉中加热溶解，观察液体沸腾情况，在液体溢出之前，马上断开电源，反复多次，直到完全溶解。    (3)调pH值：初溶解好的培养基pH可能不符合要求，需用lmol／L NaOH或lmol／LHCI调pH至所需范围，    (4)过滤：趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于结果观察．一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去(本实验无需过滤)。    (5)分装；按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。    液体分装：分装体积不超过三角瓶体积一半。    固体分装：培养基高度为试管的1／3为宜，配斜面培养基时，一般每试管(直径为10mm)加5ml左右培养基。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。    半固体分装：培养基高度为试管高度的1／3为宜。    (6)加塞、包扎和灭菌；分装后，试管用试管帽，三角瓶用无菌培养容封口膜（棉塞）封好瓶口，作好标记，注明培养基的名称及配制日期。放人高压灭菌锅内，加热沸腾，排空锅内空气，以蒸汽剧烈喷出为准，然后升压到0.1MPa、稳压0.11MPa(121"C)灭菌20min，或全自动高压灭菌锅中设定121"C、15~20min灭菌，如果培养基体积较大或含有糖蜜等容易受污染的营养复合物时，可适当延长灭菌时间．    (7)摆斜面和倒平板；制斜面培养基时，应在未凝固前将试管有塞的一头搁在试管架底层、试管底部搁在桌面，形成斜面，斜度要适当，斜面长度约为试管长度的1／2，培养基上部离管口5cm以上，凝固后即成斜面．制平板培养基时，可将培养基冷却至60～70℃，无菌操作将培养基倒人已灭菌并干燥的培养皿中，让其自然流满整个子皿底或轻轻摇动培养皿，使其布满平皿底，盖上平皿盏，水平静置，等凝固后翻转培养皿．每平皿装量 15~20ml (490mm)，使厚度达2~3mm。倒平板时，一般叠放培养皿，以免过多蒸汽凝结在皿盖上。    (8)无菌检查；特制好的培养基置37℃温箱孵育24h，如无杂菌生长即可使用(此步一般省略)．    (9)较长时间不用的斜面或平板可用铝箔包好，放置4"C冰箱备用．    （二)周围环境中微生物的检测    在牛肉膏蛋白胨培养基平板上作如下实验：    l，取一个平板，分成4区，做好标记(下同)．用未洗过的手指头以及肥皂洗过1次、2次、3次的手指头(不用毛巾擦)分别在4个区上涂抹(用力一致)。    2．取一个平板，分区,用正在使用的纸巾、硬币分别在不同的区上拖动2～3次。    3．往培养基上放置一根头发，并用无菌涂布器压紧。    4．取一个子板，将稍稍打开的嘴唇在培养基上压一下，检查嘴唇上的细菌。    5．取一个平板，分区，用无菌接种环分别沾一环自来水、河水以及矿泉水在平板不同区上画线。    6．用无菌牙签取一点牙垢在一个平板培养基上画线。    7．取两个乎板，一个打开皿盖，置实验台上(空气中)l0min，另一个按无菌操作要求在酒精灯火焰边打开皿盖lmin。    8．取一个平板，打开皿盖，对着培养基咳嗽。    9．另两个平扳可根据自己的兴趣，自由用来检测。    以上平板用报纸包好倒置于37℃培养箱里培养24h观察结果。    任何一个实验，在动手操作前均需先用记号笔在培养皿底做好标记。标记包括培养物名称、班级、姓名、日期．标记应明了、占地少，并做在乎皿底边缘，不要做在中间，以免影响结果观察。    本组的平板要统一用报纸包好，在外面写上组号，以免同学拿乱，找不到自己的平板。    (三)从土壤中分离微生物    1． 采土样：选择较肥沃韵土壤，铲去表层土，挖5~20cm深度的或特殊要求的土壤数十克，装入已灭菌的牛皮纸袋，封好袋口，做好编号记录，带回实验室供分离用。    2． 制备土壤稀释液，称取土样1.0g，放人盛99ml无菌水井带有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡5min使土壤均匀分散成为土壤悬液(10-2)。用1ml的无菌吸头从中吸驻0.5ml土壤悬液，注人事先分装有4.5ml无菌水的试管中，吹吸3次，振荡均匀(10-3)。换一只新的无菌吸头，用同样方法，分别配置成稀释度为10-4、10-5、10-6的土壤溶液。    3． 涂布：用一只新的无菌吸头，分别由各浓度土壤稀释液中各吸取100μ1，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃涂棒涂匀，一定要多涂几遍，从概率角度来说，涂到细菌均匀分布为止，此步是实验成功的关键。