《Nature Genetics》杂志详细介绍了这种称为Cis表达或cis-X的方法，这是一种创新的分析方法，在患者肿瘤的调控非编码DNA中识别新的致病性变体和由这种变体激活的癌基因。cis-X通过识别肿瘤RNA的异常表达发挥作用。研究人员分析了白血病和实体瘤，并证明了这种方法的有效性。不编码基因的非编码DNA占人类基因组的98%。越来越多的证据表明，超过80%的非编码基因组是功能性的，可能调节基因表达。大量人群研究已经确定了非编码DNA中与癌症风险升高相关的变异。但是，在肿瘤基因组中，只有少量的非编码变异导致了肿瘤的发生。发现这些变异需要对大量肿瘤样本进行全基因组测序分析。“cis-X是一个根本性的改变，现有的方法需要数千个肿瘤样本，只识别反复发生的非编码变体，”St.Jude计算生物学系主任Jinghui Zhang博士说。她和上海儿童医学中心的Yu Liu博士是本文的通讯作者。刘博士也是第1作者。“通过使用异常的基因转录来揭示非编码变体的功能，我们开发了cis-X，从而能够在单个肿瘤基因组中发现驱动癌症的非编码变体，”张博士说。“识别导致癌基因失调的变异可以将精-确医学的范围扩大到非编码区域，以确定抑制肿瘤中异常激活癌基因的治疗方案。”cis-X的灵感来源于2014年Dana Farber癌症研究所的Thomas Look医学博士及其同事的一篇科学论文。Look也是这篇论文的合著者。Look的研究小组在细胞系中发现了导致癌基因（TAL1）异常激活导致T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）的非编码DNA变体。这项研究促使张博士继续她长期以来的兴趣，即研究基因每个拷贝的表达变化。cis-X通过两种方式寻找表达改变的基因。研究人员利用全基因组和RNA测序来寻找只在一条染色体上表达并在异常高水平表达的基因。“当分析等位基因之间基因表达的不平衡时，可能会产生噪音，”刘博士说。“这项分析使用了一种新颖的数学模型，使cis-X成为一种强大的发现工具。”然后cis-X通过在3D基因组结构中寻找非编码DNA调控区域的变化来寻找异常表达的原因。“这种方法模仿了变种在活细胞中的工作方式。这些变化包括染色体重排和点突变等变化。“如果不确定非编码变体，我们可能无法全面了解导致癌症的原因。”研究人员使用cis-X分析了13例T-ALL患者的癌症基因组，这些数据是由圣裘德和上海儿童医学中心合作收集的。该算法识别已知和新的癌基因激活非编码变体，以及可能的新的T-ALL癌基因PRLR。研究人员还表明，这种方法在成人和儿童实体瘤中有效，包括神经母细胞瘤。实体瘤对分析提出了更大的挑战。与白血病不同的是，实体瘤分布在肿瘤内的染色体数目往往不均匀。“cis-X为研究非编码变体在癌症中的功能作用提供了一种强有力的新方法，这可能会扩大精-确药物治疗由此类变体引起的癌症的范围，”张博士说。

 一项小鼠的新研究发现了一种之前未知的，膳食纤维来源的分子与免疫细胞蛋白之间的相互作用，这种相互作用触发了针对沙门氏菌感染的保护作用。这一研究发现公布在9月29日的PLOS Biology杂志上，由日本庆应义塾大学医学院的Hitoshi Tsugawa及其同事发表。先前的研究表明，肠道中的微生物会将摄入的纤维分解成称为短链脂肪酸的分子。短链脂肪酸似乎可以通过影响免疫细胞（包括巨噬细胞）的活性来防御沙门氏菌等病原体。然而，短链脂肪酸与免疫细胞相互作用的机制仍不清楚。为了geng好地了解短链脂肪酸的保护作用，研究人员进行了一系列实验。首先，他们将短链脂肪酸附着到合成的“纳米珠”的表面上，并这个结构进入具有巨噬细胞特征的细胞内，以确定细胞中哪些蛋白质与脂肪酸相互作用。研究结果揭示了短链脂肪酸可以与一种称为凋亡相关斑点样蛋白ASC（apoptosis-associated speck-like protein）的蛋白结合，这是一种以前未知的相互作用。 ASC是所谓的炎性体复合物的一部分，是一种蛋白质结构，有助于激活炎症反应，抑制病原体。在巨噬细胞中进行的进一步实验表明，短链脂肪酸通过与ASC结合，并触发炎症小体活化来保护免受沙门氏菌感染。研究人员在小鼠实验中证实了他们的发现。当沙门氏菌感染的小鼠被喂食短链脂肪酸或其膳食纤维前体时，与ASC结合的脂肪酸会触发炎症小体活化，并延长小鼠的存活时间。这些结果为膳食纤维对免疫系统的影响提供了新的见解。需要进一步的研究来确定这些发现对人类的适用性，并研究短链脂肪酸对免疫系统的其他潜在影响。

新生牛血清（Newborn Calf Serum）是来自刚出生~出生后2周内的新生牛静脉取血。经大规模混合后除菌过滤制成成品，主要用于动物细胞培养，是医药生物技术产品的重要原材料之一，其质量好坏直接影响细胞生长情况。总蛋白含量是新生牛血清需要检查的指标。它属于化学成分的初步分析。有人统计过国产新生牛血清的蛋白含量1，在比较各产区各年份后，发现其含量在3.7%~4.4%之间。进口新生牛血清并不与之完全一致。因为国内的血清常采自奶牛，而国外的血清常采自肉牛。蛋白质是新生牛血清的主要成分，在细胞培养中起着维持渗透压、pH 值缓冲、物质运输和提供营养、促进细胞粘附等重要作用。在胎牛血清中，其总蛋白含量要更低。血红蛋白含量也是新生牛血清一项重要检测指标。它是在血清运输和加工过程中细胞裂解释放到血清中的。之所以检测主要是由于牛血清中血红蛋白具有氧化性，其含量过高会引起羧基的产生和脂质过氧化反应，从而导致生产细胞受损，也会增加下游纯化处理的难度，给药品质量带来安全隐患2。有报道血红蛋白具有神经毒性。在脑皮层细胞的体外培养中，培养24小时后，血红蛋白会造成神经元的广泛死亡（EC50为1-2.5μM）3。在《中国药典》三部（2015 版）中，要求对新生牛血清中血红蛋白含量应不高于200 mg／L，方法主要为分光光度法。使用时常见问题及解决方法：一、保存血清zui好的方法?血清应保存在-5℃至-2O℃若存放于4℃时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议将无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。二、如何解冻血清才不会使产品质量受损?将血清从冷冻箱取出后，先置于2-8℃冰箱使之溶解，然后在室温下使之全溶。但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。三、如何避免沉淀物的产生?1.解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-2O℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。2.解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生3.请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。4.血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。5.若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。四、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。但不建议以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。

　　1.细胞在体外培养时应该贴壁吗？　　答：大部分来自实体组织器官的细胞会贴壁。它们在机体内时，也是与其他细胞或者细胞外基质结合的。一般一种细胞具有一种特定的功能，不同种细胞有机组合在一起，就能构成协同完成某些功能的器官1。　　2. 细胞贴壁的原理是什么？　　答：贴壁的过程可能是这样的：细胞首先分泌细胞外基质，这种细胞外基质黏附在支持物的表面（如培养瓶、培养皿的底面）。细胞通过其表面的黏附因子与这些细胞外基质结合。所以细胞贴壁与否与细胞本身分泌细胞外基质的能力以及细胞本身表达的黏附分子的数量有关，也与培养皿壁的表面结构有关1。培养基中的黏附蛋白也会掺入到细胞外基质中。　　例如，曾有人用胎牛血清培养大鼠肾脏细胞，发现大鼠肾脏细胞形成的外基质层中，除了有肾脏细胞自身合成的纤黏连蛋白外，也含有胎牛血清中的纤黏连蛋白2。　　又有人培养骨髓间充质干细胞（MSCs），发现钴60照射过的塑料培养瓶（照射剂量6Gy）能促进贴壁，其效果和IV型胶原包被的培养瓶相同。这可能与射线改变了培养瓶壁的表面结构有关3。　　3. 贴壁有什么好处吗？　　答：贴壁对维持细胞的良好形态和促进细胞的增殖有益处。有人培养许旺细胞，发现贴壁良好的细胞，其增殖率也较高4。人的造血干细胞培养，更是需要有贴壁细胞构成“造血微环境”。有人发现这些贴壁细胞包括成纤维细胞，巨噬细胞，上皮样细胞，脂肪细胞，它们交错连接，构成网状支架结构5，6。　　4. 对于某些悬浮细胞,能促进它贴壁吗？　　答：有人介绍过一种使悬浮的肝癌细胞贴壁的方法，即采用多聚赖氨酸浸泡过的盖玻片，放置到培养瓶中，可使悬浮的肝癌细胞贴壁7。包被过其他细胞外基质的载体表面，也可促进细胞黏附。　　5、不同细胞外基质对细胞粘附的效果一样吗？　　答：不会完全一样。具体看是哪种细胞。软骨细胞对II型胶原的黏附性较好；上皮细胞在Ⅳ型胶原底物上贴壁良好，而在I、II、III型胶原底物的培养板上贴壁情况较差。纤黏连蛋白能够加速成纤维细胞贴壁，但对表皮细胞、晶状体上皮细胞和乳腺上皮细胞贴壁则无此作用4。　　6、牛血清对细胞粘附有作用吗？　　答：有。牛血清中含有玻连蛋白、纤黏连蛋白，对细胞粘附都有促进作用8。需注意，热灭活小牛血清会降低血清对细胞粘附的促进作用，尤其在细胞旋转培养时更为明显9

　　正值国庆佳节之际，首先感谢您对远慕生物一直以来的支持。在您的支持和信赖下，我们才得以在激烈的市场环境下不断进步！　　根据国家法定假期的规定，并结合公司实际情况，现对国庆节放假做如下安排：2020年国庆节和中秋节是同一天。十一国庆放假共8天，从10月1日至10月8日放假调休，10月9日正式上班，其中在9月27日(星期日)、10月10日(星期六)都需上班。如有需要请客户及早下单备货以免耽误您的宝贵时间。　　今年的国庆节恰逢中秋节，因此国庆节和中秋节一共有 8 天小长假。据预测，在国庆长假期间，将有许多人外出旅行或回家。对于那些驾车途径高速的人来说，有必要了解一下 2020 年国庆节的高速免费时间。国家交通部日前发布了关于今年国庆及中秋期间免收小型客车通行费的方案，详情如下：　　1、根据国务院办公厅通知精神 2020 年国庆节、中秋节放假安排通知如下： 10 月 1 日(星期四)至 8 日(星期四)放假调休，共 8 天。 9 月 27 日(星期日)， 10 月 10 日(星期六)上班。　　2、根据国家交通运输部zui新发布的 2020 年《重大节假日免收小型客车通行费实施方案》，仅针对春节、清明节、劳动节、国庆节四个重要节假日，实施 7 座(包括 7 座)以下小型客车高速公路免费通行的政策，但不包括元旦、端午节。　　3、高速免费规定时间： 2020 年 10 月 1 日 0 时- 10 月 8 日 24 时，共 8 天，免费时段从国庆中秋节假日的第1天00∶ 00 开始，节假日zui后一天24∶ 00 结束(普通公路以车辆通过收费站收费车道的时间为准，高速公路以车辆驶离出口收费车道的时间为准)。　　4、高速规定免费车型：高速免费通行的车辆范围为行驶收费公路的 7 座以下(含 7 座)载客车辆，包括允许在普通收费公路行驶的摩托车。　　5、高速免费范围：各地机场高速公路免费通行的收费公路范围要符合《中华人民共和国公路法》和《收费公路管理条例》规定，依法批准设置的收费公路(含收费桥梁和隧道)。各地机场高速公路是否实行免费通行，由各省(区、市)人民政府决定。　　节假日期间我司不安排人员值班，如有产品咨询以及技术问题留言到我司网站，我们会在节假日为您报价处理，感谢您对上海远慕生物的信赖和支持！在此我司全体员工提前祝各位科研人员以及新老客户节日快乐！　　远慕生物特此通知。

一般来说，细胞进行转移和保存，最佳的策略是进行低温保存（-70℃~-196℃），而细胞深低温保存的基本原理是：在-70℃以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故而可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程，在此温度范围内，冰晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。经过前人的长期试验，发现细胞的冻存及复苏基本原则是 慢冻速融，这样可以最大限度的保存细胞活力。 目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用 快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。No.1  材料准备1. 仪器：净化工作台、 离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。2. 玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、 培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸。3. 塑料器皿： 吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1～2ml）。4. 其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。5. 试剂：D-Hanks液、胎牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。No.2  细胞冻存1、10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌种保存很少用于细胞冻存。2、取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。3、离心1000 rpm,5 min。4、去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5x10^6/ml~1x10^7/ml。5、 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。6、冻存：标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min；当温度达到-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。No.3  细胞复苏1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。3. 离心， 1000 rpm，5 min。4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。5. 次日更换一次培养液，继续培养。冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。慢冻程序1. 标准程序：采用细胞冻存器当温度在-25 ℃以上时， 1~2 ℃/min；当温度达-25 ℃以下时， 5~10 ℃/min；当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。2. 简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1~2 ℃的速度，在40 min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。3. 传统程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽长期储存。No.4 细胞计数及存活测试1、原理：(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。(2)血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10 -4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。(3)存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。2、材料：0.4%w/v trypan blue；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish、0.05gram preservative methyl paraben溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。3、步骤：(1)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。(3)计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。注：4大格细胞总数×稀释倍数×10 4/4=细胞数/ml   每一大格的体积=2.5px×2.5px×0.25px=10 -4ml计数板计数时，最适浓度为5～10×10 5细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。注意要点：1、冷冻越慢越好，复苏越快越好。2、与液氮接触的操作，注意戴保护眼镜和手套。细胞复苏时，水浴中摇动小瓶易爆炸。且DMSO为有毒致癌品，接触时带好手套。3、冻存细胞数量要足够，一般最低要达到5x10^6/ml。浓度视情况而定。4、做好标记：培养瓶上应该用马克笔做好标记，写上细胞名称、代数和冻存时间。5、对刚复苏的细胞动作要轻柔，避免细胞破裂。6、DMSO对大多数细胞不敏感，所以解冻之后不需要除去DMSO，解冻后频繁换液会慢慢除去DMSO。部分对DMSO敏感的细胞需要除去DMSO。7、解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清，突然换不一样的培养液和血清会造成细胞生长不良，甚至死亡。 

