原代细胞是指从机体的组织（如人组织、小鼠组织、大鼠组织和兔组织等）经蛋白酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体培养的 细胞，称为原代细胞。一股认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细抱培养。在人工条件下使其原代细胞生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞疡变、细胞工程等问题的研究。那么关于原代细胞的传代培养，我们应该怎么做呢?一股有以下两种方法：一、贴壁细胞的消化法传代1、吸除或倒掉瓶内旧培养液。2、加入1ml左右消化液（胰蛋白鳄或与EDTA混合液）轻轻接动培养瓶，使瓶底细胞都浸入溶液中.3、消化2-5分钟后把培养瓶放置在显微镜下进行观察，发现原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时，弃去消化液，加入培养液终止消化。4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中继续培养.第二天观察贴壁生长情况。二、悬浮细胞的传代1、直接传代①让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸掉1/2-2/3。②用吸管吹打形成细胞悬液后，分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中培养。2、离心法传代①将细胞连同培养液一并转移到离心管内，离心800-1 OOOrpm, 5分钟。②去除上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液。③将细胞悬液分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中培养。

1 检验目的做疾病的病原学诊断，查找于疾病有关的病原菌以及了解与疾病的关系，指导临床治疗及预后和流行病学的调查。2 原理人体很多部位与外界相通，存在栖息菌群，但不致病，当菌群失调或分离到致病菌则具有临床意义；另外机体某些部位是无菌的，如检出则视为致病菌。并排除采样及操作污染。3 标本要求（1）标本类型：，骨髓，脑脊液，胸水，腹水，尿液，等；痰液，前列腺液，脓液，组织分泌物或穿刺液等。（2）标本采集：见标本采集手册（3）标本储存和运输：室温放置，室温运输并立即送检。人泌尿生殖道标本如白带前列腺液等需临床标本接种于巧克力平板或特殊的运送培养基并置保温设备中送检。（4）标本拒收状态：非无菌方式采集的标本或未按要求部位采取的标本。4 容器和添加剂类型均使用灭菌器皿盛放标本5 试剂（1）试剂名称：革兰氏染液、氧化酶试剂、3%触酶、血平板、麦康凯平板、相关试剂等（2）试剂生产厂家：上海远慕生物科技有限公司6 设备：（1）接种针、接种环、酒精灯、（2）BACT-IST微生物鉴定系统。（3）、GNP-P270隔水式恒温培养箱、SW-CJ-IF超净工作台、MCO-15A三洋牌二氧化碳培养箱、0414-1台式、FA1004电子天平7 操作步骤（1）血液、骨髓、脑脊液等标本按照培养目的增菌培养12-18小时后盲目接种或待自动分析仪报警后接种。（2）接种：以上增菌标本及其他临床标本用接种环取标本接种环划线血平板及其他选择性培养基上,35℃培养过夜，观察结果。（3）涂片：肉眼见细菌生长，取生长物涂片做革兰氏染色；（4）纯培养：根据需要接种血平板、巧克力、中国蓝/麦康凯或厌氧平板过夜培养以获得纯培养。（5）鉴定：按照鉴定仪要求调配菌液浓度8 生物参考区间血液，骨髓，脑脊液等无菌部位采取的标本未见细菌生长；其他标本如大便，痰液为正常菌群或未见致病菌。9患者检验结果的可报告区间细菌鉴定到种或属；菌群调查报告比例。10 临床意义：为医生提供病原学诊断，并为进一步药敏实验提供依据。

1．生化鉴定是细菌鉴定中最重要的一种，主要是借助细菌对营养物质分解能力的不同及其代谢产物的差异对细菌进行鉴定，包括蛋白质分解产物试验、触酶试验、糖分解产物试验、氧化酶试验、凝固酶试验等。2．血清学鉴定适用于含较多血清型的细菌，常用方法是玻片凝集试验，并可用免疫荧光法、协同凝集试验、对流免疫电泳、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验等方法快速、灵敏地检测样本中致病菌的特异性抗原。用已知抗体检测未知抗原（待检测的细菌），或用已知抗原检测患者血清中的相应抗细菌抗体及其效价。血清学鉴定操作简单快速，特异性高，可在生化鉴定基础上为细菌鉴定提供确定诊断。3．分子生物学检测适用于人工培养基不能生长、生长缓慢及营养要求高不易培养的细菌，检测方法包括核酸扩增技术、核酸杂交、生物芯片及基因测序等。常见的核酸扩增技术有聚合酶链反应、连接酶链反应等，主要用于耐甲氧西林、结核分枝杆菌等病原菌的检测。核酸杂交有斑点杂交、原位杂交等，用于致病性大肠埃希菌、沙门菌、空肠弯曲菌等致病菌的检测。生物芯片包括基因芯片和蛋白质芯片，主要是对基因、蛋白质、细胞及其他生物进行大信息量分析的检测技术。4．微生物自动鉴定系统鉴定可快速、准确地对临床近千种常见分离菌进行鉴定，目前已在临床实验室广泛使用。其中，细菌16S rRNA编码基因已成为较理想的基因分离靶序列，逐渐成为临床细菌鉴定、分离的金标准。5．质谱技术是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，用于分析细菌的化学分类和鉴定，具有高灵敏度和高质量检测范围的优点。主要是对核酸、蛋白质、多肽等生物大分子串联质谱进行分析。

使用培养箱注意一些技术细节：（1） 培养箱应由专人负责管理，操作盘上的任何开关和调节旋扭一旦固定后，不要随意扭动，以免影响箱内温度，CO2、湿度的波动，同时降低机器的灵敏度。（2） 所加入的水必须是蒸馏水或无离子水，防止矿物质储积在水箱内产生腐蚀作用。每年必须换一次水。经常检查箱内水是否够。（3） 箱内应定期用消毒液擦洗消毒，搁板可取出清洗消毒，防止其它微生物污染，导致实验失败。（4） 定期检查超温安全装置，以防超温。方法为按进监测报警按扭，转动固定螺丝，直到超温报警装置响，然后关闭超温安全灯。（5） 如长期不使用二氧化碳时，应将CO2开关关闭，防止CO2调节器失灵。（6） 所使用的CO2必须的纯净的，否则降低CO2传感器的灵敏度和污染CO2过滤装置。（7） 在无湿度控制的培养箱内，为保持箱内CO2 的稳定，要在箱内底层放入一个盛水的容器。