每个浓度做3个平板。    4． 培养：将牛肉蛋白胨培养基平板倒置于37℃温箱中培养24h，统计所长出的菌落数．    5． 菌落计数；培养24h后，取出培养乎板，算出同一稀释度三个平扳上的菌落平均数，换算出土样中的菌含量。    有较大片菌苔生长时，弃用，以无大片菌苔生长的培养皿计数；如成片菌苔大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，将此一半计数×2。    选择平均菌落数在30~300间的平板。只有一个浓度符合此范围时，以该平均菌落数乘稀释倍数即为该样品中菌总数；有两个浓度平板的菌落数在30-300时，按两者菌落总数比值决定：比值小于2，取平均，比值大于2，取较少的菌落总数：    所有菌落数均大于300，取稀释度最高的平均菌落数乘稀释倍数；    所有菌落数均小于30，取稀释度最低的平均菌落数乘稀释倍数．    所有菌落数均不在30~300间，以最接近30或300的平均菌落乘以稀释倍数．

    在电泳实验或其他核酸分离实验中，常用EB来识别和显示核酸条带。EB被紫外线照射时能发出红褐色的荧光。尽管EB是一种高效的显色剂，但它的高危险性要求特殊的安全管理和回收流程。    EB是一种强诱变剂（可能造成遗传性危害），直接接触有中等毒性。EB可以通过皮肤吸收，因此应当避免一切与EB的直接接触。    致力于凝胶电泳实验的安全性，我公司*新研发的核酸荧光染料—GenGreen和蓝光切胶仪，解决了电泳实验染料毒性和紫外线对人体和核酸的伤害困扰。    GenGreen染料使用过程简单，稳定性好，同时因为其跑胶带型好，灵敏度高，背景低，而深受广大用户喜爱。    GenGreen核酸染料特点：    1.安全无毒    独特的油性和大分子特点，使其热稳定性好，不易挥发，不能穿透细胞膜，安全无毒。是新一代替代EB的*佳核酸荧光染料。    2.与蓝色可见光激发装置完美结合    蓝光切胶，双重安全。GenGreen核酸染料既适用于 254 nm紫外凝胶成像系统（与EB相同光谱特性），又与蓝色可见光激发装置完美结合，使用蓝光切胶仪切胶，既避免了紫外切胶对操作人员眼睛和皮肤造成的伤害，又避免了紫外对核酸产物的损伤。    3.高灵敏度，低背景    GenGreen核酸染料荧光信号强，背景信号低，具有高信噪比，在紫外成像下灵敏度与EB相当，但在蓝光下灵敏度比EB更高，使用也更加灵活方便。    4.稳定性极好    适用于微波或其他方法加热，可以在室温下保存。    5.广泛的适应性    适用于预制凝胶和凝胶电泳后染色，可用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳； dsDNA、ssDNA或    RNA染色。    6.操作简单：使用方法同EB    GenGreen激发光谱    Ex（nm）：254 Em（nm）：504    GenGreen核酸染料是为了攻克核酸染料毒性问题，而研发设计的一款油性及大分子物质，因为它的这种特性使其难以穿透细胞膜进入细胞内，正是这一特性降低了染料的细胞毒性。    相反， 由于SYBR Green I 能快速的被细胞吞入，而广泛地用于活细胞线粒体和核 DNA 染色。已知 SYBR Green I 对紫外线导致的突变有强烈的增强作用（ Ohta et al. Mutat. Res. 492 , 91(2001) ），SYBRGreenI 其高细胞膜透性，使它成为凝胶染色的有害物质。    分别用SYBR GreenI、GenGreen做细胞毒性试验测试。    目的：通过试验测试GenGreen是否能够穿透活细胞膜进入细胞核内。    一：安全性测试    （A）5min    GenGreen SYBR Green I    （B）30min    GenGreen SYBR Green I    在37°C下，分别使用1× SYBR Green I, GenGreen 对HeLa 细胞进行孵化，并分别在5分钟（A)和30分钟（B）后观察。实验显示SYBR Green I染料迅速进入细胞并将细胞内的核酸染成亮绿色，而GenGreen 则因为不能穿透细胞膜而完全没有进入细胞内, 足以证明GenGreen是安全的。    结论：    GenGreen因为不能穿透细胞膜而完全没有进入细胞（Hela细胞）内, 证明GenGreen是安全的。