人体内有各种各样各司其职的细胞，白细胞、淋巴细胞保护我们免受细菌及病毒的侵害，红细胞携带氧气，血小板可以凝血……除了这些，人体内还有一种细胞功能更复杂，那就是有“万-能细胞”之称的干细胞。要知道，人体内的细胞都是有寿命的，例如红细胞一般有120天左右的寿命，120天后全新的红细胞就会代替那些老去的红细胞。那么，新的红细胞从何而来？其实，新的红细胞就是由干细胞中的造血干细胞分化而来。这就不得不提干细胞的五个特征：一是自我更新，指细胞分裂增殖的过程，产生的子代细胞仍维持亲代细胞的原始特性，比如，肝移植供者切除3/4的肝脏，可以在两周内完全恢复成原样。二是克隆源性，即单个细胞具有创造更多相同细胞的能力，一个细胞能复制成两个完全一样的细胞。三是高度分化潜能，即能向不同的组织分化。例如我们临床上已经成熟应用的白血病治疗方法——造血干细胞移植，其实就是利用了造血干细胞的分化功能，相当于更换了正常的干细胞。四是可塑性，指干细胞具有分化为其他类型组织细胞的能力。例如骨髓造血干细胞可以在适合的环境下分化为和脑组织的神经同类型的神经细胞。五是生物学特征，干细胞要想维持自我更新和分化的特性，需要特定的干细胞微环境，在不同的微环境中，干细胞可以发挥不同的能力。干细胞还是个大家族，根据不同的标准，可有多种分类。例如，根据来源不同，干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。胚胎干细胞主要来自囊胚的内细胞团，是一种高度未分化细胞；成体干细胞是对胎儿、儿童和成人组织中存在的多潜能干细胞的统称。相比于胚胎干细胞，成体干细胞来源较广，相对容易获取，并且源于患者自身的成体干细胞在应用时不存在组织相容性的问题，可避免移植排异反应和使用免疫抑制剂。按照发育潜能，干细胞又可分为全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞三大类。全能干细胞是指能够发育成具有各种组织器官的完整个体潜能的细胞，如受精卵；多能干细胞虽然能分化出多种细胞组织，但并不能发育成完整的个体，如胚胎干细胞；单能干细胞是指只能向单一方向分化、产生一种或几种密切相关类型的细胞，如造血干细胞、神经干细胞、心脏干细胞等。当前，干细胞研究已经成为医学领域和生物医学领域的热点之一。经过多年的研究积累，我国在干细胞研究领域也已取得了诸多成就，如利用干细胞开展脊髓损伤修复已初见成效。相信不久的将来，随着干细胞理论的日臻完善和干细胞技术的不断发展，“万能细胞”将为人类健康做出更多贡献。

开始了解干细胞时，一个最常见的问题就是“干细胞有什么类型？”目前，在实际应用中，干细胞按照其分化潜能进行分类，可以被划分为5种干细胞。这5种干细胞分别是：1、全能干细胞这类干细胞是现存的最强大的干细胞。它们能分化为胚胎以及胚胎外组织，如绒毛膜、卵黄囊、羊膜和尿囊。在人类和其他胚胎生物中，这些组织能形成胎盘。全能干细胞的最重要的特征是它能产生一个有完整功能的活体。全能干细胞的最著名实例是受精卵（来自精子和卵子结合形成的合子）。在受精后大约四天，这些干细胞开始专门分化为万能干细胞，与全能干细胞不同的是，万能干细胞虽然是灵活的一类细胞但不能形成一个完整个体。2、万能干细胞下一个最强大的干细胞类型是万能干细胞。这类干细胞类型的重要性在于它可以自我繁殖和分化为三种胚层（外胚层、内胚层和中胚层）之一。这三种胚层可以进一步分化形成人体内的所有组织和器官。有几类已知的万能干细胞类型。在天然万能干细胞中，胚胎干细胞是最好的例子。然而，也存在一种“人造的”万能干细胞，它即是诱导万能干细胞（iPS细胞）。iPS细胞分别在2006年于老鼠细胞和2007年于人类细胞中产生，它们是一种可以再重组变为功能与胚胎干细胞功能类似的组织特定性细胞。由于这种可以分化成多种组织的强大能力和其无争议的特质，因此万能干细胞非常适合于细胞治疗和再生医学中。3、多能干细胞多能干细胞是一种可以自我繁殖和分化成特定范围的细胞类型的中等范围的干细胞。这种类型细胞的绝佳例子是间充质干细胞（MSC）。间充质干细胞可以分化为成骨细胞，肌细胞，脂肪细胞和软骨细胞。这种细胞类型的特征是相当多样的，这就是为什么间充质干细胞被分类为多能干细胞。4、寡能干细胞下一种类型的干细胞是寡能干细胞，它与之前一类（多能干细胞）类似，但是它们的分化能力被进一步限制。这种类型细胞的好例子是造血干细胞（HSC）。造血干细胞是源自中胚层的细胞，可以分化成其他血细胞。具体来说，造血干细胞是可以分化成骨髓和淋巴细胞的寡能干细胞。骨髓细胞包括嗜碱性粒细胞，树突状细胞，嗜酸性粒细胞，红细胞，巨噬细胞，巨核细胞，单核细胞，嗜中性粒细胞和血小板，而淋巴细胞包括B细胞，T细胞和天然杀伤细胞。5、单能干细胞最后是单能干细胞，能力最有限的干细胞类型。这种干细胞类型的例子是肌肉干细胞。尽管肌肉干细胞可以自我繁殖和分化，但是它们只能变为一种细胞类型。它们的分化能力是单向的。干细胞分类的目的干细胞分类的目的是用基于其分化潜能来评估干细胞功能。最重要的是，每一类干细胞都有不同的研究应用、医学应用以及药学发展应用。这份指导可以帮助人们更好地理解干细胞类型的功能差异，以此更聪明地了解每种细胞类型的医疗潜能。

白细胞介素，最初指由白细胞产生又在白细胞间起调节作用的细胞因子，现指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。主要功能：（1）刺激活化B细胞增殖，分泌抗体；（2）刺激T细胞增殖及CTL(细胞毒性T淋巴细胞)活化；（3）刺激肝细胞合成急性期蛋白，参与炎症反应；（4）促进血细胞发育。【IL 1 alpha】重组人白介素-1a #CYT-253【IL 2】重组人白介素-2 #CYT-209【IL 3 】重组人白介素-3 #CYT-210IL1A（人源）ELISA试剂盒 #KA3055人白介素1a 酶联免疫斑点法PLUS（ALP） #3414-4APW-2白细胞介素-1 (IL-1)IL-1主要由巨噬细胞产生，此外几乎所有的有核细胞，如B细胞、NK细胞、体外培养的T细胞、角质细胞、树突状细胞、星形细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等均可产生IL-1。正常情况下只有皮肤、汗液和尿液中含有一定量的IL-1，绝大多数细胞在受到外来抗原或丝裂原刺激后才能合成和分泌IL-1。IL-1有两种不同的分子形式，一种称IL-1α,由159aa组成；另一种称为IL-1β，含153aa；两者由不同的基因分别编码。虽其氨基酸顺序仅有26%的同源性，然而IL-1α和IL-1β以同样的亲和力结合于相同的细胞表面受体，发挥相同的生物学作用。白细胞介素2 (IL-2 )IL-2是T细胞和NK细胞产生的15.5kD糖蛋白，在机体的免疫应答中起重要作用。IL-2zui重要的作用是诱导T淋巴细胞增殖（从G0期进入S期）和分化。人胸腺中的T细胞前体表达IL-2R?并分泌低水平的IL-2，这种自分泌作用可促进胸腺细胞增殖。IL-2参与调节T细胞受体基因的重排和表达。IL-2能诱导NK细胞增殖，增强NK细胞的活性，诱导LAK细胞和TIL，并刺激它们产生细胞因子。高剂量IL-2能引起单核巨噬细胞增殖和分化，并增强单核巨噬细胞杀肿瘤细胞的作用。在体内，IL-2有抗肿瘤、抗微生物感染、引起移植排斥和自身免疫以及免疫调节等作用。白细胞介素3 (IL-3)IL-3又称为多能集落刺激因子(Multi-CSF)，主要由活化的CD4+T细胞产生。其主要作用为促进骨髓中多能造血干细胞的定向分化与增殖，产生各种类型的血细胞。此外IL-3还可调节多种成熟细胞的生长、分化及相关的基因表达，如C-MYC、IL-2RA基因等。IL-3分子量约为15KD，其化学本质为糖蛋白。白细胞介素4 (IL-4)IL-4是一种由活化的T细胞产生的细胞因子，在B细胞生长的早期活化B细胞，并使被抗原、抗IgM或脂多糖活化的B细胞进入细胞周期G1期。IL-4增强MHCII类抗原的表达和CD23（FceRII）在B细胞上的表达，诱导同种型（isotype）转换，如促使小鼠B细胞从分泌IgM、IgG3、IgG2b转变成分泌IgG1、IgG2a、IgA和IgE。也增强单个核吞噬细胞表达MHCII类抗原，但对炎症性细胞因子（如IL-1,TNF,IL-8）的释放和这些细胞的杀菌活性有抑制作用。IL-4 也活化细胞毒性 T细胞，对于T,B淋巴细胞的发育以及驱动体液免疫反应和抗体产生都是十分重要的。白细胞介素5 (IL-5)人的IL-5由134氨基酸残基组成，含22氨基酸残基信号肽，2个糖基化点。小鼠IL-5由133氨基酸残基组成，含21氨基酸的信号肽，成熟IL-5分子含有112氨基酸残基，裸肽分子量12~15kDa，有3个糖基化位点，糖基化后分子量为18kDa，糖基化对于IL-5活性表达以及与相应受体的结合起重要作用。小鼠IL-5通常以二硫键连接的二聚体形式存在，分子量为45kDa。与其它IL相比，IL-5生物学活性作用谱相对较窄。白细胞介素6 (IL-6)白介素6 是一种多肽。IL-6由2条糖蛋白链组成;1条为α链，分子量80kd;另1条为β链，分子量130kd。α链缺少胞内区，只能以低亲合性与il-6结合，所形成的复合物迅即与高亲和性的β链结合，通过β链向细胞内传递信息。炎症反应发生后，IL-6率先生成，产生后诱导产生CRP和降钙素原（PCT）生成。如在发生感染、内外伤、外科手术、应激反应、脑死亡、肿瘤产生以及其他情况的急性炎症反应过程中会快速产生。IL-6参与许多疾病的发生和发展，其血液水平与炎症、病毒感染、自身免疫疾病密切相关，它的变化比 CRP 更早。研究显示，细菌感染后IL-6迅速升高，PCT在2h后增加，而CRP在6h后才迅速增加。

细胞染色和示踪试剂是跟踪复杂环境中细胞的重要工具，广泛应用于细胞迁移、创伤愈合及干细胞分化研究。细胞运动和定位研究需要专门的探针染料，必须要对活细胞无毒性，还要同时具有多种荧光颜色可供选择，以便与不同的仪器激光波长和滤光片匹配，并能与抗体标记或其他细胞分析标记探针共染色。 细胞染色和示踪试剂解决方案包括：活/死细胞双染试剂盒，活细胞示踪试剂盒（绿色荧光），细胞膜染色试剂盒，线粒体染色试剂盒，细胞染色试剂盒F-actin染色，TraKine™ Pro活细胞染色试剂盒，示踪试剂等。 活/死细胞双染色试剂盒 #KTA1001 活细胞示踪试剂盒（绿色荧光）#KTA1002 细胞周期染色分析试剂盒 #KTA2020 TraKine™ F-actin染色试剂盒 (绿色荧光) #KTC4008 TraKine™ F-actin染色试剂盒 (橙色荧光) #KTC4009 活细胞染色 TraKine™ Pro活细胞染色试剂盒是一系列长时超分辨率细胞染色成像组合，用 于标记活细胞和固定细胞的亚细胞结构。 细胞染色 全套细胞染色组合涉及细胞和细胞器，闪耀的活细胞成像 细胞示踪试剂 AbFluor™ 染料具有优异的核心结构、稳定的反应基团、良好的光稳定性，确保了生物偶联的高稳定性和高标记效率。

目前很多行业都需要购买各类符合国家标准的国产或者进口标准物质，一般来说，我们是通过正规的标准物质采购平台以及标准物质中心进行购买，采购需要按照相应的流程来进行，那么我们在采购标准物质的时候，需要注意哪些方面的问题呢?今天我们就为大家介绍一下。1、标准物质作为一种经由国家认可进行生产的对照产品，对于自身的质量和品质要求很高，在生产过程中具有严格的精确度要求，因此我们在购买的时候，应当选择经过国家认可的，具备有关专业生产资格的，正规、大型标准物质中心，充分确保我们所购买到的标准物质可靠放心。2、由于涉及到的标准物质种类和数量众多，具有很强的专业性，为了能够保证我们在购买的时候准确无误，您可以通过标准物质中心网站进行产品的咨询，也可以通过平台搜索功能，查找到所需的具体标准物质种类，经过反复核对确认无误之后，再进行购买。3、目前大型的标准物质中心提供的样品十分全面，各种标准品和对照品等种类可多达数万种之多，因此您在采购的时候应当注意了解全面的产品基础信息，并且进行筛选和购买，如果您在购买的时候有任何疑问，都可以通过平台的专业客服中心电话与我们进行咨询联系。今天我们为大家介绍了标准物质采购方面需要注意的一些问题，您可以参考以上流程步骤以及注意事项进行购买。国家目前对于标准物质的管控和认证十分严格，为了保证您所购买到的样品品质，注意所选择的应当是经过国家认可和批准的标准物质中心，方可放心购买。