一）免疫组化染色假阳性及其对策1、消除内源酶的影响在涉及免疫过氧化酶的各种染色中，均用过氧化物酶来标记抗体，酶的作用是催化底物，使显色剂显色，正常组织中也含有一定量的过氧化物酶，其同样也能催化底物显色，而影响免疫组化染色的特异性，因此在加入标记酶前应设法将其灭活，以保证染色反应的特异性。通常情况下，去除内源酶的方法是先用3%的过氧化氢溶液作用，但在含有丰富血细胞的标本中，由于血细胞中存在大量具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢产生强烈的反应，产生气泡而破坏组织结构和细胞形态。在OCT包埋的冰冻切片中，使用3%的过氧化氢化溶液亦会产生类似现象。此时可用3%的过氧化氢甲醇溶液孵育20分钟的方法灭活内源性酶。灭活内源酶对正确判断含血细胞较多的标本，如骨髓、胎盘、脾等的染色结果十分重要。同样，正常细胞也含生物素，尤以肝、脾、肾组织含量为多。在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合后继抗体，形成亲和素（或链亲合素）-生物素复合物，导致假阳性发生。消除这种非特异性着色的方法，是在采用生物素方法染色前，对标本进行亲和素处理，使其结合位点饱和。2、抗体导致的非特异性着色高纯度、高效价的抗体是免疫组化染色的关键。出现下列情况时，可能发生非特异性着色。（1）因抗原不纯而导致制备的抗体不纯，常见于多克隆抗体。可用亲和层析的方法除去非特异性抗体或应用高纯度的抗原制备抗体，采用单克隆抗体能避免非特异着色。（2）标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇，解决的方法只有采用针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体。3、消除非特异性背景着色非特异性着色最常见的情况是蛋白质（抗体）吸附到组织切片中高度荷电的胶原及结缔组织成分上，防止非特异性背景着色的方法之一是在滴加一抗前在标本上加一种无关的蛋白质溶液，封闭荷电点不给一抗留有吸附余地，以保证一抗不会吸附到胶原纤维及结缔组织成分上。最常用的无关蛋白质溶液是所用二抗的同种动物非免疫血清。用产生二抗的同种动物血清，是为了避免二抗与预先加入的蛋白质结合引起假阳性染色。用来阻断非特异性结合的血清不能有任何溶血现象。红细胞破裂会使其中的过氧化酶与底物作用，产生非抗原特异性的阳性着色。多克隆抗体因其成分复杂，更易造成背景染色。稀释液采用含1%BASpH7.4的PBS,同时在洗液中加入0.05%的吐温20（Tween20）有助于消除背景染色。4、消除病理性色素的影响当所检动物由于出血等原因造成吞噬含铁血黄素细胞增多时，为防止其与DAB显色呈现的黄褐色发生混淆，最好选用AEC显色剂。组织固定时间过长时，切片中容易产生福尔马林色素颗粒，影响结果观察，取材时应充分用流水冲洗，以消除影响。5、切片制作不当引起的非特异性着色在严重变性、坏死及炎性病灶处，在胶原纤维和结缔组织部位，在切片裱贴不平、折皱处以及组织边缘部位常会出现非特异性着色。其中有的是因组织荷电状态改变而吸附抗体；有的机理不明；有的可能与组织边缘或皱折深部的槽形构型有关，解决的办法是在滴加一抗前，以二抗动物的正常血清（5%~10%）封闭、饱和电荷吸附位点和改善取材与制片技术。6、清洗不充分而造成的非特异性着色应严格操作规程。缓冲液中含一定量的盐，其有利于减低背景着色，通常使用0.05mlo/LPBS,溶液内加入吐温20,效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。另外，在清洗后至加入下一步试剂前，不能干片，干片的部位会出现非特异着色。7、DBA显色产生的某些背景颜色使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸镏水的pH值，以确保实验结果的正确性。粉剂DBA溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去。否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2.（二）免疫组化染色的假阴性及其对策通常可因标本抗原保存，试剂质量及染色操作等因素引起假阴性。1、组织处理不当固定不及时或固定时间过长常导致抗原丢失。浸蜡温度过高，时间过长将破坏抗原的抗原性。应改善技术条件，重新取材。2、抗原修复由于目前所进行的常规石蜡切片标本均用甲醛固定，所形成的醛健、羧甲键等封闭了部分抗原决定簇，或由于蛋白之间发交联而使抗原决定簇隐蔽，因此在染色时，有些抗原需要先进行抗原修复或暴露。至于哪种抗原需要进行修复，需在建立染色程序时经实验确定。抗原修复分为化学方法和物理/化学方法。（1）化学方法：主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等。需根据需要使用。（2）物理/化学方法：主要有以下几种①单纯加热方法：将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的容器中，加热至沸腾，并持续10~15分钟，此方法操作简单、经济，适用于所有实验室，但对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。②高压加热方法：将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的高压锅中，加热至喷气，并持续1~2分钟。③微波方法：将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，并持续10~15分钟，室温20~30分钟自然晾凉，使蛋白复性。此方法不仅利用热效应，且可通过微波的直接作用，打开蛋白之间的交联键，将已被封闭的抗原决定簇暴露和修复。3、一抗的选用、稀释度及孵育时间第一抗体是免疫组化染色中最重要的试剂。应用何种一抗，应根据具体目的和要求决定。临床病原诊断，要求较高的敏感性和较广的识别谱时，可选用多克隆抗体或几株混合的单克隆抗体，来避免抗体反应谱过窄造成的假阴性。某些研究工作需要检测单一抗原决定簇的存在，此时必须选用单克隆抗体。一抗的参考稀释度常由“方格滴定”和相关检测结果推测得出，但因实验条件不同，对抗原活性的影响不同，最佳稀释度仍需经过摸索。任何一个抗体，其工作稀释度取决于如下因素：（1）抗体的滴度即特异性抗体浓度；（2）抗体的纯度，即抗体中杂蛋白的浓度。杂蛋白较高时，需要较高的稀释度；（3）孵育的时间，时间越长，所用的抗体稀释倍数越高；（4）组织中抗原含量对抗体的应用浓度有不同的要求。在免疫反应中，过多的抗体将导致阴性结果，这种现象类似于凝集反应中的前带现象。因此需用“方格滴定”的方法找出适当的稀释度，并得到最大强度的抗原染色和最低的背景着色。一般认为，某一稀释度下特异性染色较强且无背景着色，是较理想的稀释度，加长孵育时间可有效地降低所用抗体的浓度，有利于提高染色质量，节省抗体，可用37℃0.5h或4℃过夜的方法。只要控制好温度、抗体稀释度和孵育时间，一般都能得到理想的染色效果。4、选择适宜的二抗二抗应用中常出现的总是是抗体本身与一抗不匹配，如抗兔的二抗，匹配鼠来源的一抗；或以抗鼠的二抗匹配兔来源的一抗，都会出现假阴性结果。5、试剂造成的影响酶的活性降低，缓冲液内加有叠氮钠抑制了酶活性，底物中所加H2O2量少或失效，操作中漏加了某种试剂等，都会造成假阴性结果。如阳性对照不成立，则需认真检查操作程序，查找可能的原因。