    使用方法：    1．胶染法（用法同EB） （1）制胶时加入GelRed核酸染料（例如：每50mL琼脂糖溶液中加入5μL GelRed 10,000×储液，以此比例类推）。 （2）按照常规方法进行电泳。 注意事项： 此方法染色染料用量相对较少，500 μL染料大约可以做100块50 mL的胶。 由于GelRed具有良好的热稳定性，可以在热的琼脂糖溶液中直接添加，而不需要等待溶液冷却。摇晃，振荡或者翻转以保证染料充分混匀。也可以选择将GelRed储液加到琼脂糖粉末和电泳缓冲液中，然后用微波炉或其他常用方式加热以制备琼脂糖凝胶。GelRed兼容所有常用的电泳缓冲溶液。 含有染料的预制凝胶溶液可以大量制备，并长期保存直到使用。 此方法不适合预制聚丙烯xian胺凝胶，对于聚丙烯xian胺凝胶请使用泡染法。    2．泡染法 （1）按照常规方法进行电泳。 （2）用H2O将GelRed 10,000×储液稀释约3,300倍到0.1 M NaCl中，制成3×染色液。（例如将15μL GelRed 10,000×储液和5 mL 1 M NaCl加到45 mL H2O中）。 （3）将凝胶小心地放入合适的容器中，如聚丙烯容器中，缓慢加入足量的3×染色液浸没凝胶，室温振荡染色30 min左右，最佳染色时间根据凝胶厚度以及琼脂糖浓度不同而略有不同。对于含3.5～10％丙烯xian胺的凝胶，染色时间通常介于30 min到1 h，并随丙烯xian胺含量增加而延长。    注意事项：    1）用泡染法染色时，染料用量较多，单次使用的染色液可重复使用3次左右。3×GelRed染色液可以大量制备，在室温下避光保存直至用完。    2）如果总是看到条带弥散或分离不理想，建议使用泡染法染色以确认问题是否与染料有关。    3）如果染色后问题依旧存在，则说明问题与染料无关，请尝试：降低琼脂糖浓度、延长凝胶时间以保证边缘清晰、改进上样技巧或选择泡染法染色。    3．预染法（最省染料的染色方法，按25μL体积上样，500μL原液理论做20万个样品）    1）该方法适用于琼脂糖凝胶电泳和PAGE凝胶电泳    2）工作液的配制：用电泳缓冲液将10000×的GelRed原液稀释1000倍，即为10 X GelRed工作液。GelRed工作液可以置2-8℃冷藏一个月以上。    3）制胶：按常规方法制胶，不含任何染料。    4）样品染色：向分析样品中加入GelRed工作液和载样缓冲液，室温放置10分钟，使GelRed与样品中DNA充分结合。GelRed工作液加入量为总上样量的1/10，使GelRed在上样时的终浓度为1X.    5）DNA Marker染色：将5μL DNA Marker和1μLGelRed工作液混匀，室温放置5分钟，使GelRed与DNA充分结合。    6）上样、电泳：按常规操作。 注意事项： 根据染料分子量小，带电荷少的特性开发本染色方法，按照一块胶10个样品计算，500μL原液理论上可以完成2万块胶的染色。

1.引言　　质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA。细菌质粒的相对分子质量大小从1kb至200kb以上不等。一些质粒永远独立于染色体之外，另外一些质粒在一定条件下会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子（简称cccDNA）。　　由于质粒分子小、便于分离和提取的特点，在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒可通过连接外源基因构成重组体，携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，因此质粒是基因工程中一种非常重要的载体。质粒特征的分析已被广泛用于细菌种属鉴定、耐药性、毒力及同源性分析。近年来由于基因芯片技术的出现，质粒基因探针的开发和应用也得到了飞速的发展，所以这就要求我们从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA。因此，质粒DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。　　提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱裂解/碱变性法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的，适用于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。　　碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。　　在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶pH值不同。在pH12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；质粒DNA的大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当用pH值4.8的KAc（或NaAc）高盐缓冲溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。　　电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。　　凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如EB染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。　　溴化乙锭（EB）是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现凝胶中的核酸分子。在适当的染色条件下，荧光的强度是同DNA片段的大小（或数量）成正比。

　一、实验目的　　酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。　　二、实验原理　　（一）酶的提取　　1.酶的存在位置？　　存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位。　　2.如何将酶从细胞中分离？　　从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。如果酶仅存在于细胞质中，只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时如仅仅破碎细胞还不够，还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。其次，细胞中存在抑制物质，如酚，酸，离子等，它们通常在液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。酚易氧化产生醌，醌为一种强氧化剂，会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合，使蛋白质上的反应基团，如—SH，—NH2，通过1，4—加成反应而发生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物组织和提取液产生棕色，以致影响酶活性的测定。因此如果没有特殊需要，一般常选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗，在这些组织中一般酚类化合物含量较低。在提取过程中为了尽量减少酚类的影响，一般提取液常选用高pH值的缓冲溶液，因为在高pH值时，酚类大部游离而不与蛋白质形成强的氢键，但高pH值促进酚类氧化，同时降低酚类吸附剂（如PVP）的有效性，通常采用pH6.7梍7.2。已经知道PVP能与游离酚羟基形成强的氢键复合物，是酚类化合物的有效结合剂。在提取线粒体时加入可溶性PVP，提取可溶性酶时加入不溶性jiao联PVP（Polyvinyl polypyrrolidone，简称PVPP，或Polyclar AT），能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金属元素及PVP单体，可加10% HCl煮沸10分钟，用NaOH中和，再用水洗几次，直至中性，纯化后的PVPP不必干燥就可直接应用。　　植物细胞有坚韧的细胞壁，需要强烈的方法去破碎，少量样品可用研钵加石英砂研磨，或用玻璃匀浆器。大量样品则需用电动匀浆器。为减低研磨或匀浆过程中发热，所用器皿和溶液需要预冷，提取液的用量一般为组织的1梍5倍，用量大些有利于提高得率，但工作量大，一般宁可用量小些，将残渣再提取一次。提取匀浆时加入酚类结合剂PVPP，金属螯合剂Na2─EDTA，以及─SH化合物以保护蛋白质，或加入非离子型去垢剂如Triton X─100，以增加蛋白质的可溶度，常用于与膜脂结合的酶。总之，可以通过试验以确定提取蛋白质的zui佳条件。　　（二）分离和纯化　　1.酶的粗提液是否只有酶，有没有其它物质？　　上面制备得到的提取液中，除含有所需要的酶外，还含有其他蛋白质，以及其他大分子和小分子化合物杂质。　　2.如何将酶从粗提液只分离纯化？　　要在许多蛋白质的混合物中分离出所需要的酶蛋白，目前常用的方法有盐析法，往层析法，薄膜超滤法，亲和层析法，电泳法等。在大体积的提取液中一般先采用硫酸铵分级盐析沉淀。盐析法是提纯酶使用zui早的方法之一，迄今仍广泛使用，而且在高浓度的盐溶液中酶蛋白不易变性而失去活性，利于工作在室温中进行。不同蛋白质在高浓度的盐溶液中溶解度有不同程度的降低，盐析法就是利用这一性质，将不tong性质的蛋白质分离，选择合适饱和度的硫酸铵，使沉淀的蛋白质的酶活性zui大。