对试剂和水的要求(1)试剂的纯度应在分析纯以上，且性质稳定，配成的溶液不易挥发和其他变化。标定标准溶液必须用基准试剂。(2)配制标准溶液的实验用水应符合GB/T 6682-2008中三级水的规格。草酸标准溶液配制0.1mol/L草酸标准溶液，称取6.3g草酸，溶于1000mL水中，混匀。标定准确量取30-35mL草酸标定液，加入50mL水和20mL10mol/L硫酸。用0.1mol/L高锰酸钾标准溶液滴定，近终点时，加热至70℃，继续滴定，至溶液所呈粉红色保持30分钟。同时作空白试验校下结果。氢氧化钠标准溶液配制将氢氧化钠配制成饱和溶液，注入内壁敷有石蜡的玻璃瓶中密闭放置至溶液清澈，取上清液备用。（1）1mol/L氢氧化钠标准溶液：移取52mL氢氧化钠饱和溶液，注入1000mL不含二氧化碳的水中，混匀。（2）0.5mol/L氢氧化钠标准溶液：移取26mL氢氧化钠饱和溶液，注入1000mL不含二氧化碳水中，混匀。（3）0.1mol/L氢氧化钠标准溶液：移取5 mL氢氧化钠饱和溶液，注入1000mL不含二氧化碳的水中，混匀。标定（1）1mol/L氢氧化钠标准溶液：称取105-110℃烘至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾6g，称准至0.0002g。溶于80mL水中，加热至沸，加入1%酚酞指示剂2-3滴。用1mol/L氢氧化钠溶液滴定至溶液呈现粉红色。（2）0.5mol/L氢氧化钠标准溶液：称取邻苯二甲酸氢钾3g，其余同上。（3）0.1mol/L氢氧化钠标准溶液：称取邻苯二甲酸氢钾0.6g加入水50mL，其余同上。盐酸标准溶液配制（1）1mol/L盐酸标准溶液：量取90mL盐酸，注入1000mL水中，混匀。（2）0.5mol/L盐酸标准溶液：量取45mL盐酸，注入1000mL水中，混匀。（3）0.1mol/L盐酸标准溶液：量取9mL盐酸，注入1000mL水中，混匀。标定（1）1mol/L盐酸标准溶液：称取于270-300℃干燥至恒重的基准无水碳酸钠2g，称准至0.0002g。溶于80mL水中，加入甲基橙指示剂2-3滴，用1mol/L盐酸滴定至溶液呈橙红色，煮沸2-3min，冷却后继续滴定至橙红色。（2）0.5mol/L盐酸标准溶液：称取无水碳酸钠1g其余标定同上。（3）0.1mol/L盐酸标准溶液：称取干燥恒重的基准无水碳酸钠0.2g，称准至0.0002g。溶于50mL水中，加入0.2mL混合指示剂（0.25%靛蓝二磺酸钠水溶液与0.1%甲基橙水溶液等量混合），用0.1mol/L盐酸滴定至溶液由蓝绿色转变成紫色。高锰酸钾标准溶液配制0.1mol/L高锰酸钾标准溶液。称取3.3g高锰酸钾，溶于1050mL水中，煮沸20min，冷却后于暗处密闭保存数日，将溶液倾出，用石棉或玻璃纸过滤。滤液保存于标色具塞瓶中。标定法一称取于105-110℃烘至恒重的基准草酸钠0.20g，称准至0.0002g。溶于50mL水中，加入8mL硫酸，用0.1mol/L高锰酸钾液进行滴定，近终点时，加热至70℃，继续滴定至溶液所呈粉红色保持30s。同时作空白试验校正结果。标定法二准确量取0.1mol/L高锰酸钾标准溶液30-35mL，加水100mL、碘化钾2mL和4mol/L硫酸20mL，待碘化钾溶解后于暗处放置5min。用0.1mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定，近终点时，加入0.5%淀粉指示剂3mL，继续滴定至溶液蓝色消失。硫代硫酸钠标准溶液配制0.1mol/L硫代硫酸钠标准溶液。称取26g硫代硫酸钠和0.2g无水碳酸钠，溶于1000mL水中，煮沸10min，冷却。将溶液保存于棕色具塞瓶中，放置数日后过滤备用。标定法一称取于100℃烘至恒重的基准重铬酸钾0.2g，称准于0.0002g。置于500mL具塞锥形瓶中，溶于25mL煮沸并冷却的水中，加入碘化钾2g和4mol/L硫酸20mL。待碘化钾溶解后，于暗处放置10min，加入250mL水，用0.1mol/L硫代硫酸钠溶液进行滴定，近终点时，加入0.5%淀粉指示剂3mL，继续滴定至溶液变为亮蓝绿色。 同时作空白试验。标定法二准确量取0.1mol/L碘标准溶液30-35mL，加入水100mL和0.1mol/L盐酸5mL，用0.1mol/L硫代硫酸钠溶液进行滴定，近终点时加入0.5%淀粉指示剂3mL，继续滴定至溶液蓝色消失。（注：水100mL和0.1mol/L盐酸5mL所消耗碘量，应作校正）硫酸标准溶液配制（1）1mol/L硫酸标准溶液：量取30mL硫酸，缓缓注入1000mL水中，冷却，混匀。（2）0.5mol/L硫酸标准溶液：量取15mL硫酸，缓缓注入1000mL水中，冷却，混匀。（3）0.1mol/L硫酸标准溶液：量取3mL硫酸，缓缓注入1000mL水中，冷却，混匀。标定方法与盐酸标准滴定溶液的标定方法相同。硝酸银标准溶液配制0.1mol/L硝酸银标准溶液。称取17.5g硝酸银，溶于1000mL水中，混匀，溶液保存于棕色具塞瓶中。标定称取于500-600℃灼烧至恒重的基准氯化钠0.2g，称准至0.0002g。溶于70mL水中，加入5%铬酸钾指示剂1.00mL，在摇动下用0.1mol/L硝酸溶液滴定至溶液呈砖红色且30s不褪色即可。碘标准溶液配制0.1mol/L碘标准溶液。称取13g再升华的碘片和35g碘化钾，溶于100mL水中，加入盐酸3滴和900mL水，混匀，溶液保存于棕色具塞瓶中。标定方法与0.1mol/L硫代硫酸钠标准溶液的标定法二相同。碘酸钾标准溶液配制0.05mol/L碘酸钾标准溶液。称取于105-110℃ 烘至恒重的基准碘酸钾10.7g,称准至0.0002g。溶于水，移入1000mL 溶量瓶中，稀释至刻度，摇匀，溶液保存于棕色具塞瓶中。标定准确移取0.05mol/L碘酸钾溶液10mL，加水9mL，碘化钾3g和4mol/L盐酸5mL,待碘化钾溶解后，于暗处放置5min。用0.1mol/L硫代硫酸钠标准溶液进行滴定，近终点时加入0.5%淀粉指示剂3mL，继续滴定至溶液蓝色消失。常用6mol/L酸碱溶液的配制配制（1）6mol/L盐酸溶液：取247mL浓盐酸（相对密度1.19），加入水稀释至500mL。（2）6mol/L硫酸溶液：取85mL浓硫酸（相对密度1.84），慢慢地加入于水中，并用水稀释至500mL。（3）6mol/L硝酸溶液：取190mL浓硝酸（相对密度1.42），加入水稀释至500mL。（4）6mol/L醋酸溶液：取175mL冰醋酸（相对密度1.05）,加入水稀释至500mL。标准溶液在配制与标定过程中需注重的问题有哪些？（1）溶液配制中所用的水，在没有注明其它要求时，应符合GB/T 6682中三级水规格。（2）标定溶液和配制基准溶液所用试剂为容量分析基准试剂。配制一般溶液所用试剂纯度不低于分析纯。（3）溶液配制中使用的分析天平、滴定管、单标线容量瓶及单标线吸管等需按计量检定规程要求检定或校准。单标线容量瓶、单标线吸管应有容量校正因子。（4）称量工作基准试剂的质量小于或等于0.5g时，按精确至0.01mg称量；大于0.5g时，按精确至0.1mg称量。（5）标定标准滴定溶液浓度时，需两人进行实验，分别做四平行，每人四平行标定结果相对极差不得大于相对重复性临界极差0.15%，两人共八平行标定结果相对极差不得大于相对重复性临界极差0.18%。（6）在运算过程中保留5位有效数字，取两人八平行标定结果的平均值为标定结果，报出结果取四位有效数字。（7）制备标准滴定溶液的浓度应在规定浓度的±5%范围以内。标准溶液保存1）除另有规定外，标准滴定溶液在10℃～30℃下，密封保存时间一般不超过6个月；碘标准滴定溶液，0.1mol/L亚硝酸钠标准滴定溶液密封保存时间为4个月；高氯酸标准滴定溶液、氢氧化钾-乙醇标准滴定溶液，硫酸铁铵标准滴定溶液密封保存时间为2个月。超过保存时间的标准滴定溶液进行复标定后可以继续使用。2）标准滴定溶液在10℃～30℃下，开封使用过的标准滴定溶液保存时间一般不超过2个月（倾出溶液后立即盖紧）；碘标准滴定溶液、氢氧化钾-乙醇标准滴定溶液一般不超过1个月；0.1mol/L亚硝酸钠标准滴定溶液一般不超过15d；高氯酸标准滴定溶液开封后当天使用。3）当标准滴定溶液出现浑浊，沉淀，颜色变化等现象时，应重新制备。4）贮存标准滴定溶液的容器，其材料不应与溶液起理化作用，壁厚最薄处不小于0.5mm。标准溶液配制安全注意事项(1)分析实验室所用的溶液应用纯水配制，容器应用纯水洗3次以上。特殊要求的溶液应事先作纯水的空白值检验。(2) 每瓶试剂溶液必须有标明名称、浓度和配制日期的标签，标准溶液的标签还应标明标定日期、标定者。(3) 溶液要用带塞的试剂瓶盛装。见光易分解的溶液要装于棕色瓶中，挥发性试剂、见空气易变质及放出腐蚀性气体的溶液，瓶塞要严密。浓碱液应用塑料瓶装，如装在玻璃瓶中，要用橡皮塞紧，不能用玻璃磨口塞。(4) 配制硫酸、磷酸、硝酸等溶液时，都应把酸倒入水中，对于溶解时放热较多的试剂，不可在试剂瓶中配制，以免炸裂。(5) 用有机溶剂配制溶液时(如配制指示剂溶液)，有时有机物溶解较慢，应不时搅拌，可以在热水浴中温热溶液，不可直接加热。易燃溶剂要远离明火使用，有毒有机溶剂应在通风柜内操作，配制溶液的烧杯应加盖，以防有机溶剂的蒸发。(6) 要熟悉一些常用溶液的配制方法。如配制碘溶液应加入适量的碘化钾；配制易水解的盐类溶液应先加酸溶解后，再以一定浓度的稀酸稀释，如氯化亚锡溶液的配制。(7) 不能用手接触腐蚀性及有剧毒的溶液。剧毒溶液应先作解毒处理，不可直接倒入下水道。总之，标准溶液在配制、标定、保存和使用过程中，要认真按规定进行各环节的工作，才能保证溶液浓度的准确性，以保证实验结果的真实、准确。

选择、购买和验收标准物质时应考虑哪些要素？有证标准物质和其它标准物质在使用上有什么区别？.标准物质一定要在有效期内使用吗？是否觉得关于标准物质，自己有很多疑惑没有解决？今天小编带大家了解一下！1、有证书的标准物质就是有证标准物质(CRM)吗？回答这个问题，首先要理解“有证标准物质（certified reference material）”的含义。有证标准物贡是指“附有由权-威机构发布的文件，提供使用有效程序获得的具有不确定度和溯源性的一个或多个特性值的标准物质”因此，有证书的标准物质不一定就是有证标准物质．有证标准物质应具有以下基本特征：(l)溯源性和不确定度声明；(2)标准物质的制备、定值及认定符合由ISO指南34和指南35给出的有效程序，我国已将上述指南等效转化为JJFl342《标准物质研制（生产）机构通用要求》和JJFl343《标准物质定值的通用原则及统计学原理》，成为国家标准物质的评审、发布的技术依据。2、选择、购买和验收标准物质时应考虑哪些要素？用户在选择、购买标准物质时，应考虑以下要素：(l)特性量的种类及定值方法：某些标准物质可能只适用某一特定方法或专属领域的应用，某些标准物质的值有特殊规定，如含结晶水的值，应对证书中该类说明加以注意，防止误选误用：(2)特性量水平：标准物质的特性量水平应与日常测量样品的水平匹配。(3)可接受的不确定度水平：标准物质特性量的相关不确定度水平应与日常测量中的精密度正确变限度要求匹配。(4)基体及可能的干扰：标准物质用于开展方法确认、质量控制以及一些基体效应较为严重的测量方法的校准时，基体应与日常测量样品基体尽可能接近。(5)形式：标准物质可制备成不同的形式，如冻干与冰冻样品，制备方式的不同可能会导致相同特性在标准物质与真实样品中的行为差异，从而产生互换性问题，选购前应充分调研(6)最小取样量：只要标准物质证书中规定了最小取样量，用于测量的取样量应不小于该最小取样量，因此选购时应考虑最小取样量是否能满足测量方法要求。(7)用量：标准物质的购买用量应足以满足整个实验计划中的应用，包括根据需要考虑的备样。(8)稳定性：选购前应确认所购买批次标准物质的有效期限，避免使用时发生过期的情况对于购买到的标准物质，在收到后应首先对照证书确认标准物质的运输条件符合要求，然后核对品种、数量等是否与购买要求一致；包装、外观是否正常，标识是否清晰、完整；有无证书：是否在证书声明的有效期内等，核对完毕后，立即按照证书中规定的保存条件进行保存如有问题．应及时与研制或发售单位联系。3、有证标准物质和其它标准物质在使用上有什么区别？首先应明确，只有有证标准物质提供的认定值或标准值才能够用于校准、为其他物质赋值以及测量正确在我们的日常测量中，还会使用其它类型的标准物质，它们主要用于开展测量质量控制、测量精密度确认等。有时，在缺少有证标准物质的情况，也不得不使用这些标准物质来开展校准等活动，但是应进一步评估这些标准物质是否符合有证标准物质的特征，或溯源性和量值不确定度水平能够充分满足测量结果溯源性和准确度要求：度确认，并通过其使用来声明测量结果的计量学溯源性：4、有证标准物质的参考值或信息值怎么用？有证标准物质的证书中，有时会提供一些额外的参考值或信息值，这些值通常缺少明确的计量学溯源性，缺少不确定度信息或不确定度评估不全面，因此它们的主要用途是帮助用户了解标准物质基体组成，判断标准物质的适用性，或视可靠程度用于开展测量质量控制：5、标准物质一定要在有效期内使用吗？标准物质的有效期是研制单位根据稳定性研究数据，为了确保标准物质量值及不确定度的可靠性而确定的，因此，务必在有效期内使用一到期后未使用的标准物质也许仍旧稳定，对于一些批量较大、稳定性周期较长（如五年）的标准物质，研制单位有时会提供延长有效期的服务，但是在标准物质的稳定性无法得到研制单位保证盼隋况下，用户如果继续使用该标准物质，需自行承担责任。6、标准物质的最小取样量有什么意义？标准物质的最小取样量是在均匀性研究中规定的：使用标准物质时的实际取样量应不低于标准物质的最小取样量，当小于标准物质的最小取样量使用时，证书中声明的标准物质特性量值和不确定度等参数可能会由于标准物质的不均匀性而不再有效：7、标准物质的测量值一定要在不确定度之内吗？如果实验室对标准物质的测量值超出了标准物质特性量值的不确定度范围，是不能直接得出测量结果存在偏差的结论的。原因是标准物质的不确定度U标准物质仅包括了与标准物质定值、均匀性、稳定性有关的不确定度，没有涉及用户在实验室里对标准物质进行测量有关的随机不确定度U测。因此，应采取以下通用公式判断标准物质测量值与标准值之间存在显著偏差：s代表标准偏差，n代表重复次数，t值可根据n和置信概率水平查表得到。此外，要注意在测量条件达到稳定后使用标准物质，否则会导致错误的结论．8、为什么一定要按照证书中规定的条件陵用和保存标准物质？标准物质汪书中规定的使用和保存条件是确保的必要条件。标准物质的保存条件是在稳定性研究中确定的’而标准物质的使用条件，如温度、配制方法、干燥方法、水分校正方法、混匀方法等，则是标准物质定值过程严格确定和遵守的，不按照规定使用和保存会导致标准物质的量值不再有效，测量结果与标准值相比较出现偏差：9、校准用标准物质的稀释和使用过程中应注意什么问题？用户购买到的校准片标准物质常常浓度较高，不能直接使用，应做好这些过程的质量控制，标准物质稀释配制过程中所使用的容器与稀释剂需要引起注意。有些物质用玻璃瓶存储时，容易受降解或溶出影响，这时就要使用其它材料的瓶子，如K、Na等元素溶液标准物质，需采用塑料瓶保存；有些物质用塑料瓶存储则会发生吸附或溶出，如汞，在塑料瓶中可能会产生吸附现象，凶此选择玻璃瓶较为可靠昕采用的稀释剂除了应对空白进行必要的控制外，不同的稀释剂其稳定效果也不同，原则上应按照检测标准方法。p规定的稀释剂品种及浓度进行配制。标准物质称量、稀释过程中使用的计量器具，如天平、移液器、容量瓶等．应经适当的校准或检定确认符合精度和准确度要求，特别是有机分析中使用的微量注射器和移液枪的误差较大，应注重进行日常校准。10、称量标准物质时如何进行浮力校正？在一些需要准确称量标准物质的场合，如证书中特别声明了需采用浮力校正公式来计算样品的员量，可采用公式：m—样品在真空中的质量，g；0. 0012—浮力修正系数；W—称量质量，g；d 1—样品密度；d—砝玛密度，不锈钢砝码密度可按7. 85g/cm 3计算。以水溶液标准物质为例，浮力校正的影响约为千分之一，因此，是否校正取决于对测量准确度的要求。11、打开后的标准物质如何保存和开展量值核验？标准物质证书中有时会规定“一次性使用”，这些标准物质一般不稳定或具有较高的量值准确度，如安瓿瓶分装的国家一级溶液标准物质，在打开包装后量值易发生超出不确定度范围的变化，应按照要求尽快移取，不能留存后反复使用，可一次性制备成标准储备溶液保存、使用。对于可多次使用的有证标准物质，确保标准物质包装单元开封后的恰当保存和包装、证书的完整性非常重要，某些情况下，有必要根据证书要求，对剩余的物质进行重新密封包装一取样时应采取防止/沾污的措施。