①选择合适的出发质粒出发质粒也叫亲本质粒，它应含有质粒克隆载体bi备的元件，如复制起始位点、选择标记基因、克隆位点、启动子和终止子等。②正确获得构建质粒克隆载体的元件一般采用限制性核酸内切酶切割出质粒DNA分子，获得含有某种元件的DNA片段，还可以采用PCR技术从靶DNA中扩增出含某种元件的特异性DNA片段。③组装合适的选择标记基因构建的质粒克隆载体应该组装什么样的选择标记基因，必须根据要转化的受体细胞的特性来决定。④选择合适的启动子为了构建表达质粒的克隆载体，必须组装合适的启动子，当设计真核生物的基因须在原核生物中表达式，常改用原核生物或病毒(噬菌体)基因的启动子，而原核生物基因在真核细胞中表达时，仍可用原核生物基因的启动子。

该实验主要有两个用途：1．重组质粒的鉴定。当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因，一旦重组成功，质粒环化（包括自身环化），抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抗相应抗生素的能力，可以含该抗生素的培养基中生长传代，不然，重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。2.为扩增质粒和其它载体作准备。由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20~30分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝，因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。（作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过的工程菌。）实验原理本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×106~2×107个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。实验准备一．器材天平、秤量匙、秤量皿加热磁力搅拌器、搅拌子可调移液器P1000、P200、P20及其经消毒的盒装蓝、黄吸头经消毒的1.5ml Eppendorf管、试管架及其水浴用试管架定时器、记号笔、一次性手套和筒纸42℃恒温水浴4℃和-70℃冰箱煤气灯或酒精灯恒温培养摇床（调至37℃，225rpm）37℃培养箱玻璃涂棒（普通玻璃吸管，细头部在煤气灯上烧成“L”形）消毒过的洁净培养皿（直径10cm）二．试剂LB培养基细菌培养用胰化蛋白胨10g细菌培养用酵母提取物5gNaCl 5g加800ml水，放入磁力搅拌棒，在磁力搅拌器上搅拌至彻底溶解，用5M NaOH（约0.2 ml）调节pH值至7.0，加水定容至1000 ml。高压15 lbf/in2（1.034×105pa）消毒30分钟，冷却后可加入氨苄青霉素（50mg/ml）500ul，视载体特性而定，混匀，即为含抗生素的LB培养液。存放于避光处。含有琼脂的培养基即在以上1000ml培养基中加入15g细菌培养用琼脂。抗生素琼脂平板待含有琼脂的培养基冷却后，加入抗生素，倾入培养皿，约30~50 ml，用煤气灯火焰掠过培养基表面，以消除气泡。冷却后，标记，封于塑料袋中，倒置，于4℃冰箱内避光保存。pH试纸（或pH计）三．实验材料来源于实验一的重组质粒受感态大肠杆菌碎冰及碎冰保温盛器实验步骤自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约15分钟，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。细菌50 ulDNA 5 ul轻轻混匀，静置冰上30分钟。于42℃水浴中热休克细菌45秒，迅速移入湿冰中，静置2分钟，加入900ul LB培养液，放入37℃恒温箱摇床，225rpm摇晃培养1小时。取50ul涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜。次日，检查各培养皿中是否出现菌落。实验结果转化成功，培养皿中可见散在的菌落。转化失败，培养皿上无菌落，或菌落布满如苔样，后者提示可能是抗生素浓度不够或失效。

目前中国药典、消毒技术规范中用于各种化学消毒剂、干热、环氧乙烷、高压蒸汽等灭菌效果的验证和评价的芽胞悬液的获得主要通过自制和商品化两种途径。一、自制芽胞悬液(1) 菌种处理：取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5～10ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18～24小时。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18～24小时。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，于37℃培养18～24小时，即为第3代培养物。(2) 转种固体培养基：用10.0ml吸管吸取5.0～10.0ml第3～5代的18～24小时营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面，再将多余肉汤培养物吸出，将罗氏瓶置于37℃温箱内，培养5～7天。(3) 观察芽胞形成：用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽胞染色法染色，并在显微镜(油镜)下进行镜检。当芽胞形成率达95％以上时，即可进行以下处理。否则，应继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽胞形成率后再进行以下处理。改良芽胞染色法：①用接种环取菌样涂布于玻片上，待自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。②将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的5.0％孔雀绿水溶液。将平皿盖好，放54℃～56℃条件下，加热30分钟。取出。去滤纸，用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。③加0.5％沙黄水溶液，染1分钟。水洗，待干后镜检。芽胞呈绿色，菌体呈红色。(4) 制成芽胞悬液：罗氏瓶培养物，用10.0ml吸管加10.0ml无菌蒸馏水于每一罗氏瓶中，以L棒轻轻推刮下菌苔。吸出第1批洗下的菌悬液，再向瓶内吸加5.0ml无菌蒸馏水，重复洗菌一遍。将第1和第2批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇5分钟，打碎菌块，使成均匀的芽胞悬液。（注意：必要时，将盛装菌悬液的三角烧瓶置45℃水浴中24小时，使菌自溶断链。分散成单个芽胞。）(5)纯化芽胞液：用无菌棉花或纱布过滤芽胞悬液，清除其中的琼脂凝块。将过滤后的芽胞悬液，置无菌离心管内，以3000转／分速度离心30分钟。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽胞重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，先后共3遍。将洗净的芽胞悬浮于三角烧瓶内蒸馏水中，并加入适量小玻璃珠。将芽胞液放于80℃水浴中10分钟(或60℃，30分钟)，以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，保存于4℃冰箱中备用。有效使用期为半年。(6)芽胞悬液在使用时，应用平板法先进行活菌培养计数。怀疑有杂菌污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。二、商品化芽胞悬液HKM™定量芽胞悬液（菌种名称：萎缩芽孢杆菌（曾用名：枯草芽孢杆菌黑色变种）ATCC9372）产品介绍：该芽胞悬液是根据国际通用标准菌株ATCC9372，参照国家药典、消毒技术规范、相关标准等，经严格质量控制制备而成。该菌株悬液含有一定数量的芽胞，用于自制生物指示剂应用于各种化学消毒剂、干热、环氧乙烷等灭菌效果的验证和评价，无菌冷灌装生产线的性能验证，染菌载体的制备以及生物安全柜灭菌效果的验证等。也可用于直接培养等。