大多数酶的活性存在于35梍45%和45梍55%饱和度硫酸铵沉淀的部分，但也有存在于65梍80%饱和度的（如花椰菜根的过氧化物酶）。沉淀的蛋白质经离心后收集之，再溶于少量缓冲溶液中，经透析或凝胶柱过滤，以除去硫酸铵及其他小分子杂质，然后再经过柱层析分离。由于吸附剂的不同，又有吸附柱层析、离子交换柱层析和凝胶过滤柱层析等。对于不同的支持物采用的洗脱方法也不同，分子筛类型凝胶过滤柱层析，洗脱液只要用一定浓度的缓冲液就可以了，亦即等浓度洗脱。对于吸附柱和离子交换柱层析，往往要采用浓度梯度溶液进行洗脱，zui方便的是线性梯度浓度，当然用非线性梯度会得到更好的分离效果。柱层析一般都需要自动收集仪，如果能配用蛋白质检测仪就更好了。目前柱层析和硫酸铵分级沉淀一样，已经成为一种常规的酶的分离提纯的步骤之一了。　　近年来纯化酶常用的一种有效方法为亲和层析。主要利用酶和底物、抑制剂或辅酶具有一定的结合能力，这一性质即可用来分离、提纯酶。首先选择一支持物，如琼脂糖（Sepharose）将底物、竞争性抑制剂或辅酶，以共价键的形式连接到支持物上，然后把含有酶的溶液，流过装有专一性底物、竞争抑制剂或辅酶的层析柱，酶即被保留在支持物上，再经过充分洗涤除去未被吸附的杂质，然后用含有一定浓度的底物或竞争性抑制剂或辅酶的缓冲液，进行竞争性洗脱。如果亲和剂选择合适，往往能得到较高纯度的酶，是酶分离、纯化中既方便又zui有效的一种方法。　　（三）酶活力的测定　　酶的活力表现为催化某一反应的速度，反应速度越大，酶的活力也越大，酶催化的反应速度可以用单位时间内底物的消耗量或产物的积累量来表示。由于酶的催化作用和周围环境的关系十分密切，环境的温度、pH、离子强度等都对酶的活力有很大的影响，因此测定酶活力时应该使这些条件保持恒定。　　酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分钟所分解的底物量（或生成的产物量）μmol数表示之。测定酶活性的方法很多，常因反应的底物和产物的性质不同可选用不同的方法，应用zui广泛的是比色法或分光光度法。凡反应系统中的化合物在紫外区或可见光区有吸收峰的都可以用这种方法进行测定。如果酶催化的是一需氧反应，如氧化酶，则可用测压法或氧电极法。如果催化的反应系统中需要ATP或产生ATP，如一些激酶；或是有NAD存在，如一些脱氢酶和氧化还原酶；或者反应产生H2O2，如一些氧化酶，这些酶的活性可以用生物发光或化学发光方法进行测定。总之，测定酶活性的方法很多，应根据具体情况选择合适的方法。　　三、材料、仪器与试剂　　要求用硫酸铵分级沉淀部分纯化过氧化物酶。　　（一）、材料：花椰菜根　　（二）、仪器（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定）　　冰冻离心机；751型分光光度计；电磁搅拌器；组织捣碎机；天平；量筒；移液管；烧杯；透析袋。　　（三）、试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制）　　PVPP；硫酸铵；0.02mol/L KH2PO4溶液；0.lmol/L 磷酸钾缓冲液，PH6.0。　　四、实验操作　　(1)酶的提取：取花椰菜根（或其他植物材料）用自来水洗净，吸干水分，称得鲜重，按每g5ml提取溶液，加入预冷的0.02mol/L KH2PO4溶液，加入材料鲜重10%PVPP（预先经过纯化，用蒸馏水吸胀）。在预冷的组织捣碎机中搅成匀浆。匀浆倒在烧杯中，于冰箱中浸提1小时，用4层纱布或尼龙布袋过滤，滤液于18000r/min冷冻离心15分钟，弃去沉淀，上清液即为酶的粗提取液。　　(2)硫酸铵分级沉淀：用量筒量得酶液的体积，吸取5ml留作酶活性及蛋白质含量分析，保存在冰箱中，其余酶液加入固体硫酸铵，使达35%饱和度（参阅附表8），加硫酸铵时要缓慢，以避免造成局部浓度过高，在电磁搅拌器上边搅拌边加入。然后置冰箱中半小时，离心如上。分别收集上清液和沉淀，上清液中再加入硫酸铵使达65%饱和度，再离心，收集沉淀和上清液。按这样的方法分别收集0梍35%、35梍65%、65梍80%、80梍100%饱和度硫酸铵沉淀。每部分沉淀分别复溶于1/20原始提取液体积的0.02mol/L KH2PO4溶液中，装入透析袋中，用大量KH2PO4溶液（2000ml）在冰箱中进行透析过夜，其间更换KH2PO4溶液约4次，直至无SO42-析出为止（用BaCl2溶液检查）。透析完毕后，分别量得适量体积，保存于冰箱中备用。　　(3)蛋白质含量的测定：将原提取液及经硫酸铵分级沉淀得到的各分部溶液，用Folin试剂或考玛斯蓝G—250（参阅实验56）测定蛋白质含量，以牛血清蛋白作标准。