菌种代号的意义国内常见微生物检验所用的菌种代号是CMCC（F）或 CMCC（B）CMCC -- 中国医学菌种保藏中心B -- 代表细菌， F --代表真菌。大肠杆菌[CMCC (B) 44102]；乙型副伤寒沙门杆菌[CMCC (B) 50094]；铜绿假单胞菌[CMCC (B)10104]；金黄色葡萄球菌[CMCC (B)26003]；生孢梭菌[CMCC(B)64941]；白色念珠菌[CMCC(F)98001]。常用菌种保藏方法(一) 菌种保藏的原理根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用。低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。选择保藏方法时，首先应考虑方法能否长期地保持菌种原有的特性，同时也应兼顾到方法的经济和简便。在实际工作中，往往多种条件同时使用，以提高保藏效果。（二）菌种保藏步骤① 挑选特征典型的纯菌菌落；② 确定保藏的合适菌体形态；③ 选择最适宜的保藏方法；④ 定期对保藏菌种进行检查，观察是否发生变化，若有变化，须改变保藏方法。保藏期满应及时进行移种。1.琼脂斜面低温保存法（1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3个月移种一次，继续进行保藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年 ~ 一年。有的甚至更长时间。（2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。（3）特点：优点是--简便，易于推广；一般不需要另选择保藏用培养基；对大多数微生物都适用；缺点是--保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。（4）注意事项：保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。保藏菌种的培养基应无糖，其他菌类含糖小于2%为宜，以免产酸过多，影响菌种存活。铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。2. 液体石蜡保存法本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。（1）方法：将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~0.5 %琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管10~15mL，加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压灭菌30min，取出置37℃温箱或110~170℃烤箱中1~2h或干燥器内除去液体石蜡中的水分。将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端1㎝为宜，将试管直立，放入4℃冰箱中保藏。（2）适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。（3）特点：本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法，该法主要使菌种与空气隔绝。（4）注意事项：① 保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征后，方可进行保藏；② 保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥， 需重新移种；③ 使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上即可使用；④ 将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染；⑤ 液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少,斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜面1cm为宜；⑥ 制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多,否则分装到菌种培养基中易造成污染。菌种的复苏与保存菌种的复苏与保存应在专用超净工作台或生物安全柜内进行。

实验室PCR 产物的电泳及纯化一、目的(1)了解PCR产物电泳与纯化的原理。(2)熟悉和掌握PCR产物电泳与纯化的操作。二、原理在PCR过程中，部分引物和dNTPs在Taq酶等因子的作用下以DNA模板为指导合成新的DNA分子，当然还有一部分的引物和dNTPs没有完成所期望的任务,以小分子的形式存在于PCR产物混合液中,为了后续分子克隆的工作能够顺利进行,PCR产物就需要进行纯化，以去除PCR产物混合液中残留的Taq酶、BSA、Mgt+、引物dNTPs.buffer中的小分子以及非特异性扩增产物。通过电泳将所需要的PCR产物和其他分子分离,经过EB染色后，在紫外灯激发显色下把目标条带从凝胶中切出来，然后通过相应的缓冲液将其溶解，经异丙醇(乙醇)作用使得DNA分子沉淀，再通过在高速离心让沉淀的DNA分子结(indin)在滤膜上，而后用洗脱缓冲eluton ut其从滤膜上洗脱下来就得到了纯化的PCR产物。三、买验材料、器材和试剂1.实验材料有目标条带的PCR扩增产物。2.实验器材①离心机;②2mL离心管;③移液器;④移液枪头;⑤水浴锅;⑥手术刀片;⑦紫外凝胶观察仪;⑧密封盒;⑨防紫外线眼镜;?橡胶手套;①分析天平;2离心管架;③1.5mL离心管;④水平电泳槽;⑤电泳仪;①⑥微波炉;⑦蓝盖试剂瓶;⑧带有层析滤膜的离心管(QIA quickspincolumn)。3.实验试剂①PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN);②异丙醇;③琼脂糖;④6X上样缓冲液(loading-buffer) ;⑤1X TAE电泳缓冲液;⑥溴化乙锭(EB) ;⑦100bp DNA marker;⑧3M NaAc(pH值为5. 0)。四、操作方法(-)琼脂糖凝胶电泳1.制胶准制脑胶模具，称取128脂期，倒人蓝盖试剂瓶中，然后用量简量取50mL 1xTAE电泳缓冲液倒人蓝盖瓶中。盖紧瓶盖，放人微波炉中，中火2~3min,待琼脂糖完全熔化后,取出蓝盖试剂瓶(取时要戴微波炉手套,以免被烫伤)，于室温下放置5~8min,将凝胶液缓缓倒入制胶模具中,插上样品梳，于室温下静置20~ 30min。2.点样将凝固好的琼脂糖凝胶,放人加有电泳缓冲液的水平电泳槽中，取出样品梳。然后加人15pL有目标条带的PCR扩增产物+1.5pL 6X.上样缓冲液(Loading buffer)的比例进行混合后,把混合溶液加人凝胶的样品槽中,在合适的样品槽中加人2μL100bpDNAmarker.3.电泳盖好电泳槽盖后，接通电源，120V电泳1h 20min左右(在凝胶中只有一排样品槽的情况)。4.凝胶染色电泳完毕后,取出凝胶,放人装有溴化乙锭的密封盒中，染色25min。(二)电泳后PCR产物纯化找出电泳结果出现单一目标条带的对应PCR扩增产物进行纯化。具体步骤如下:(1)在2.0mL的离心管壁上写上准备纯化的PCR产物的相关信息,并称重。(2)切下含目标片段的胶块，切得尽可能小一些,把所得的胶块放人2.0mL的离心管中。(3)称量装有胶块的离心管重量，计算出胶块的重量。(4)加入6倍体积的QG buffer到离心管中(100mg胶相当于100pL)。(5)将含有胶块的离心管放人50°C水浴锅中，温育10min,至胶块完全溶解，为促进溶解，每2~ 3min振荡离心管-一次。(6)胶块全部溶解后,检查混合液的颜色是否为黄色(与未溶解之前的QG buffer 的颜色相似,若混合液的颜色为橙色或紫色,加10pL 3M NaAc(pH值为5. 0)。(7)向离心管中加人1倍凝胶体积的异丙醇,混匀。(8)将溶液转移人QIA quick spin column中,13 000rpm离心1min。(9)弃掉液体,加入750μL PE buffer ，静置2~5min,13 000rpm离心.1min.(10)弃掉液体,13000rpm离心1min(空载离心，除去乙醇)。(11)把QIA quick spin column置于一一个洁净的1. 5mL的离心管中。(12)加人30pL的elution buffer置膜中央,13000rpm离心1min。(13)将洗脱所得溶液置于一20°C中储存。所得到的洗脱液可与克隆载体进行连接，然后转化使重组DNA分子进人大肠杆菌细胞内,经过培养获取克隆子。

胎牛血清是细胞培养中常用必备的添加培养基。它营养丰富，大约含有三四百种不同成分，具有基础培养基所不具备的营养因子。它给细胞提供的益处主要有六个方面：1>提供细胞生长所需的天然激素或天然的生长因子。2>提供天然的结合蛋白，能识别氨基酸、脂质、金属离子和激素等，能结合并调节它们的活性。已知清蛋白(albumin）即具有上述功能，并对细胞代谢、生物合成、增殖和存活具有潜在的影响。又如胎牛血清中富含胎球蛋白（Fetuin），具有多个钙离子结合位点，因而能调节和维持血清中的钙离子浓度。3>天然含有粘附蛋白等细胞外基质成分，促进细胞的附着、铺展。4>提供解毒功能。这主要通过血清中的某些蛋白与有毒的金属离子结合来完成的。如金属硫蛋白，对多种重金属有高度亲和性，并可清除细胞生长环境中的氧自由基（·O），具有很强的抗氧化活性，可防止细胞衰老。5>提供酸碱度缓冲的作用，以及维持渗透压。6>提供蛋白酶抑制剂，使细胞免受蛋白酶的损伤。因此在细胞消化时，常用含血清的培养液终止胰酶对细胞的作用。由于胎牛血清几乎是通用的生长添加物，适合动物、人和昆虫细胞等许多类型细胞的培养，因此使用血清不需要为每一类细胞优化培养基，节省了大量时间和精力。血清保存注意事项：（1）需要长期保存的血清必须储存于-20℃ - 70℃ 低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月。由于血清结冰时体积会增加约10%,因此，血清在冻入低温冰箱前，必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。（2）热灭活是指56℃， 30分钟加热已完全解冻的血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理的目的是使血清中的补体成分（complement）灭活。除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会影响血清的质量。补体参与反应有：细胞毒作用， 平滑肌细胞收缩， 肥大细胞和血小板释放组胺， 增强吞噬作用， 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化。（3）瓶装血清解冻需采用逐步解冻法：-20℃ 至 -70℃ 低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1天。然后移入室温，待全部溶解后再分装。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。（4）一般厂商提供的血清为无菌，无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物，则可将血清加入培养液内一起过滤，切勿直接过滤血清。（5）血清中的沉淀物 絮状物：主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5分钟去除，也可不用处理。 显微镜下"小黑点":经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象"小黑点",常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清。（6）切勿将血清在37℃放置太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中的有效成分会破会而影响血清质量。

1. 对Ausbian进口特级胎牛血清进行γ射线照射，以灭活各种动物血清中潜在的病毒风险，提高临床安全性。极利于细胞的生长和传代 ，适合各种细胞培养 GMP条件下生产，具有ISO9001质量认证体系证书。2. 每个批号血清均具有完整的检验报告，辐照报告。三次0.1 ?m无菌过滤处理进行细菌、真菌、支原体、病毒及病毒抗体检测，符合国-际动物协会要求。描述1. 保证全程冷链运输，国外加干冰进中国后直接在海关进冷冻库，不出现冻融现象，保证质量不受影响，因为我们是在海关备案，有相关文件，正规途径进口，如果不按正规途径进血清，会进常温库，血清冻融导致实验问题，或者同一批货周围的血清和中间的血清质量差异明显。2. 即使是同1个批次在一年之内可以退换货的售后保障。我们可以一直保证实验的顺利，在不影响二次销售的情况下免费调换或退货。在售后方面更加省心。3. 批间差异小，在大量的批次也有用完换批次的时候，我们已经在进血清的时候挑选了批间差异小的批次。保证了客户不用为换批次而烦恼，试用新批次的时候更加省心，也保证了实验顺利进行。4. 可以替客户保存血清。对于客户来说可以在不受血清储存空间限制的情况下以大批量优惠的价格购买同一批次的血清。省钱的同时又保证了实验的顺利。5. 远慕的防伪标签，保证不会有假货。保证了实验的顺利，也避免了假货造成的成本损失。6. 全部现货储备，不用担心白白试用，试用后就能直接买到的血清，省时省钱，又保证了实验的顺利。特点1. 内毒素低，内毒素选取小于3Eu/ml，可以使细胞更健康。对于客户做实验更加顺利。如果选取内毒素较高的血清，细胞一直泡在毒液里，短期内试不出结果，用不健康的细胞做实验，对实验结果造成严重影响。2. 原装试用，保证后续供货为同一个批次。客户试用好后对于购买的血清更加有把握，同一批次已经试过了，也保证了实验更加顺利。3. 同一个批次数量多，2000瓶，可以长期不用换批次。保证了实验更加顺利的同时，节省了试用的时间和成本。4. 多个批次可以选择。不限一次试用，可以适应不同课题。以保障实验顺利。5. 多个课题组，客户在使用。相当于多个角度测试该批次血清，说明血清对于细胞实验的支持，保证了实验顺利。

1、什么是高纯试剂高纯试剂是反映化学试剂纯度高低的一个类别概念它表示，该试剂中起干扰作用离子的相对量很少；该试剂可以被用于一般的定量分析实验。比如，色谱用的乙腈，是一种高纯试剂2、标准物质具有足够均匀和稳定的特定特性的物质，其特性被证实适用于测量中或标称特性检查中的预期用途。注意以下三个方面：1、标称特性的检查提供一个标称特性值及其不确定度。比如：一瓶浓度为100mg/mL的镉溶液，不确定度为：2mg/mL2、赋值或未赋值的标准物质都可用于测量精密度控制，只有赋值的标准物质才可用于校准或测量正确度控制。3、“标准物质”既包括具有量的物质，也包括具有标称特性的物质。例如：具有量的标准物质举例：所含二恶英的质量分数为0.001mg/kg的鱼尾形纸巾，用作校准物。例如：具有标称特性的标准物质举例：a）一种或多种指定颜色的色图；b）含有特定的核酸序列的DNA化合物；3、是否可以互相替代高纯试剂不可以代替标准物质：高纯物质虽然很纯，但是不具备标准物质的一些性质。比如，不一定有标准物质稳定，没有被赋予特性值，没有不确定度等标准物质不可以替代高纯试剂：标准物质不一定纯，绝大数的标准物质是混合物，标准物质远远达不到高纯试剂对纯度的要求。

危害类型粉尘：对呼吸系统伤害。刺激性气味：对眼睛和呼吸系统伤害。有毒化学物质：不可预见伤害和环境污染。重金属：不可预见伤害和环境污染。抗生素：过敏反应和不可预见伤害。染料：环境污染和人体伤害。微生物培养基主要组成成份：一般营养类培养基的配方中含肉浸液、蛋白胨类、糖类、酵母浸粉、氯化钠和琼脂等基本营养物质。此类培养基对人体基本无害，即使少量吸入也对人体无害。例营养琼脂、平板计数琼脂、营养肉汤、胰蛋白胨琼脂、胰蛋白胨肉汤等。选择性培养基组成成份：此类培养基的配方中含肉浸液、蛋白胨类、糖类、酵母浸粉、氯化钠等外，还含有抑制非目标菌生长成份，如胆盐、染料、抗生素、重金属等。此类培养基对人体基本有害，即使少量吸入也对人体有害，一般皮肤接触后需立即清洗，同时对环境也有污染。粉末状干燥培养基对人体危害主要是粉尘吸入。粉末状干燥培养基对环境危害主要随意抛弃