微生物实验室如果从事致病菌检测、培养基质控验收、方法验证等相关工作，就应该备有质控菌株。实验室需对使用的质控菌株进行规范性管理，以便有效地、安全地使用，保证实验结果的准确性，今天远慕生物为大家总结了实验室质控菌株复苏保存过程中常见的问题。1. 菌株保存的是第三代，-80℃保存，再取出来活化的话属于第几代？答：保存的是第三代复活出来后，如果采用平板或肉汤活化相当于转接了一代，就是第四代了，如果还在瓷珠里的话就还是原来的代数。如果是保存在斜面上，这一支斜面一直就是第三代，如果转接到另一支斜面就是第四代了。传代原则，菌株活化复苏不论以任何形式繁殖了一次就算是传了一代。但如果仅是物理位置的转移没有繁殖就不是传代，需要注意。2. 菌株传代保存到瓷珠里一定要挑单菌落吗？答：不一定非挑单菌落，但是一定要挑相同特征的菌落，就是说从同一个菌落纯化出来的，以保证它们的特性完全一致。原则是尽量多挑，宁多勿少。3. 菌株冷冻保存是-70℃还是-80℃有具体标准规定么？答：其实是有标准的，《SN/T 2632-2010 微生物菌株常规保藏技术规程》是关于菌株保藏的一个标准，大家可以学习一下，各个保存方式都有介绍，但是瓷珠是比较新兴的保存方式暂时里面还没有收录。4. 怎样延长质控菌株的保存时间呢？答：大量的实验证明质控菌株在低温、干燥、缺氧、缺营养的条件下保存效果是最好的，越接近这种保存条件，菌株的保存时间越长。5. 怎样纯化质控菌株？答：纯化就是从TSA上或别的非选择性平板上转挑取单菌落划线再分离出单菌落，这就相当于纯化了。6. 我们只保存第一代菌株是不是要重新传代保存呢，认证老师会不会认为这是个错误？答：应该不会，认证老师不会提出这种问题的，不过最好是第一代菌株保存一些、第二代菌株保存一些，使用时工作菌株最好使用第三代菌株，第一代菌株可作为长期保存用。7. 为何要将第三代作为工作菌株？答：多传代几次后菌株的活力会明显提高，但最多传代到第五代后就不能用了，因为第五代后菌株虽然不会完全变异，但变异率会明显增加，因此选用第三代作为工作菌株是比较合适的，若使用第一、第二代菌株活力没有那么强。8. 质控菌株是不是传代超过五代就必须销毁处理？答：不一定。传代超过五代只是存在菌种变异可能，但如果传代到第六代、第七代……，经过形态、生化特性、DNA特征等验证，性状保持稳定，那么这些五代后的菌还是可以正常使用。9. 菌种编号意义？答：以金黄se葡萄球菌CMCC（B）26003为例CMCC为中国医学菌种保藏中心缩写，其它常见菌种保藏中心还包括ATCC（美国标准菌种收藏所）、CICC（工业微生物菌种保藏中心）、FSCC（食品安全菌种保藏中心）；B的意思是细菌，对应还有F（真菌）；26003为CMCC的保藏编号。10. 同样是金黄se葡萄球菌，ATCC6538与ATCC25923有什么不同？表明其来源不同，生化特性有也有所不同。比如ATCC6538溶血能力较ATCC25923要强。11. 使用磁珠保藏管保存质控菌株，加入菌液摇匀后为什么要吸干菌液？防止剩余菌液冷冻后形成冰晶损伤保存的菌株。12. TSA斜面一般多少度保存，可以放在冷藏里吗？2-8℃保存，放在冷藏是可以的；注意弧菌和绿脓杆菌要放到室温20-25℃保存，否则会很快死亡。13. 复苏冻干质控菌株是否可以采用液体培养基？答：可以，但建议使用平板培养基复苏冻干菌株。有助于分辨复苏出来菌株是否有污染，同时可初步观察菌落形态以鉴定菌株纯度。使用液体复苏的话只能观察到培养基混浊，无法确定是否有污染。14. 复苏冻干质控菌株是否可以采用显色培养基？答：不建议采用显色培养基复苏冻干菌株。冻干菌株复苏需要一个最适生长环境，复苏培养基不能选用选择性培养基或显色培养基，这些培养基里面含有抑菌成分不利于菌株复苏。15. 产气荚膜梭菌做冻存时是否需要保持厌氧状态？答：不需要，产气荚膜梭菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度要求并不太严格，按照一般菌株冻存方法进行冻存即可。