可以说，到目前为止，针对体外细胞培养的支原体检测的方法还没有一种单独使用就可以保证100%正确，既不会漏检（假阴性），也不会多检（假阳性）。（1）支原体固体培养法。通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体（M.Hyorhinis）。这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落，而猪鼻支原体约占所有支原体污染的20-50%。这就意味支原体固体培养法漏检率高达20-50%。（2）PCR法。PCR法导致的假阳性大家比较熟悉，无需多说。值得注意的是，由于细胞培养液中，经常会含有强烈抑制PCR扩增的代谢产物，如果不进行样品的前处理而直接使用细胞培养原液进行PCR检测，产生假阴性的概率是非常大的。（3）荧光染色法。由于该方法本身的灵敏度较低，轻度的支原体污染往往无法检测出来。该方法漏检率也不会低。（4）检测支原体特异性酶的方法，比如Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplas Detection Kit和上海远慕生产的《发光法支原体检测试剂盒》。主要缺点是发光值有一定的波动，处于检测下限边缘的读值可能会造成误判。（5）《一步法恒温支原体检测试剂盒》该方法尽管有许多优点，但是目前为止，我们只能保证该试剂盒能检测出说明书上列举的13种支原体，虽然这13种支原体大约占了所有污染细胞的支原体种类的99%左右，但是该方法也不能保证100%的支原体检出率。综上所述，单独使用目前市面上的任何一种支原体检测试剂盒，都无法做到100%正确，既不会漏检（假阴性），也不会多检（假阳性）。严格的支原体检测，至少需要使用两种，最好使用三种不同原理的支原体检测方法同时进行检测，才能使检测结果接近100%正确。如果您想得到100%正确的支原体检测结果（比如，开展细胞治疗的客户，进行干细胞培养的客户，生产血清、胰酶、培养液的客户，出售各种原代培养细胞系和肿瘤细胞系的客户等），任选本公司生产的《一步法恒温支原体检测试剂盒》、《PCR法支原体检测试剂盒》、《发光法支原体检测试剂盒》和《探针法支原体检测试剂盒》中的两种进行检测，将会得到比较满意的结果。如果几种不同支原体检测方法的检测结果一致，正确率几乎就是100%

　　相信很多实验室都遇到过如此尴尬的情况：标准品过期了，是扔还是不扔?按照CNAS认可准则的要求，过期的标品是不能用于与检测结果报告的相关检测的。但总有那么几种标准品，价格很贵，却用不了几次就过期。碰到这样的情况我们到底该怎么做呢?下面小编来给大家介绍。　　总的来说，标准品过期了，有以下几种常见的处理方式：　　1、当作废液或者固废统一分类处理;　　2、用来做内部质量控制;　　3、对过期的标样作一次核查，用新购的标液去定量(请注意成本考量);　　4、参考一下标准品的理化性质，只要变化不大，可用作回收率试验;　　5、可用于标准品变化规律的研究;　　6、在其降解产物响应极弱的前提下，用于色谱分析的峰定性;　　7、可以用来做内部质量控制，当做盲样进行数据比对;　　8、农药做定性分析和快速筛查用;　　9、实验室内部用来做摸索实验条件用，优化参数。　　标准品与对照品的区别　　1.标准品，即是标准物品，作为一种衡量标准，如果用在药物方面，则为含量测定中的标准含量。标准品包括化学计量标准品、冶金标准品和药检标准品。采用生化方法来测定，目前国家规定的标准品共有15种，林可酶素、新霉素、大观酶素、太乐菌素、链霉素、卡那霉素、绒促性素、盐酶素、杆菌肽锌、吉他酶素、安普酶素、红霉素、合成缩宫素、庆大霉素、渡毛化苷G。　　2.对照品，是指用于鉴别、检查、含量测定和校正检定仪器性能的标准物质。采用化学方法来测定，即是一般仪器的都叫做对照品，国家规定的有107种，包括地塞米松、土霉素、阿莫西林等等。　　远慕生物提供以下服务：　　1.中药提取物的定制研发和生产，中药提取物代加工相关服务。　　2.中药高含量提取物的工业化高效分离及分离纯化生产　　3.天然产物原料药和中间体的生产，定制（包括合成，半合成）

　　细菌，是自然界分布最-广、个体数量最多的单细胞生命体。从负责发酵酸奶的乳酸菌到生产胰岛素的大肠杆菌，细菌充斥于人类生活和科学研究的方方面面。每种细菌有着各式各样的可遗传继承的大小，这些微小细胞的体积有时可以相差106-108倍，从0.3微米长的专性胞内病源菌支原体(Mycoplasma)，到600微米长的刺尾鲷肠道内共生菌费氏刺骨鱼菌(Epulopiscium fishelsoni)，再到生长在纳米比亚海边肉眼可见的1毫米长的纳米比亚嗜硫珠菌(Thiomargarita namibiensis)。当然，较大的细菌是极少数的，大多数已知细菌的直径在0.4至2微米之间，长度在0.5至5微米之间。　　细菌的大小不仅呈现多样化，而且很稳定。即使在温度高达100度以上的热液口、盐浓度高达5摩尔的盐湖、离子放射性强度超过人类致死剂量1000倍等条件下，这些环境中的细菌细胞仍然保持特定的大小。长久以来，细菌的大小一直是细菌分类学中一个不可缺少的性状，同时特定的大小使得细菌能更适应其生存环境。过去100年来，生物学家一直想知道是什么决定了细胞的大小。在近代，虽然我们知道了大部分控制细菌细胞周期和细胞分裂的分子，但我们仍然不知道细菌细胞的大小是如何确定的　　5月18日，国-际权-威学术期刊《自然?微生物学》发表了中国科学院深圳先进技术研究院、深圳合成生物学创新研究院刘陈立实验室的文章《链接大肠杆菌细胞生长和细胞周期的一般定量关系》，该文章以大肠杆菌为模式生物，揭秘了细菌大小的决定因素，推导出了全新的“个体生长分裂方程”，修正了该领域原有的两大生长法则，并对合成生物学领域生命体理性设计提供了相关建构基础原理。　　追根溯源 修正原有法则　　早在上世纪50年代，美国科学家Schaechter等发现细菌细胞长得越快，细胞就越大。更为重要的是，该研究突破性地用一个数学公式描述了细菌细胞生长速度和细胞大小之间的定量关系，即是说只要知道细胞生长快慢，就可以准确推断出细胞大小，反之亦然。这一公式后被称为"SMK生长法则"。　　那么，细胞大小和生长速度为什么存在这样的关系呢？1968年，Donachie在《自然》杂志上发表了他的观点。他认为，细胞大小决定了细胞内DNA何时开始新一轮复制。当细胞进入复制阶段时，细胞大小和复制起点数的比值是恒定不变的。这一比值被称为“起始质量”，且“起始质量”与生长速率无关。开始新一轮DNA复制后，经过恒定的时间周期，细胞分裂。　　由于细胞是指数生长，起始质量及时间周期恒定，因此分裂时细胞的大小正比于生长速率的指数次方。这一观点很好的契合了SMK生长法则，回答了“细菌大小是怎么决定的”这一基础科学问题，被称为“恒定起始质量假说”。　　一测到底 展开三年漫长研究　　这两个统治了学术界半个世纪的生长法则环环相扣，就像科研道路上的“指路牌”，在该领域树立权-威六十年，多年来许许多多的研究在两大法则的指引下开展；也有一些研究团队对这两个法则的准确性提出过质疑，但由于缺乏系统全面的实验数据，相关结论并未引起领域内大部分研究人员的重视。要想修正主流细胞生长法则，必须要确保实验数据完整的覆盖度以及高度的可重复性，刘陈立团队潜心3年多研究，对两大法则进行了系统性重复实验。　　“通常的该类研究会选取1种或少数几种培养基，而我们选择了超过30种培养基开展实验，我们采用早晚轮班制，对细胞的生长状态进行实时监控，以确保每次取样都是在细胞稳定状态下进行的，”该文章的第1作者郑海博士介绍说，“在低生长速率条件下，完成一次实验所需时间长达一周，而为确保数据可靠，实验还需要重复，重复次数多的超过9次以上。”这是迄今为止有报道的类似研究工作中选用培养基种类最多、覆盖生长速率范围最-广的一次。　　带着极-大的耐心和严谨的态度，团队最终发现，原有的两大法则并不准确，被奉为经典的“指路牌”可能将大家的研究引向了偏离的方向。“虽然生长速度越快，细胞越大，但二者之间的关系并不符合SMK生长法则的预期”该文章的通讯作者刘陈立研究员说，“按照法则描述，无论细胞生长快慢，一旦达到‘起始质量’，就应该开始新一轮的DNA复制，然而，我们却在实验中观察到，细菌细胞没有遵循假说，不同培养条件下，‘起始质量’有高有低。”　　如果两大法则并不准确，那么细菌大小是怎么决定的呢？我们能否修正“指路牌”呢？　　玩转数据 推导全新定量关系　　为了回答“细菌大小是怎么决定的”这一科学问题，刘陈立这样描述实验数据分析的过程：“要和数据呆在一起，揣摩它。”研究团队通过寻找大量科研实验数据背后的量化关系，最终推演出一个全新且适用于不同生长速率条件的“个体生长分裂方程”　　新的方程统一了不同生长速率条件下的细菌细胞周期调控机制，这一定量公式的提出也使得细菌个体大小、生长速率等自然现象具有了一定的可预测性，例如：当得知细菌生长速率和DNA复制周期，便可准确预测出细菌的大小。该分裂方程为研究人员提供新的研究范式和思维方法，解答细菌细胞大小和DNA复制周期以及生长速度之间的关系，并具有广泛的应用价值。　　“个体生长方程”对理解细菌细胞周期的控制机制有什么意义呢？在“个体生长方程”的约束下，研究团队对细菌细胞分裂的控制机制进行了探讨。并以此为基础提出了一个全新的分子机制假说，认为存在一种“分裂许可物”，它与“细胞生长”和“染色体复制分离”相关。当它积累达到一定阈值时，细胞就会分裂。研究团队在此基础上建立了相应的数学模型，进一步的实验确实验证了理论预测。　　从数学公式到建构生命体理性设计基础　　在物理世界，“伯努利方程”指导了飞机的设计，“阿基米德浮力定律”推动了潜艇的面世，“牛顿第二定律”是人类得以翱翔太空的理论基石，合成生物学的终-极目标就是生物世界实现理性设计、改造现有生命形式或者创造全新的生命形式以满足人类不同的需求。　　以“合成生物学”为研究导向，刘陈立团队继去年揭示细菌群体迁徙公式后，该研究是在定量生物学领域的再度突破，“研究再次证实了定量的思维方法在生命科学研究中的重要性，我们找到的每一个运行规律，都是试图找到可用于指导设计、改造、重建生命形式的‘图纸’。”刘陈立表示。　　此次对细菌个体细胞相关定量规律和法则的基础科学问题研究，对人类揭示并理解生命体内在原理提供了重要的参考依据，此研究也有助于未来合成生物学领域的理性设计和建构，以满足细菌治疗疾病、抗生素替代、绿色生物制造等多个应用层面的需要。

　　做细胞培养实验经常会用到血清，当血清用不完我们会冻起来下次再次使用。但你有没有发现有时候在融化血清过程中会出现白色的沉淀物质，出现这种情况是否血清出现问题了呢？　　首先我们要搞清楚血清中絮状沉淀物是什么，沉淀物其实包含含纤维蛋白和脂蛋白。这是正常特性，不会影响产品性质。要除去沉淀，离心血清（400g，1-2分钟）或者简单的让其沉淀在瓶子底部，将血清小心的转移到另一个无菌瓶里（一般不建议采用过滤的方法除去沉淀，因为沉淀会堵塞滤膜而无法过滤）。大多情况轻轻摇动沉淀并加热至37℃就会再溶解。所以，使用产品时要摇动并加热血清至37℃，沉淀会自然消失。　　那怎么才能降低沉淀物的发生呢？　　（1）解冻血清/分装冻存时，须规则摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。　　（2）勿将血清置于37℃太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中许多较不稳定的成份也会因此受到破坏，从而影响血清的品质。　　（3）血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。　　使用时常见问题及解决方法：　　一、保存血清zui好的方法?　　血清应保存在-5℃至-2O℃若存放于4℃时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议将无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。　　二、如何解冻血清才不会使产品质量受损?　　将血清从冷冻箱取出后，先置于2-8℃冰箱使之溶解，然后在室温下使之全溶。但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。　　三、如何避免沉淀物的产生?　　1.解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-2O℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。　　2.解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生　　3.请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。　　4.血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。　　5.若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。　　四、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?　　欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。但不建议以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞过滤膜。

在细胞培养中常可见到细胞及培养液中有一些大小不等、形态不同的黑色未知颗粒，去网上搜和请教师哥师姐得到的答案也多种多样。那么这些小黑点究竟是什么那？我们又该怎么去应对这种情况那？小黑点都有哪些说法？非生物类细胞碎片类在细胞培养的时候， 由于细胞代谢、物质交换、周边环境变化，尤其是在从37度培养箱中拿出来观察的过程中，由于液体培养基的比热较大，液内温度高于外界温度，造成冷热交换、小范围内形成液体流动加剧，当然这些小碎末就会被搅动起来形成似乎“游动”的感觉；随着细胞培养的继续，部分细胞开始衰亡，细胞膜结构破裂，破裂之后的细胞内容物泄露到培养液中。尤其是溶酶体的破坏，连续性地造成其他细胞和细胞器的损伤，如果换液不很勤，又会出现进一步破坏和残渣的出现；再者，“小黑点”问题是很多细胞培养者已经发现的问题，但到目前为止尚未找到其监测和排除的试剂和手段，这首先是由于所谓“小黑点”病原体根本难以收集和捕捉， 这也从另一个侧面证明了“小黑点”问题的难以确定性；再说任何一种外来的微生物在培养基中都会有生命活动的反应和表现，而不是简单地运动那样的外观性表现。举一个例子：如果“小黑点”的运动状况已经到了用显微镜已经可以观察出的程度，其营养代谢和能量需求也就可想而知。这样，培养液中的影响消耗、酸碱含量程度等都要发生明显变化。比如说：迅速的、大含量的沉淀， pH值的迅速下降，细胞大量破碎死亡、引发其它类型微生物侵染等等。而这些状况，在所谓的“小黑点”感染中，是很难观察到的。同时“小黑点”的出现而影响细胞状态似乎得不到有力的证据。倒是细胞状态下降的时候，“小黑点”明显增多了。很有可能是细胞状态下降时，细胞衰亡产生的细胞碎片。所以小黑点属于细胞碎片是比较可能和合理的。玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西网上有一篇文章说，小黑点其实不是一种生物，是无机物，其本质是玻璃培养瓶里的硅颗粒。可影响细胞生长，细胞状态好时，不明显。细胞状态较差，数量少时才容易看到，zui-好的办法是用一次性培养瓶，可消除小黑点影响。血清聚合物产物生物类支原体有人曾认为小黑点可能是支原体污染，因为相对比较权威的网-站文章指出，小黑点可以通过滤膜，可以在空气中传播。而恰巧口腔支原体为人体口腔中之正常菌丛，所以实验室之操作人员的污染亦可能为支原体的污染源。但有人为此做了实验证明小黑点不会是支原体，原因如下：1、光镜下可见, 因为体积不对，支原体在普通显微镜下不能看到。2、多种染色后可见，甚至hoechst即能将它染色,一般来说支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。所以，小黑点是一种支原体的可能性比较小。真菌有很多人发现类似小黑点的，但zui后确定是真菌，二性霉素B对其有效。那说明小黑点不存在只是细胞培养中的真菌感染，还是说明小黑点属于真菌类污染物。如果小黑点是一种真菌，那么由此引起的污染是不会引起那么多人的关注，即使它很特殊。但是这不能排除那些认为“小黑点”是真菌的细胞者，看到的只是一般真菌感染。由于细胞被感染了，要进行拯救处理，不像理论上那么简单，稍有不注意都是很容易导致培养失败，所以小黑点是一种真菌也是不太可能。寄生类原虫小黑点属于寄生类的原虫，而不是细菌、支原体，也不是什么补体、细胞碎片或蛋白沉淀。有人在400倍以上的高倍镜下可以清楚的看到它有两种不同形态，一种较大，运动较慢，泛红光；另一种较小，运动较快，红中带绿，个小的围着个大的分布，很可能是公的围着雌的。这种生物也并非离开细胞就不能存活，也有人做过这样的试验，单纯培养过污染小黑点的血清4周，直到满视野都是黑煤渣般的小黑点。给人的感觉是小黑点和细胞一样有丛集性，如果密度低则生长缓慢，如果手懒，拖了几天没换液，待生长到一定浓度后便会飞速分生，细胞受感染的程度也大，这时除了培养基中可见外，细胞表面通常也象长满了粉刺，所以有人认为细胞旁分泌的某些因子可以抑制小黑点的生长。

细胞培养在生命科研的地位举足轻重。实验君的很多成果可谓是成也细胞培养，败也细胞培养。然而细胞虐我千百遍，我待细胞如初恋！科研人是不会这么被轻易打败的。小编根据自己的经验和收集的资料，总结出了细胞培养实验的注意事项，希望能够帮助大家！1.新买的或惠赠的细胞如何处理？不管买的细胞、惠赠的细胞，刚拿到手应赶紧做这几件事：检测瓶子是 否破裂；培养基是否漏出，是否浑浊；是否有支原体污染；迅速扩增冻存。2.能否使用与原先培养条件不同的培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供培养条件不同的培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。3.购买的细胞死亡或存活率不佳可能原因？常见原因可能有：培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；解冻过程错误；冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心；悬浮细胞误认为死细胞；培养温度使用错误；培养箱气体浓度达不到要求；细胞置于 –80 ℃ 太久。复苏冻存的细胞4.收到的冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落的原因？冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，是因热胀冷缩的物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。5.冷冻管应如何解冻？将冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，可佩戴防护眼镜和手套预防冷冻管的爆裂。取出冷冻管后，须立即放入 37 ℃ 水浴环境中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。6.细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO？现在大多数实验室会在解冻细胞后加培养液将DMSO除去，但也有研究者认为除少数特别注明对 DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有 10~15 ml 新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。8.如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在 MEM 中培养的细胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同样很容易生长。总之，首选 MEM 做粘附细胞培养，RPMI-1640 做悬浮细胞培养是一个好的开始。9.什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养基中被用来作为 PH 值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。10.细胞培养基的配制和储存应该注意什么？细胞培养基配好后，要先抽取少许放入培养瓶内在37℃培养箱内放置24~48h，已检测培养液是否有污染，然后方可用于实验。配置培养基所需的血清要合格并且保持稳定。一个批号试用效果良好后，就可一次购入较多同一批号的血清，这样实验条件稳定，配液时调整pH值较容易。每次配液量以使用两周左右的量为宜，一次配液不要太多，一是短期内用不完造成营养成分损失需要补充，二是量大易造成污染。11.为何培养基保存于 4 ℃ 冰箱中，颜色会偏紫色？培养基保存于 4 ℃ 冰箱中，培养基内的 CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性，而培养基中的酸碱指示剂 （通常为 phenol red） 的颜色也会随碱性增加而更偏紫色。培养基偏碱的结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤 CO2，以调整 pH 值。12.什么情况下用到无血清培养基？对于应用培养细胞进行分离制备细胞生长因子、单克隆抗体等应该选择无血清培养基。

实验原理将细胞小室（Transwell小室）放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。细胞小室（transwell）应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。所应有的常见实验共培养体系：小于3.0?m孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0?m以下孔径。常用0.4、3.0?m。我们实验室用的是0.4?m。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。趋化性实验可用5.0、8.0、12.0?m膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。肿瘤细胞迁移实验常用8.0、12.0?m膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。肿瘤细胞侵袭实验常用8.0、12.0?m膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。侵袭实验操作实验用品细胞小室：有很多不同规格，根据实验需求自己选择。上层培养液：上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA。细胞：值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就盲目进行Transwell侵袭实验，可能会造成不必要的浪费，一次Transwell侵袭实验花钱少则数百，多则数千，并不是笔小数目，还是小心为妙。另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿12－24h，再进行实验。基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了。下层培养液：下层常用含5%－10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS仍是最合适的。细胞培养板：常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最-常用。细胞培养板没什么特殊要求，普通的细胞培养板就可以。但要注意，细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。24孔细胞小室12孔细胞小室6孔细胞小室此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白，这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）。细胞照样贴壁很好。如果贴壁不好的话可以试试看。如果培养时间很长（>24h），细胞还是会掉到下室里面去，所以有条件的话，最-好还是在膜下层涂上FN。另外，值得一提的是，膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。实验步骤无基质胶Transwell小室制备① 包被基底膜：用50mg/L Matrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。② 水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。另有方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9?g/?l) 60-80?l (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最-好)，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。制备细胞悬液① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。② 消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1－10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。接种细胞①取细胞悬液100－200?l加入小室，不同公司的、不同大小的小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200?l。② 24孔板下室一般加入500?l含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。③ 培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象。在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最-好接种细胞后1－2h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。结果统计检测穿过的细胞数有两种方法：直接计数法1、“贴壁”细胞计数这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。可以通过给细胞染色，可在镜下计数细胞① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；② 染色：常用的染色方法有结晶紫染色、台靡蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等。③ 细胞计数：使用正置显微镜进行观察和拍照，把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞。也有不少人用手术刀将膜切下后染色，再贴在玻片上，滴二甲苯，再盖上盖玻片，就可以长期保存，但是这样做小室就成了一次性的了，未免有点浪费。取若干个视野计数细胞个数。一般采用3-5个视野，也有人用10个，都是随机选取。间接计数法由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系，有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上，而是掉进下室。间接计数法主要用于穿过细胞过多，而无法通过计数获得准确的细胞数所采用的方法，与常用的MTT实验是同样的原理。1、MTT法① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；② 24孔板中加入500?l含0.5mg/ml MTT的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 4h后取出。③ 24孔板中加入500?l DMSO，将小室置于其中，使膜浸没在DMSO中，振荡10min，使甲湃充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上测OD值。2、荧光试剂检测这类方法一般是与Transwell小室一起出售的，其原理与MTT法类似，是用一种荧光染料染细胞，再将细胞裂解，检测荧光值。3、结晶紫检测原理与MTT法也是类似的。但结晶紫染色还有个优点，就是染色和脱色的过程并不影响膜上细胞，在脱色后还可重新染色。