相对定量相对定量得到的结果为特定样本中目的基因相对于另一参照样本的量的变化。在某些不需要对基因进行绝对定量，只需要确定基因相对表达差异的情况下，如某样品在经过某种处理后目的基因表达量是增加了还是减少了，用相对定量的方法就可以得到结果，相对定量是一种更普遍、更简单的方法。内参基因实验操作中，由于选取样品时，其细胞个数不可能完全相同、RNA提取的得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研究中需要使用内参基因来标准化样品，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。相对定量就是通过检测目的基因相对于内参基因的表达变化来实现定量的。内参基因是在各种生理条件下表达量恒定的基因，这些基因也常被称为看家基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作内参照，常用的内参基因有GAPDH基因、β-Actin基因、18S rRNA基因等。内参基因需满足：在研究样本之间的表达是相似的；处理因素不会影响其表达；与待测基因同时进行相同的PCR扩增。尽管在大多数情况下内参基因的表达非常稳定，但是其表达在某些情况下也会发生变化，并不是任何内参基因都适合任何实验。在选择内参基因时，应仔细考虑各种因素，选择合适的内参基因或内参基因组合。基因表达变化倍数计算方法比较Ct法是运用数学公式来计算基因表达的相对变化量，用该方法进行基因表达定量时，来自于同一样品的目的基因和内参基因都要进行Real-Time qPCR反应，定量的结果由目的基因与内参基因Ct之间的差值来反应。该方法除了使用内参基因以外，还使用了参照样品，使得能够比较机体的不同组织或不同实验处理组之间的基因表达变化。使用该方法的前提条件是目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为1，但是内参基因毕竟与目的基因存在较大的异源性，所以在反应过程中会出现扩增效率不一致的问题。在Real-time qPCR实验开始之前必须分别对目的基因和内参基因绘制标准曲线，比较两者扩增效率的差别，假如两者扩增效率之间的差异小于0.1，就可以用该方法分析。扩增效率测定相对定量的标准曲线绘制方法与绝对定量基本相似，不同之处是绝对定量中只用构建目的基因的标准曲线，而且用于构建标准曲线的标准品的量是预先已知的，而相对定量中需要同时构建目的基因和内参基因两条标准曲线，并且相对定量中所用的标准品不需已知其准确的拷贝数或浓度。该方法的第一步是制备标准品，通常选择提取得到的浓度较高的待测样品RNA即可，将其反转为cDNA后，进行连续的5倍或10倍梯度稀释，得到5～6个用于绘制标准曲线的梯度稀释样品。第二步就是分别用梯度稀释标准品绘制目的基因和内参基因的标准曲线，然后根据标准曲线计算目的基因和内参基因的扩增效率。参照样品的选择根据不同的实验类型，具有以下3种情况：某处理方法对基因表达的影响，将未处理的样本作为参照样本；检测基因在不同时间的表达差异，将0时刻的样本作为参照样本；比较基因在不同组织中的表达差异，人为选定一个组织作为参照样本。

　　在理论研究中，营养缺陷型不仅被广泛应用于阐明微生物代谢途径上，而且在遗传学的研究中具有特殊的地位。在转化、转导、原生质体融合、质粒和转座因子等遗传学研究中，营养缺陷型是常用的标菌种。此外，营养缺陷型菌株还是研究基因的结构与功能常用的材料。　　在生产实践中，营养缺陷型可以用来切断代谢途径，以积累中间代谢产物；也可以阻断某一分支代谢途径，从而积累具有共同前体的另一分支代谢产物；营养缺陷型还能解除代谢的反馈调节机制，以积累合成代谢中某一末端产物或者中间产物；也可将营养缺陷型菌株作为生产菌株杂交、重组育种的遗传标记。营养缺陷型菌株广泛应用于核苷酸及氨基酸等产品的生产。　　1、阻断代谢途径，积累中间代谢产物。　　2、阻断分支代谢，改变代谢方向，积累另一终端代谢产物。　　3、解除反馈抑制，积累代谢产物。　　4、利用渗漏缺陷型进行代谢调控育种。

细胞培养技术已经成为当今生命科学各领域的基础技术和基本技能，它也是细胞工程、基因工程和生物医学工程的重要研究手段。那我们在实际的动物细胞培养实验中需要注意哪些基本要求呢？1、实验前准备实验前必须分门别类地制订操作卡片，如清洗卡、消毒卡、细胞常用液（细胞培养液、BSS液、消化液）配制卡、牛血清检测分装卡、细胞原代和传代操作卡等。各卡片上注明实验所需器材的名称、规格、数量、操作要领和实验注意事项等。实验前应按卡片收集、清点所需用品，一并放入超净台内，这样可避免操作时因物品不全而往返拿取所浩成的污染。同时，根据每个实验的要求，准备好瓶管支架器械消毒盒等。实验器材准数要大于实验使用数，瓶盖数要大于瓶数。这样才能有条不紊地做实验，也减少了忙乱操作所引起的污染。2、无菌室和操作室消毒无菌室内每周用乳酸蒸气（或过氧乙酸）加紫外线消毒1~2次。实验前，将实验器材放入超净台内，打开超净台紫外线灯，同时启动超净台风机，40 min后消毒完毕，关闭紫外线灯。这样，超净台内空气被净化，超净台面构成相对无菌的环境。3、无菌操作要求①手指不能触及器材使用端。如触及，器材需更换或烧灼后再使用（如瓶口）。②减少手与器材的接触面，学会手指操作。③一切操作，如打开或封闭瓶口，安装吸管、注射器等，都要在火焰前方进行。瓶口、吸管、注射器使用前要经过火焰消毒后使用。④瓶口顺风斜放在支架上。试剂用后立即封闭瓶口。瓶口长时间敞开会增加落菌的机会。⑤不同的细胞同时操作时，要专管专用，并要勤换吸管，防止扩大污染和交叉污染。⑥瓶口液滴不能倒回瓶内。液滴用干酒精棉球擦拭，瓶口再经火焰消毒。⑦操作者动作要准确敏捷，尽量避免空气流动。4、实验中操作要求洗手、着装与外科临床要求相同。双手用肥皂洗净后浸泡于消毒液中，并用75%的酒精擦拭。细胞培养用液从冰箱取出，试剂瓶口和外壁经洒精外布擦洗后人超净台，超净台面要用酒精纱布擦拭。超净台上的物品面布局合理，污染废液缸、酒精棉球缸在右侧位，酒精灯在中央位，试剂瓶在左侧位。拆除大包装，点燃洒精灯（95%洒精）、火焰无色或微黄色表示酒精杂质少，酒精燃烧wan全（不能使用废酒精或工业酒精，这类酒精燃烧时产生的化学物质易附着到吸管或其他瓶、皿上，带入培养液中会伤害细胞）。浸泡75%酒精中的金属器械用台面消毒镊子取出，经无菌干纱布擦拭后，迅速通过火焰（器械不能在火焰中灼烧过长时间），冷却后使用，避免烫伤细胞。细胞培养液、牛血清、酶液的吸管，使用后不能再用火焰消毒，因为吸管中残留的培养液被烧焦碳化，再使用时，会把有害碳化物带入培养液中毒害细胞。操作中手指被污染时，可用酒精纱布或棉球擦拭。在实验过程中，不要面向操作台讲话或咳嗽，避免将唾沫中微生物带入超净台内，污染空气。实验者离开超净台时，立即用肘关节关闭侧窗口，避免无菌室内细菌随空气流入净化操作区。5、实验后要求实验完毕，关闭超净台风机和电源，未使用过的器材放入饭盒内，用过的玻璃器材投入清水中浸泡，包装纸叠卷，绳成束分类归人，最后，超净台面用酒精纱布或棉球擦拭，紫外线消毒。6、注意事项无菌操作离不开火和酒精，操作中避免事故发生。要用打火机点火。火柴点火时，火星熄灭后投入废缸内（缸内有废酒精棉球）。酒精溅出台面或瓶外壁时，立即擦干；一旦发生着火事故，立即关闭超净台风机，用饭盒、湿布扑灭火焰。

实验概要可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。基本类型有单向扩散和双向扩散两种。本文介绍了单向和双向两种琼脂扩散试验的操作流程。单向琼脂扩散试验主要用于检查血清中各种免疫球蛋白和补体成份的含量；双向琼脂扩散试验可用来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体的效价。实验原理1. 单向琼脂扩散试验是一种定量试验，将抗体混合于琼脂内，倾注于玻片或平皿上，凝固后在琼脂上打孔，再将抗原标本加入孔内，经过一定的时间，在孔的周围出现抗原抗体复合物形成的沉淀环，环的大小与抗原含量和扩散时间相关。用不同浓度的抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量即可从准标曲线中求出。2. 抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。实验步骤1. 单向琼脂扩散试验(Single immunodiffusion test)-人血清中IgG、IgA、IgM的测定1) 材料IgG、IgA、IgM免疫板、参考血清、待检血清、微量加样器(10微升)、量尺、纱布、生理盐水、带盖方盘。2) 方法a. 免疫琼脂板制备：将1.5%琼脂(用PH8.2、0.05M的巴bi妥缓冲液配成)，加热溶化，待琼脂冷至56℃加入适量抗血清(抗血清最终稀释度取决于抗血清所标化的稀释度)，混匀，制成厚1.5mm的琼脂板，待琼脂凝固后打孔，孔径为3mm，孔距1～1.2cm。b. 稀释参考血清及待检血清：参考血清用0.5ml蒸馏水溶解后使用，参考血清、待检血清稀释按要求进行。c. 加样：将上述稀释参考血清分别滴入相应的抗体免疫板的一排孔内，其余孔滴加待检的稀释血清，每个检样加两个孔，每孔滴加10微升。d. 扩散：将免疫板置水平湿盘内，放进37℃温箱，IgG免疫板扩散24小时，IgA、IgM板48小时后取出置黑色背景前观察结果，(如果沉淀环不清晰，也可用1%鞣酸液浸泡免疫板半小时后观察)，必要时可以染色后观察。e. 绘制标准曲线及血清标本中IgG、IgA、IgM定量测定：测量沉淀环直径。沉淀环直径的大小除与抗原量相关，还与分子量和扩散时间有关。这种沉淀环直径与抗原含量的关系不是直线相关，而是对数关系，这种关系有两种计算方法：Mancini曲线－适用于大分子抗原和长时间扩散(＞48小时)的结果处理。使用方格计算纸划线，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。公式表示：C／d2 ＝K(C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数)。Fehey曲线－适用于小分子抗原和较短时间(24小时)扩散的结果处理。使用半对数纸划线，浓度的对数与沉淀环之间呈线性关系。公式表示：logC／d＝K(C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数)。2. 双向琼脂扩散试验(Double immunodiffusion test)1) 材料羊抗人全血清，小牛血清，正常人混合血清，精制琼脂粉，生理盐水、载玻片，打孔器(直径3mm)、湿盒、吸管等。2) 方法a. 用生理盐水配制1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5ml趁热浇于载玻片上，制成琼脂板。b. 待琼脂凝固后，按右图用打孔器打孔，并用针头挑去孔中琼脂(孔距为5mm)。c. 在①孔中加正常人混合血清，在②孔中加小牛血清，③孔中加羊抗人全血清，注意不要溢出。d. 将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱内放置24小时后观察结果。

PCR产物的检测方法：琼脂糖凝胶电泳这是实验室最常用的方法，简便易行，只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%—2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖，这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。（1）制胶琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入100ml 0.5×TBE液，微波炉加热2-5min，使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室温等温度下降至60℃时，加入终浓度0.5μg/ml的EB液，充分混匀后倒板（注意排除气体）。（2）加样和电泳上样时一般取PCR反应液5~10μl，加入3μl溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为0.5×TBE液，接通电源，使样品由负极向正极移动。60-100V恒压电泳约30-60分钟。（3）检测将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测，DNA产物与荧光染料EB形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现，并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐，但在引物纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨DNA片段的有效范围：(1)制胶在两块制胶玻璃板中间放上垫片，放上制胶架，拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板。制备适量合适浓度的凝胶，使之略多于胶板。不同浓度（%）聚丙酰胺凝胶的制法：在加入TEMED和10%过硫酸铵后，立即混匀，倒入放置45℃角的玻璃板内，完全注满（注意不要有气泡），迅速将玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔顶并夹紧，待30-60分钟胶聚合后，取下胶板，放入电泳槽中固定。（2）加样和电泳上下槽中加入1×TBE电泳缓冲液，溢过加样孔，拔出梳子，排出加样孔中的气泡，将PCR产物或限制性内切酶消化产物2与1上样缓冲液混匀，用微量注射器加入加样孔底部，使样品在孔底成一层，两侧孔中加入标准分子量的DNA Marker。以2-10V/cm电压电泳，电泳时间足够长，使片断足以分开，待指示剂走到适宜位置时关闭电源，将胶片取出。（3）银染分开两块玻璃板，将凝胶片放入100ml银染固定液中振荡15min，双蒸水洗3次，每次2min，然后将凝胶片转入100ml 0.2%的AgNO3中于摇床上染色约10min，吸去AgNO3液，用双蒸水洗3次，每次30s，加入100ml显色液约7-10min，待DNA带显示清除时，吸去显色液，加入固定液Na2CO3，静置2-3min，取出凝胶观察。

血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：⑴将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。⑵加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。⑶加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。⑷加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。⑸加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