细胞培养基（cell culture medium）是人工模拟动物细胞的体内生长环境，维持体外细胞存活和增殖的营养物质基础，其主要功能是为细胞提供适宜的pH和渗透压，以及细胞本身不能合成的各种营养物质。本文将对细胞培养基的种类、成分及理化性质，以及相关问题等方面进行介绍。1. 细胞培养基的种类按照细胞培养基的发展历史，细胞培养基大致可分为平衡盐溶液、天然细胞培养基、合成细胞培养基、无血清细胞培养基、限定化学成分细胞培养基等几大种类。1.1 平衡盐溶液（balanced salt solution，BSS）BSS主要是由无机盐、葡萄糖组成，它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。其主要用于细胞的漂洗、配制其他试剂等。几种常用的BSS配方如下（表1-1）。D-Hank's与Hank's的一个主要区别是前者不含有Ca2+和Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。因为Ca2+、Mg2+是细胞膜的重要组成成份，参与细胞粘附等功能，使用不含Ca2+、Mg2+的BSS可避免细胞结团。此外，Hanks液和Earle液是常用的BSS基础溶液，前者缓冲能力较弱，适合于密闭培养；后者缓冲能力较强，适合于5% CO2的培养条件。表1-1 几种常用的BSS配方（g/L）1.2 天然细胞培养基天然培养基指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。其优点是营养成分丰富，培养效果良好，但缺点是成分复杂，来源受限且制作过程复杂、批间差异大。目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。水解乳蛋白是乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，含丰富的多肽、氨基酸和碳水化合物。一般配制成0.5 %溶液（采用平衡盐溶液溶解）与合成培养基（如MEM细胞培养基）以1:1的比例混合使用。目前用于细胞培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。此外，血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应（如精胺、亚精胺）形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡。目前，血清多作为一种添加成分与合成培养基混合使用，使用浓度一般为5 ~ 20 %，最常用是10 %。由于水解乳蛋白和血清成份复杂，批间差异大及存在病毒等外源污染风险，对下游生物制品的分离纯化和安全性都存在较大的影响，在生物制药行业的使用也越来越少。因此，基于对血浆成份的分析，合成细胞培养基应运而生。1.3 合成细胞培养基合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。最早开发的基础培养基（minimal essential medium, MEM），其本质为含有盐、氨基酸、维生素和其他必需营养物的pH缓冲的等渗混合物。在此基础上，DMEM、IMDM 、HAM F12、PRMI1640等各种合成细胞培养基被不断开发出来。常用合成培养基的配方此处不详细介绍，其特性及应用的范围见表1-2。表1-2 常用合成培养基的特性及应用的范围与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用合成培养基时必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的做法是添加5 ~ 10 %的血清，这样才能维持细胞活力，促进细胞增殖。针对不同的动物细胞，现已开发了多种商业化、个性化的低血清细胞培养基配方，营养成份更加丰富，血清使用量可降低至1～3 %，由此可减少了血清等动物来源成份对生物制品安全性的影响。1.4 无血清细胞培养基（serum free medium，SFM）经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养可降低生产成本，简化分离纯化步骤，避免病毒污染造成的危害。无血清培养基，一般是在合成培养基的基础上，加入成份完全明确的或部分明确的血清替代成份，达到既能满足动物细胞培养的要求，又能有效克服使用血清所带来问题的目的。无血清培养基中通常需要添加一些额外的组分，才能帮助细胞贴壁生长，包括以下几大类物质：1）促贴壁物质：一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。2）促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。3）酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中需含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制剂。4）结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加量比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。5）微量元素：硒是最常见的。1.5 无蛋白无血清细胞培养基与化学组份限定无血清细胞培养基1）无蛋白无血清细胞培养基（protein free midium, PFM）这类培养基完全不含有动物来源蛋白，但仍有部份添加物是植物蛋白的小水解片段或合成多肽片段，以及类固醇激素和脂类前体等，以替代动物激素、生长因子的作用。其特点是完全没有蛋白或蛋白含量极低，有利于生物制品的分离纯化。2）化学组份限定无血清细胞培养基（Chemically defined media, CDM）此类培养基是目前最安全、最为理想的无血清细胞培养基，所有成份的浓度都完全明确，即使其所添加的少量蛋白，也是可经过纯化处理，成份明确、浓度确定的蛋白。这类培养基较为理想地减少了生产的可变性，提高了生产工艺的重复性，并有效降低了纯化成本。1.6 个性化细胞培养基严格意义上来说，个性化细胞培养基不在细胞培养基的传统分类之列，其具体是指一类根据细胞特性、细胞培养工艺特点、使用者需求习惯而量身定制的细胞培养基，主要目的是提高细胞产率、产品质量、产品安全性和降低血清的使用等。个性化细胞培养基可能是无血清培养基，也可能是低血清培养基，最终是为满足某一种或某一类生物制品的生产需求。2. 培养基的基本组分细胞培养基必须含有充分的营养物质，才能满足新细胞合成、细胞代谢等生化反应所需要的物质和能量。细胞培养基的主要成份是水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助营养物质等。此外，还可能含有血清、血清替代成分、pH指示剂等。2.1 水水是细胞的主要成份，也是细胞赖以生存的主要环境。细胞培养液中90 %以上的成份是水。细胞对水的品质非常敏感，水的品质将直接影响细胞培养的效果。而水中通常含有重金属、氯、磷、有机物、热原等污染物，细胞培养用水须经过纯化，品质应符合中国药典注射用水标准或者超纯水的标准。2.2 能源和碳源能源和碳源是用于维持细胞生命和支持细胞生长，主要包括糖、糖酵解的产物和谷氨酰胺，其他氨基酸是次要的能源和碳源物质。细胞能够利用的糖类主要是六碳糖，目前大多体外培养时选取葡萄糖作为细胞的主要碳源和能量来源，因此细胞培养基中基本都含有葡萄糖，含量一般为5～25 mmol/L。在葡萄糖浓度较高时，细胞主要通过扩散作用吸收葡萄糖，细胞膜内外的葡萄糖浓度梯度是细胞吸收葡萄糖的动力；在葡萄糖浓度较低时，主要由钠离子推动的高亲和性转运过程使细胞摄取葡萄糖。葡萄糖进入细胞后参与糖酵解、核酸代谢、糖原合成、能量代谢以及一些氨基酸的合成。与体内的能量供应途径不同，体外培养时，一定的浓度范围条件下，葡萄糖主要经糖酵解循环转化成乳酸来为细胞提供能量。2.3 氮源（氨基酸）氨基酸在细胞内的重要生理作用主要体现在以下几个方面：① 是蛋白质的基本组成单位，用于合成蛋白质和多肽；② 可用于合成某些具有重要生理作用的含氮化合物，如核酸、尼克酰胺等；③ 某些氨基酸还具有独特的生理作用，如甘氨酸参与生物转化作用，丙氨酸和谷氨酰胺参与细胞内氨的运输等；④ 可转变成糖类和脂肪，参与氧化供能。细胞所能利用的氨基酸是L型同分异构体，D型氨基酸不能被利用。不同的细胞对氨基酸的需求各异，但有些必需氨基酸是细胞不能自身合成的，必须依靠外源的细胞培养液提供。其余非必需氨基酸，细胞可以自己合成，或通过转氨作用由其他物质转化而来，但是在细胞培养基中添加适当浓度的非必需氨基酸可以减轻细胞在合成方面的负担，提高谷氨酰胺及其它必需氨基酸的利用率。绝大部分细胞对谷氨酰胺有较高的要求，可能因其不仅是细胞的主要氮源，且可作为细胞生长的能源物质和嘌呤、嘧啶核苷酸的前体，另外还可直接作为细胞增殖和产物合成中的蛋白质和多肽的组成成分。在缺少谷氨酰胺时，细胞会生长不良，甚至死亡。由于谷氨酰胺具有多种生理作用，体外动物细胞培养时需要大量谷氨酰胺，利用量常超过其他必须氨基酸利用量的总和。2.4 维生素维生素是维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用。维生素可分为水溶性和脂溶性两类，水溶性维生素主要包括泛酸、维生素B12、叶酸、烟酰胺、吡哆醛、硫胺素、核黄素、维生素C、胆碱、肌醇等；脂溶性维生素主要包括维生素A、D、 E、K等；有的培养液中还直接采用ATP和辅酶A；大部分培养基中还有生物素。许多维生素参与构成各种酶的活性基团的成分，没有它们，酶便没有活性，代谢活动将无法进行。比如，泛酸可以在细胞内转变成酰基载体蛋白和辅酶（如辅酶A），参与糖类、脂类和蛋白质代谢中的催化反应；维生素B12则在细胞内参与叶酸的合成和脂肪酸的合成等。不同配方的细胞培养基中维生素的浓度有较大差异。例如，DMEM培养基中维生素的含量约为MEM培养基的两倍，其原因是一方面不同种类维生素的作用不同，另一方面不同种类的细胞对维生素的需求也可能有较大差异，相应细胞培养基的配方中维生素的含量也可能不同。2.5 无机盐无机盐是细胞维持生命活动所不可缺少的营养成分，主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl－、PO43—、SO42—、HCO3－等，主要作用为维持细胞培养液渗透压平衡，参与细胞的代谢活动。此外，通过提供钠，K+和Ca2+，帮助细胞调节细胞膜功能。Na+是细胞外液中最主要的阳离子，对维持渗透压的恒定有决定性的作用，还与Cl－共同参与生物电活动、维持水平衡和酸碱平衡等。K+主要分布在细胞内液，对于激活某些酶是必需的，并在调节细胞内环境的酸碱平衡上也有极重要意义。Ca2+和Mg2+主要参与信号传导、能量代谢、脂肪酸合成、核糖体稳定和蛋白质合成等多种生理作用。PO43－、SO42－、HCO3－是基质所需阴离子，同时是细胞内电荷的调节者。磷对于细胞的生长、代谢和调控都有重要的作用，含磷的化合物如核酸、磷脂、蛋白质是构成细胞的主要成分，ATP、ADP是能量生成、存储和利用的不可或缺的化合物。上述离子对于细胞的作用各有不同，它们共同构成了细胞赖以生存的渗透压、pH和电化学平衡的微环境，细胞对于某种元素的吸收利用会受到其它元素的干扰，例如培养基中过高的钙离子浓度会使镁和锌的吸收利用受到干扰。因此，在保证培养基中上述离子浓度满足要求以外，还需保证上述离子之间种类和比例的平衡。此外，微量元素如铁、钴、镍、硒、碘、铜、锌、锰、铬、钼、氟等对于细胞生长代谢和产物合成都有促进作用。微量元素在细胞内通常以与有机物结合的形式存在。其中铁在细胞中参与氧的转运；钴是维生素B12的组成部分，参与叶酸的合成和脂肪酸的合成；镍能够激活脱氧核糖核酸酶、乙酰辅酶A合成酶等在细胞内具有重要功能的酶，还具有稳定核酸结构的功能；亚硒酸钠中的硒，作为谷胱甘肽过氧化物酶的辅基，具有抗过氧化物能力，参与消除细胞内的脂肪酸过氧化物，提高细胞的生长速率和活性。2.6 其他添加成分在低血清、无血清细胞培养基中，为满足细胞生长增殖需要，常常添加一些成份：蛋白质、多肽、核苷、嘌呤、柠檬酸循环的中间产物、脂类、及一些血清替代因子等。其中蛋白质具有重要的作用，动物细胞对许多物质（难溶于水的离子或脂类物质）的摄取需要借助蛋白质的传递作用，如白蛋白、传递蛋白、贴壁蛋白等能够携带脂肪酸、激素、矿物质等促进细胞生长。转铁蛋白是一种重要的传递蛋白，能够结合铁，促进细胞对铁离子的吸收，并具有解毒作用，其促生长作用可能与其具有生长因子的功能有关。胰岛素可促进细胞对葡萄糖和氨基酸的利用，商业化中一些生长因子以重组蛋白形式添加到培养基中，主要用来刺激细胞增殖，并可促进糖元和脂肪酸的合成。乙醇胺是一种重要的刺激细胞生长的化合物，是脑磷酸的合成前提。另外，酚红作为pH值的指示剂被加入到细胞培养基中。酚红在产物纯化过程中会造成干扰，并且具有一定的固醇类激素样作用，如雌激素样作用。当用于哺乳类动物细胞的培养，可能会发生一些固醇类反应。现在商业化细胞培养基中的酚红含量可根据需求调整。因生物反应器具有pH在线检测技术，生物反应器培养动物细胞时，酚红可完全去除。2.7 保护剂细胞保护剂是保护细胞免受渗透压变化、剪切力、氧化及气泡作用等引起的损伤的物质。在使用生物反应器培养动物细胞时，细胞易被机械搅拌和通气鼓泡产生的流体剪切力和气泡作用所伤害甚至破损死亡。为降低这种损伤，除优化生物反应器结构和生产工艺外，可在细胞培养液中添加一些保护剂。其主要是通过改变细胞培养基物性或是对细胞具有保护作用的物质，常用的种类有血清、白蛋白、聚已二醇（PEG）、非离子性表面活性剂PluronicF68或是其他一些高分子聚合物等。3. 细胞培养基的理化性质动物细胞在细胞培养基中不仅能存活，还要分裂增殖，合适的渗透压、pH值等理化性质是细胞培养基必须具备的前提条件。3.1 pH动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，适宜pH在7.2～7.4之间。细胞培养基的pH值通常需经校正的pH计来测定。在细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，二氧化碳不断被释放，培养液变酸，pH值发生变化。酚红是细胞培养基中最常用的pH指示剂，但依靠细胞培养基中的酚红等pH指示剂进行判断，需要实验员的经验积累，存在较大的主观性。实际上，个性化细胞培养基或是无血清细胞培养基中酚红含量较少或是不含酚红，只能通过pH计或者pH电极进行pH值的检测，结果更为准确可靠。3.2 缓冲能力细胞培养基应具有一定的缓冲能力。细胞培养过程中造成细胞培养液 pH 波动的主要物质是细胞代谢产生的CO2。在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，细胞培养液pH 很快下降；打开培养器具时CO2逸出则会引起pH升高。细胞培养基通常采用NaHCO3-CO2缓冲系统，按下列化学反应方程式调节细胞培养基的pH值：H2O + CO2 → H2CO3 ? H+ + HCO3－NaHCO3 ? Na+ + HCO3－此外，还有缓冲能力较高的磷酸盐缓冲系统。但碳酸盐缓冲系统的细胞毒性小、成本低，在细胞培养中应用得更为广泛。另一种较为常用的缓冲液是HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）液，它是一种非离子两性缓冲液，在pH 7.0 ~ 7.2范围内具有较好的缓冲能力。高浓度的HEPES可能对细胞有毒性作用，细胞培养时HEPES的添加浓度一般为10～25 mmol/L。3.3 渗透压细胞必须生活在等渗的环境中，大多数体外培养的细胞对渗透压有一定耐受性。研究显示，对于大多数哺乳类动物细胞，渗透压在260～320 mOsm/kg的范围内都适宜。在生产、配制细胞培养基的过程中，渗透压的测定较为重要，有助于防止在生产、配制过程中出现称量等方面的错误。反应器高密度培养动物细胞过程，在添加碳酸氢钠的过程中注意渗透压的监控，防止渗透压过高对细胞的损害。3.4 温度温度对细胞培养基有较大的影响，温度过高可引起营养成份的降解或破坏，细胞培养基的pH、离子强度和电解常数pKa也可能受到影响。如细胞培养液中的谷氨酰胺，在高温条件下降解的速度较快，如35 ℃贮存时，放置3天降解25 %左右，在4 ℃贮存3周降解约20%。3.5 粘滞性及表面张力含血清细胞培养液的粘滞性主要是由血清引起的，在转瓶培养贴壁细胞时，培养液的粘滞性对细胞生长没有多大影响；但在生物反应器悬浮培养细胞时，细胞培养液的粘滞性则直接影响搅拌转速控制及搅拌剪切力对细胞造成的损伤程度。表面张力对细胞培养有较大的作用，尤其在利用生物反应器进行悬浮培养时，搅拌和通气都会引起泡沫的产生。对于含血清培养液，由于血清中多种蛋白的存在，搅拌时产生的气泡较多，气泡的上升运动对细胞的损伤程度还有争议，但气泡的破裂对细胞有明显的损伤作用。为降低这种损伤，可通过在细胞培养基中添加一些保护剂，降低细胞-气体和细胞-液体的表面张力，减少气泡的形成。4. 细胞培养基的灭菌及储存4.1不同细胞培养基的除菌方式及注意事项细胞培养基灭菌的方式分为高压灭菌和膜过滤除菌，不同的培养基由于其营养成份不同，灭菌方式也可能不同。① 高压灭菌某些培养基（如MEM）可进行高压灭菌，这类培养基一般不含有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，一般是在培养基高压灭菌后才加入。另外可用耐高压的谷氨酸盐（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）代替L-谷氨酰胺。可高压灭菌的培养基在121℃、15 psi，15分钟的条件下完全可达到灭菌效果及营养成分的最小损失，不需将灭菌时间延长。绝大多数细胞培养基不适宜高压灭菌。因培养液中常含有维生素、蛋白质、多肽、生长因子等物质，这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能，因而上述液体多采用过滤消毒以除去细菌。可供过滤灭菌使用的滤膜很多，其材料多为polyethersulphone（PES）、尼龙、多聚碳酸盐、醋酸纤维素、硝酸纤维素、PTFE、陶瓷等。膜过滤除菌是当前较为常用及便捷的一种方法，常采用0.2 μm孔径的滤膜，部份采用0.1 μm孔径。与高压过滤方式相比，滤膜具有使用期限且价格较高，但对细胞培养基的营养成份破坏性较小。4.2 不同细胞培养基存储过程中的注意事项通常液体细胞培养基避免-20 ℃冻存，因为解冻时可能会有营养成份析出，影响培养效果。正常情况下于2 ~ 8 ℃避光保存，使用前从冰箱取出，放入室温进行平衡。通常的液体培养基有效期是6个月到12个月。液体细胞培养基尽量避免长期贮存，其中的谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解，如果细胞生长不良，可考虑检测培养基中的谷氨酰胺含量确定是否再补加谷氨酰胺。市售商业化液体细胞培养基有具体的有效期，对于使用干粉细胞培养基自行配制成液体以后，也应低温（2 ~ 8 ℃）贮存。除培养基中如谷氨酰胺易降解之外，培养基中的其他成份随着温度的升高也可能会发生降解或是析出。5. 细胞培养基使用过程中常见问题分析5.1 细胞培养基的缓冲系统选择及pH变化问题由于大多数细胞适宜的pH为7.0~7.4，偏离此范围可能对细胞生长产生有害的影响。但各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养的细胞一般对pH变动耐受力差，无限细胞系耐受力强。因此，原代培养时，培养液中的缓冲系统就显得较为重要。一般的细胞培养基采用的都是平衡盐系统，但不同的培养基或是同一系列的培养基所用平衡盐系统不同，如199系列、MEM系列均有Hanks’系统的培养基及Earle’s系统的培养基。有些培养基不是上述常规的平衡盐系统，例如RPMI1640培养基、F12培养基。MEM低血清培养基的平衡盐系统也不是常规的平衡盐系统，该平衡盐系统的缓冲能力强于常规平衡盐系统的缓冲能力。细胞培养过程中pH值下降产生的原因有很多。在细胞生长非常快时，pH值通常下降得很快，此时可以通过及时传代、提高传代比例或降低血清量等方法进行解决。此外，培养瓶盖拧得过紧、NaHCO3缓冲系统缓冲能力不够、培养液中盐浓度不正确、细菌、酵母或真菌污染等也能导致pH值通常下降得很快。这时，可以通过以下几种方法解决：1）增加培养液中NaHCO3浓度或减少培养箱内CO2浓度。NaHCO3含量在2.0 g/L到3.7 g/L之间时对应的CO2浓度为5~10%；2) 改用不依赖CO2培养液；3) 适当松开瓶盖。在培养液中加HEPES缓冲液，使终浓度为10~25 mM；4) 在CO2培养环境中改用基于Earle’s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks’盐配制的培养液；5) 如果是污染造成的则丢弃培养物或用抗生素除菌。5.2 细胞培养基常用几种重要的添加成份及使用过程中应注意的问题酚红在细胞培养基中用作pH值的指示剂。一般情况下，可以通过酚红的指示作用判断培养基的pH值，但低血清或是无血清细胞培养基中酚红的含量与普通细胞培养基中的酚红含量不同，不能通过肉眼观察或通过经验来判定pH值，建议使用pH计进行测定。酚红通常对含血清的细胞培养基生产的生物制品质量并不会产生明显影响，也可通过纯化技术去除，但酚红在无血清细胞培养基中可能带来胞内钠/钾失衡，影响细胞生长。碳酸氢钠在细胞培养基中主要是作为缓冲系统，此外还具有调节渗透压的作用。通常产品使用说明中的碳酸氢钠推荐量是一个标准、安全量，是在科学的基础上根据实践经验所得。但是由于不同的细胞系（株）不同，同一株细胞适应环境也可能不同（细胞耐受性不同等），且存在的地域性水质差异等，在实际生产过程中也可稍作改动，但使用者需做相应的检测（理化及细胞生产试验等）。HEPES是一种非离子缓冲液，在pH 7.2 ～7.4范围内具有较好的缓冲能力，在高浓度时对一些细胞可能有毒。HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠（0.34 g /L）共用，以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加。其安全浓度范围是10～25 mmol/L。丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是在没有葡萄糖的条件下，细胞也可以代谢丙酮酸钠。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4 ℃下放置1周可分解50 %，使用中最好单独配制，置-20 ℃冰箱中保存，使用前加入细胞培养液中。

在我们的身体里，各种各样的细胞，各种各样的器官组织，一年365天，全年无休，大约有37兆2千亿个居民（细胞）四散分布，在各自区域坚守工作岗位。今天，小编带大家来了解一下红细胞和白细胞。血细胞的那些事儿1、 它们的身世之谜大家都来自于造血干细胞的分化，红细胞和白细胞，也包括血小板和巨噬细胞等在内的血细胞都是一个“老祖”，叫做髓系祖细胞。那么问题来了，如果白细胞和嗜碱细胞嗜酸细胞算是兄弟姐妹，那么白细胞和红细胞就是表兄妹了哈！/2、 红细胞数量多在红细胞生成素的命令下，骨髓制造一批批新的红细胞。人类的红细胞是双面凹的圆饼状的，成熟了就没有核了。红细胞中含有血红蛋白，所以红细胞最主要的职能就是流动“小货车“，运输氧气，当然也会把代谢出来的废物——二氧化碳回收到肺，排出体外。运输二氧化碳时呈暗紫色，运输氧气时呈鲜红色。红细胞：哺乳动物的红细胞呈两面凸中央凹的圆饼状，中央较薄。周缘较厚，故在血涂片标本上中央染色较浅、周围比较深。新鲜单个红细胞为黄绿色，大量红细胞使血液呈深红色。成熟的红细胞（哺乳动物）没有细胞核和线粒体，富含血红蛋白。依靠葡萄糖合成能量，平均直径为7微米。3、白细胞品种全还有一个血细胞叫白血球或者白细胞，白血球那就更重要了，它是人身体里面到处巡逻的巡警。白细胞是一类无色、球形、有核的血细胞。正常成人白细胞总数为(4.0～10.0)x 109/L，可因每日不同时间和机体不同的功能状态而在一定范围内变化。白细胞不是一个均一的细胞群，人体的白细胞分了5大类，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞都是白细胞军团成员。作为勇敢的白细胞家族成员，这些细胞有着不同分工。白细胞是人体与疾病斗争的“卫士”。当病菌侵入人体体内时，白细胞能通过变形而穿过毛细血管壁，集中到病菌入侵部位，将病菌包围、吞噬。如果体内的白细胞的数量高于正常值，很可能是身体有了炎症。4、它们的临床意义 红细胞减少：①红细胞生成减少 ，见于白血病等病：②破坏增多：急性大出血、严重的组织损伤及血细胞的破坏等 ③合成障碍：缺铁，维生素B12的缺乏等。增多：常见于身体缺氧、血液浓缩、真性红细胞增多症、肺气肿等。白细胞增多：常见于急性细菌性感染、严重组织损伤、大出血、中毒和白血病等。减少：镇痛药、磺胺类药的服用；病毒感染；免疫系统衰弱；放化疗的影响。对于每一个为我们身体工作的细胞们来讲，一点点的伤害都像一场灾难，作为身体的主人，我们更要为这群细胞做点努力。