　　标准品一词常作为泛称。在色谱分析工作中，我们进行样品理化分析时常用的标准品大多属于“化合物纯度/浓度标准品”。此时，“标准品”这一称呼涵盖了非医药行业常说的“标准物质”、“标准样品”以及医药行业常说的“中药对照品”、“化学对照品”等。　　“标准品”一词作为特指时，专指药典体系标准物质中的“标准品”。《中国药典》四部0291国家药品标准物质通则中有明确定义，此部分内容目前在2020版药典中未作修订。　　常见容器包括不同规格的玻璃安瓿瓶与带盖玻璃瓶。　　通常情况下，固体、半固体纯品通常使用带盖玻璃瓶装，也有使用安瓿瓶装的情况，比如中检院的国家药品标准物质。　　液体纯品或标液型产品常使用安瓿瓶装，易挥发物质也有使用毛细管瓶装的情况。根据是否需要避光保存，容器有无色透明的材质与棕色半透明材质。　　如何取用标准品：　　1.稀释标液或者称量纯品前，要提前将标准品放在操作环境，确保产品回复至室温，操作前保证瓶身清洁干燥（可用吸水纸擦去表面水滴）。　　2.称量纯品时选择合适的天平，通常小数点后4位或5位，根据需要称量的质量决定。　　3.称量纯品前，提前打开天平预热，调节水平（将天平上的小气泡赶至正中央）。　　4.称量纯品的方式有增量法与减量法，常用增量法。　　5.减量法适用于小规格纯品型产品（比如5mg及以下规格）完全溶解直接配制母液；或者某支纯品已经取用过几次、不清楚剩余含量打算全部溶解的情况。

一、专属鉴别试验药物的专属鉴别试验是证实某一种药物的依据,它是根据每一种药物化学结构上的差异所引起的物理化学特性,选用某些特te有的灵敏度高的反应来鉴别药物的真伪。如巴bi妥类药物含有丙二酰脲的相同母核,可根据其母核上取代基不同,而具有不同的理化性质来鉴别不同的丙二酰脲类药物:苯巴bi妥其母核上连接的基团为苯基,利用其苯基硝化和缩合反应进行专属鉴别试验的确证鉴别;司可巴bi妥母核上连有不饱和烃键,利用加成特性和还原特性进行专属鉴别的确证鉴别。一般鉴别试验与专属鉴别试验的不同点在于,一般鉴别试验是以某些药物的共同化学结构为依据,根据相同的物理化学性质进行药物真伪的鉴别,以区别不同类别的药物。而专属鉴别试验则是在一般鉴别试验的基础上,利用各种药物的化学结构差异来鉴别药物的,以区别同类药物或区别具有相同化学结构中的某一个药物,达到最终确证药物真伪的目的。二、化学鉴别法化学鉴别法是根据药物与化学试剂在一定条件下发生化学反应所产生的颜色、沉淀气体、荧光等现象,鉴别药物真伪的方法,供试品按质量标准中的鉴别项目的要求进行鉴别试验,若试验现象相同,则认定为同一种药物。化学鉴别法对无机药物主要是利用其阴阳离子的性质进行鉴别:对有机药物主要是利用其官能团或整个分子结构表现的性质进行鉴别。化学鉴别法是药物分析中最chang用的鉴别方法。其主要包括以下内容。1.显色反应鉴别法即向供试品溶液中加入适当试剂,在一定条件下发生化学反应,生成易于观测的有色产物。常见的反应类型如下。(1)茚三酮呈色反应——多为含脂肪氨基结构的药物;(2)异羟肟酸铁反应——多为含芳酸及其酯类和酰胺类结构的药物;(3)三氯化铁呈色反应——多为含酚羟基或水解后产生酚羟基的药物;(4)重氮化偶合呈色反应一—多为芳伯氨基或能产生芳伯氨基结构的药物;(5)氧化还原呈色反应或其他颜色反应。2.沉淀反应鉴别法供试品溶液中加入适当试剂,在一定条件下发生化学反应,生成不同颜色的沉淀物,有的具有特殊的沉淀形状。常见的反应类型如下。(1)与硫氰化铬胺(雷氏盐)的沉淀反应——多为生物碱及其盐类药物和具有芳香环的有机碱及其盐类药物。(2)与重金属离子的沉淀反应——在一定条件下药物和重金属离子反应,生成沉淀物。(3)其他沉淀反应。3.气体生成反应鉴别法供试品溶液中加入适当试剂,在一定条件下发生化学反应,生成气体。常见的反应类型如下。(1)产生氨气,利用其特殊的气味鉴别——多为胺(铵)类药物、酰胺类药物经强碱处理后,加热,产生氨气。(2)产生硫化氢气体,利用其特殊的气味鉴别——多为化学结构中含硫的药物,经强碱处理后,加热,产生硫化氢气体。(3)含碘有机药物,直火加热后,可产生紫色碘蒸气。(4)含醋酸酯和乙酰胺类药物,经硫酸水解后可产生醋酸乙酯的香味。4.荧光反应鉴别法常见的荧光发射形式有以下几种类型。(1)药物本身在可见光下发射荧光。(2)药物溶液加硫酸呈酸性后,在可见光下发射荧光。(3)药物和溴反应后,在可见光下发射荧光。(4)药物和间苯2酚反应后以及经其他反应后,发射荧光。

为了减少由于保存不当造成的化学试剂的损失。客户应该清楚的了解一些不稳定的化学试剂如何保存?实验室中不稳定的化学试剂应该怎么保存?化学试剂存放要依据物质自身的物理性质和化学性质，降低或杜绝物质变性、自然损耗。实验室中有很多不稳定的化学试剂。有的易挥发、有的易燃易爆、有的试剂在保存的时候需要密封保存。常用不稳定试剂的分类及要求(1)与水蒸气，水发生反应的物质要密封，并远离水源保存。如电石(CaC2),生石灰(CaO)，浓硫酸，无水硫酸铜()，各种干燥剂(硅胶，碱石灰，P2O5，CaCl2等)，K, Na, Mg, Na2O2, 更要同时具备所有要求。(2)易与氧气作用的试剂，如亚硫酸盐，苯酚，亚铁盐，碘化物，硫化物等应将其固体或晶体密封包村，不宜长期存放其水溶液;亚硫酸，氢硫酸溶液要密封存放;钾，钠，白磷更要采用液封形式。(3)易挥发、低燃点的试剂要密封，放于阴凉、通风、远离火源处保存。(4)与二氧化碳反应的物质要密封包村。如碱类，NaOH,Ca(OH)2,Ba(OH)2,等;如弱酸盐类，水玻璃，偏铝酸钠，苯酚钠，Na2O,Na2O2等。由于其相应的溶液较固体更易反应，所以更要注意密封保存。(5)易挥发或自身分解的试剂要密封，放于阴凉通风处保存。如浓硝酸，浓盐酸，浓氨水，AgNO3，液溴(水封)等。