1，什么是瞬时转染和稳定转染？瞬时转染：外源片段的表达时间短暂。这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且无法在这个系统上实现可诱导表达。稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。稳定整合的几率因基因传递的方法而异，跨度可以从10-8到10-1。因此，对于有的转染方法，比如化学试剂介导的转染，其整合几乎可以忽略不计。质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递方法，呈现不同的靶向倾向性，所以是一种半随机整合。2，设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些？稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有：1)，外源插入片段的拷贝数。多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。2)，整合的几率，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。3)，整合位点的转录活跃度，决定了稳定株中外源片段的表达质量。最理想的状况是单拷贝，但转录活性比较高。4)，整合后的稳定性。不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况。5)，最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株，或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助研究人员获得更精确的实验数据。3， 什么时候需要稳定细胞株？以下实验，构建稳定细胞株而不是瞬时转染更能满足实验要求：1)，外源片段在分裂细胞中长期(>2周)稳定表达。虽然普通转染实验一般只能保证2-4天的转染和表达效率，但腺病毒载体在多数分裂细胞中可以维持2-4周内的高转染效率和表达周期。而非分裂细胞，可以使用腺相关病毒载体转导外源基因，因为腺相关病毒载体在许多非分裂细胞中可以保持长达1年的高效表达。2)，需要构建使用诱导表达系统，这主要是由于：a)，过表达基因或者干扰目的基因引起细胞毒性或者抑制细胞生长等不利因素; b)，目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性。3)，希望控制目的基因过表达或者干扰的拷贝数，以避免引入人为因素影响实验结果的精确性。构建稳定株可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究。4)，部分细胞种类，病毒载体亦无法达到高转导效率，通过构建稳定株，达到外源片段的高效表达。5)，长期在少数几类细胞中研究几个基因的功能，通过构建稳定株，可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本，也极大方便实验研究。6)，部分蛋白稳定性极强，瞬时RNA干扰因为作用周期短，只能抑制目的基因的表达，但无法去除已经表达的目的蛋白，所以需要通过构建稳定株实现更好的基因干扰效果。7)，需要往动物体内注射表达有外源片段的细胞。需要构建稳定细胞株，以防止注射入动物体内后，很快外源片段表达丢失。8)，细胞个体差异(同一类细胞，不同个体细胞基因组存在差异)对实验结果有干扰，需要构建单克隆细胞株去除干扰。9)，需要将外源片段插入基因组中，比如基因敲除，基因插入突变筛选等修饰基因组的实验。4， 什么时候不需要构建稳定株？以下实验不需要构建稳定株：1)，希望迅速观察目的基因过表达或者干扰效果。例如在正式实验之前进行的小规模预实验。2)，2-4天的瞬时表达已经可以达到具体的实验目的，比如检测两个外源转染的目的蛋白之间的相互作用，或者观察某些细胞周期抑制，凋亡或细胞存活相关基因的细胞表型。3)，细胞个体差异对实验结果有影响。体外培养非原代细胞，多为转化细胞系或者癌细胞，细胞个体差异大，瞬时转染或者使用腺病毒/腺相关病毒载体进行转导更可以反映细胞群体行为。或者使用逆转录病毒载体构建混合稳定株。5， 病毒载体构建稳定细胞株有什么优势？化学试剂介导的转染方法和电转，整合率低，同时整合位点不稳定，易发生再次丢失的情况，而且整合位点一般都在转录活跃区之外，所以并不是理想的稳定整合工具。另外，整合后的拷贝数是由核内的外源DNA局部浓度，而不是转染时的DNA的量决定，而化学方法在输入质粒载体入核的效率比电转和病毒载体相比要低得多，导致其转染相同细胞所用质粒载体用量要大大高于其它方法，造成入核质粒载体量难以控制，这也解释了为什么化学转染方法和其它两种方比，更倾向于得到串联多拷贝。以上种种因素，导致使用非病毒载体转染方法构建稳定株，成功率低，稳定性差，稳定克隆株易出现不均一(含有非整合细胞)等缺点。逆转录病毒载体由于整合率高，是非常理想的稳定株构建工具。而且通过控制逆转录病毒载体转导的实验条件，理论上可以确保每个细胞只有单拷贝插入。同时由于病毒载体是通过病毒重组酶将外源片段整合入染色体中，其整合特性和病毒自身整合特性非常相似：偏向于转录活跃区段，且整合后非常稳定，在传代100次后仍然保留在宿主基因组中。最重要的是整合几率和所有其它化学，物理转染方法比，增加5至6个数量，使得稳定株构建不再成为实验研究的障碍。由于整合几率非常高，所以很容易获得混合稳定株。腺病毒载体整合率和普通转染方法差异不大，被认为是不能整合的一类病毒载体，因此相关研究数据较少，不建议用来构建稳定株。非野生型腺相关病毒载体(Rep-)整合率较低，但因为野生型病毒载体可以定点将病毒基因组整合于人19号染色体，所以从安全性和稳定性角度来说，潜力都非常巨大。由于诸多因素，研究人员仍然在对其进行改造中，包括考虑到啮齿类动物不含有人19号染色体对应的整合位点序列。6， 筛选稳定细胞株的方法主要有哪些？主要有三类方法：1)单克隆环法：此类方法多用于整合率低的转染方法或者需要得到单克隆细胞株的实验。其优点在于工作量小，只需将转染或者病毒载体感染后的细胞按照一定的细胞密度转移至新皿中，并使用合适的药物进行筛选，最后在克隆环的帮助下对单克隆细胞株进行挑选，并在新皿中完成扩增。缺点在于需要对细胞密度和药物浓度绘制致死曲线并选取合适的细胞密度和药物浓度进行筛选，一些细小的密度和浓度差别都会导致难以获取均一的单克隆，结果导致获取的克隆不纯，含有非整合的细胞。稳定整合的细胞在这样一类混合细胞中，很快会失去生长优势，最终导致失去稳定株。 2)96孔单克隆稀释法：此类方法同样多用于整合率低的转染方法或者需要得到单克隆细胞株以及筛选悬浮细胞稳定株的实验。其优点在于，理论上可以得到非常均一的单克隆，同时可以筛选悬浮细胞稳定株。其缺点在于，工作量比较大。3)逆转录病毒混合克隆制备法：此类方法适用于需要制备混合稳定株。优点在于可以在短时间内(1周)获得稳定细胞株，同时也可以随时将细胞稀释转移至新皿中获得单克隆细胞株。缺点在于需要制备逆转录病毒载体。7 为什么常规转染方法筛选稳定株异常困难？常规化学转染或者电转方法，其整合是非同源重组随机整合，几率非常低(10-8-10-6) ，且这些转染条件下发生的整合多发生在转录非活跃区或者重复序列区，导致外源片段表达效率低，同时这些整合常常不稳定，随着传代次数的增加，即使在有压力选择的情况下也容易发生丢失。8，为什么病毒载体介导的稳定株筛选方法效率要比常规方法高？逆转录病毒载体的染色体整合依赖于病毒重组酶，是一个酶催化反应，因此效率相比随机整合要高多个数量级。而且整合位点多位于转录活跃区，因此表达效率高。同时其整合非常稳定，连续传代100代以上仍然保持稳定表达。9, 如何选择适合的病毒包装类型进行稳定株筛选？并非所有的病毒载体都适合用来进行稳定株筛选，首先需要挑选整合效率高，整合位点稳定的病毒载体。至今为止，逆转录病毒载体是最有效的可以介导基因整合的病毒载体。其次，依据具体实验要求，挑选不同整合位点倾向性的逆转录病毒载体。倾向于整合于转录起始位点附近的，容易造成下游基因的激活; 而整合于转录活跃基因内的，容易导致整合区基因的插入失活。10, 病毒载体介导的稳定株筛选方法可以适用于任何靶细胞吗？虽然普通的逆转录病毒载体可以用来进行稳定株的构建，然而这一类病毒载体并不能高效感染非分裂细胞，因此对于这一类分化细胞，可以使用慢病毒载体进行稳定株构建。也可以使用腺相关病毒载体高效感染非分裂细胞，这一类病毒载体虽然整合率低于慢病毒载体，但其可以以染色体外形式长期(数月至数年)存在于非分裂细胞中，因此可以避免进行稳定株筛选。11, 为什么稳定株构建服务中不使用腺病毒载体？腺病毒载体由于其整合几率极低，被普遍认为是不具备整合能力的病毒载体，所以一般不用来进行稳定株构建。12, 单克隆稳定株和混合克隆稳定株有什么区别？我该选择哪一类用于我的实验？单克隆稳定株顾名思义来源于含有稳定整合外源片段的单个细胞的扩增，而混合稳定株则由多个单克隆稳定株构成的克隆群，不同的单克隆其外源片段的整合位点不一样。由于体外细胞多属于细胞系，其基因组呈现不稳定的特点，因此即使是同类细胞，不同细胞个体基因组背景都存在差异。当需要去除细胞群体干扰因素的时候，推荐使用单克隆稳定细胞株，其基因组背景相对单一，对实验结果干扰因素小。当进行系统生物学研究时，多考虑这类因素。同时也是由于不同细胞个体差异大，而且不同整合位点的单克隆细胞株表现出来的细胞行为可能不一致，所以许多实验使用混合克隆株更能去除细胞间差异造成的干扰。混合稳定株可以通过逆转录病毒直接筛选获得，或者通过讲众多不同的单克隆稳定株混合获得。前者无论是是从质量，还是时间周期来看都更好。13, 怎么判别筛选的稳定株是单克隆？1)，如果外源片段含有荧光标记，可以直接使用流式细胞仪检测其荧光是否均一; 如果还有其它标签，可以进行免疫荧光标记，再使用流式细胞仪观察荧光分布是否出现均一峰值。因为不同单克隆由于整合位点不一样，其表达强度也会受附近染色体结构的影响，出现差异。2)，如果外源片段不含任何标签或者荧光标记，则可以使用分子生物学比如Southern Blot的方法鉴定。3)，使用96孔板稀释法筛选，得到的阳性克隆一般是单克隆。因为最初如果混有非整合细胞，则含有整合外源片段的单细胞多半会失去生长优势，无法得到阳性克隆。使用单克隆环法，如果挑取的是致密，单一的克隆，那么多半也是单克隆。14，如何判别筛选的稳定株是100%含有外源整合片段的细胞群？通过观察所携带的荧光标记或者对外源插入片段进行免疫荧光标记可以判断稳定株是否混有非整合细胞。15，为什么有的时候构建RNAi稳定株对达到高效的基因干扰效果是必须的？RNA干扰效应主要是影响目的基因所表达的mRNA的稳定性或者翻译，并不影响已经存在的目的蛋白的状态。部分蛋白其稳定性异常高，即使mRNA的表达水平或者翻译受到干扰，目的蛋白仍然可以在很长一段时间内发挥功能。因此需要进行稳定株筛选，以挑取干扰效果好的细胞克隆进行实验。在一些极端情况下，甚至需要进行第2轮稳定株筛选，才能获得一个比较好的RNA Knock down细胞株。

细胞培养最怕支原体污染，但有一些被污染的细胞不能被丢弃时该怎么办？今天小编把一个小绝招教给你，简单有效！如何祛除细胞上的支原体污染？据研究表明，约98％的支原体存在于细胞表面和细胞间隙。支原体直径约180~350nm，比细胞小很多，经低速离心与细胞分离。通过反复悬浮冲洗、离心，加上使用我们的Zell Shield?，即可在细胞培养四代以内有效地祛除支原体。什么是Zell Shield?？Zell Shield?是一种链青霉素类复合抗生素，对细胞影响很小，可以有效抑制细胞培养中的支原体、细菌、霉菌、真菌等微生物增殖。普通的链霉素、青霉素对支原体没有效果。具体是怎么操作呢？1.首先把被支原体污染的细胞消化下来，放入离心管离心，弃上清。再加入干净的PBS悬浮冲洗细胞、低速离心（300~500r/min）、弃上清，反复三次。这样可祛除细胞表面60％~70％的支原体，支原体还剩约30％~40％.2.细胞加入含1％Zell Shield?的新鲜培养基，传代培养。这时因培养基中Zell Shield?的抑制作用细胞培养过程中，虽然细胞增殖，但残留的支原体无法增殖。细胞需再次传代时，把第二代细胞消化下来，离心，弃上清。加入新鲜PBS悬浮冲洗、再离心、弃上清，反复三次，这时，细胞上残留的支原体大约已剩余为最初污染量的10％左右。3.细胞加入含1％Zell Shield?的新鲜培养基，传代培养。需再次传代时把第三代细胞消化下来，离心，弃上清。加入新鲜PBS悬浮冲洗、再离心、弃上清，反复三次，可再次祛除60％~70％的残余支原体，通过冲洗、抑制、换液等操作，细胞中支原体的残留污染量大约只剩3％左右。4.细胞加入含1％Zell Shield?的新鲜培养基，传代培养。需再次传代时把第四代细胞消化下来，离心，弃上清。加入新鲜PBS悬浮冲洗、再离心、弃上清，反复三次，可再次祛除60％~70％的支原体，此时，支原体残留量大约已低于1％.支原体的增殖亦有密度要求，用Zell Shield?处理过四代的细胞，即便撤掉Zell Shield?，只要保证没有新的支原体人为再次带入，原有支原体也无法再增殖，随着传代，换液，支原体的老化、死亡，细胞中的支原体污染基本就彻底解决了。敲黑板，划重点啦1.每次传代时，重复三次对细胞悬浮冲洗步骤非常重要，操作要正确、规范，以达最佳效果！2.在培养基中加入1％Zell Shield?抑制支原体增殖！3.使用安全的血清、培养基等试剂，不再有新的支原体加入！做到以上三点即可确保祛除支原体污染。Zell Shield?工作原理是什么？支原体祛除剂Zell Shield?（培养基用）是一种即用型链青霉素类的复合抗生素，在培养基中1%的浓度通过阻止原核生物DNA及蛋白的合成，抑制细胞培养中遇到的细菌、真菌、霉菌增殖，更可以有效、精确地抑制支原体增殖，且对细胞基本安全。品名：支原体祛除剂Zell Shield?（培养基用）规格：50mL/瓶储存温度：-18℃使用注意事项：实验室初次使用，注意分装，分装后的小包装Zell Shield?仍-20℃避光冷冻保存，现配现用。