无机分析试剂无机分析试剂（Inorganic analytical reagent）是用于化学分析的常用的无机化学物品。其纯度比工业品高，杂质少。有机分析试剂试剂有机分析试剂（Organic reagents for inorganic analysis）是在无机物分析中供元素的测定、分离、富集用的沉淀剂、萃取剂、螯合剂以及指示剂等专用的有机化合物，而不是指一般的溶剂、有机酸和有 机碱等。这些有机试剂必须要具有较好的灵敏度和选择性。随着分析化学和化学工业的发展，将会研制出灵敏度和选择性更好的这类试剂，如1967年以来出现的 对一些金属（如碱金属、碱土金属）及铵离子具有络合能力的冠醚（Crown ether）类化合物就是这样。基准试剂基准试剂（Primary standards）是纯度高、杂质少、稳定性好、化学组分恒定的化合物。在基准试剂中有容量分析、pH测定、热值测定等等分类。每一分类中均有第一基准 和工作基准之分。凡第一基准都必须由国家计量科学院检定，生产单位则利用第一基准作为工作基准产品的测定标准。商业经营的基准试剂主要是指容量分析 类中的容量分析工作基准[含量范围为99.96%~100.05%（重量滴定）]。一般用于标定滴定液。标准物质标准物质（Standard substance）是用于化学分析、仪器分析中作对比的化学物品，或是用于校准仪器的化学品。其化学组分、含量、理化性质及所含杂质必须已知，并符合规 定或得gong认。微量分析试剂微量分析试剂（Micro-analytical reagent）适用于被测定物质的许可量仅为常量百分之一（重量约为1~15毫克，体积约为0.01~2毫升）的微量分析用的试剂。分析标准品有机分析标准品有机分析标准品（Organic analytical standards）是测定有机化合物的组分和结构时用作对比的化学试剂。其组分必须精确已知。也可用于微量分析。农药分析标准品农药分析标准品（Pesticide analytical standards）适用于气相色谱法分析农药或测定农药残留量时作对比物品。其含量要求精确。有由微量单一农药配制的溶液，也有多种农药配制的混合溶液。原子吸收光谱标准品原子吸收光谱标准品（Atomic absorption spectroscopy standards）是在利用原子吸收光谱法进行试样分析时作为标准用的试剂。折光率液折光率液（Refractive index liquid）为已知其折光率的高纯度的稳定液体，用以测定晶体物质和矿物的折光率。在每个包装的外面都标明了其折光率。当量溶液当量溶液（Normal solution）为一升溶液中含有一克当量溶质的水溶液，即指浓度是1N的溶液。 指示剂 指示剂（Indicator）是能由某些物质存在的影响而改变自己颜色的物质。主要用于容量分析中指示滴定的终点。一般可分为酸碱指示剂、氧化还原指示 剂、吸附指示剂等。指示剂除分析外，也可用来检验气体或溶液中某些有害有毒物质的存在。仪器分析试剂仪器分析试剂（Instrumental analytical reagents）是利用根据物理、化学或物理化学原理设计的特殊仪器进行试样分析的过程中所用的试剂。色谱用色谱用（For chromatography）试剂是指用于气相色谱、液相色谱、气液色谱、薄层色谱、柱色谱等分析法中的试剂和材料，有固定液、担体、溶剂等。电子显微镜用电子显微镜用（For electron microscopy）试剂是在生物学、医学等领域利用电子显微镜进行研究工作时所用的固定剂、包埋剂、染色剂等的试剂，极谱用极谱用（For polarography）试剂是指在用极谱法作定量分析和定性分析时所需要的试剂。光谱纯光谱纯（Spectrography）试剂通常是指经发射光谱法分析过的、纯度较高的试剂。分光纯分光纯（Spectrophotometric pure）试剂是指使用分光光度分析法时所用的溶液，有一定的波长透过率，用于定性分析和定量分析。生化试剂生化试剂（Biochemical reagent）是指有关生命科学研究的生物材料或有机化合物，以及临床诊断、医学研究用的试剂。由于生命科学面广、发展快，因此该类试剂品种繁多、性质复杂。其他国标试剂国标试剂：该类试剂为我国国家标准所规定，适用于检验、鉴定、检测试剂级（RG，红标签）：作为试剂的标准化学品。教学试剂：可以满足学生教学目的，不至于造成化学反应现象偏差的一类试剂。zhi定级 （ZD），该类试剂是按照用户要求的质量控制指标，为特定用户订做的化学试剂。高纯试剂（EP）：包括超纯、特纯、高纯、光谱纯，配制标准溶液。 此类试剂质量注重的是：在特定方法分析过程中可能引起分析结果偏差，对成分分析或含量分析干扰的杂质含量，但对主含量不做很高要求。指示剂（ID）：配制指示溶液用。 质量指标为变色范围和变色敏感程度。可替代CP,也适用于有机合成用。生化试剂（BR）：配制生物化学检验试液 和生化合成。质量指标注重生物活性杂质。可替代指示剂，可用于有机合成生物染色剂（BS）：配制微生物标本染色液。 质量指标注重生物活性杂质。可替代指示剂，可用于有机合成电子纯（MOS）：适用于电子产品生产中，电性杂质含量极低 电镀级:适用于电镀工业生产的，对电镀有害的杂质较少，纯度大致高于工业级 ，略低于化学纯。 当量试剂（3N、4N、5N）：主成分含量分别为99.9%、99.99%、99.999%以上。电泳试剂：质量指标注重电性杂质含量控制。此外，还有特种试剂，生产量极小，几乎是按需定产，此类试剂其数量和质量一般为用户所zhi定。 合成试剂：所谓合成试剂：就是在标明成分主含量的前提下，严格给出该产品的有关各种物理常数的一类化学试剂。

目的 认识酵母菌 的形态特征，了解培养酵母菌的方法。实验前的思考 人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学会酿酒。约在6000年前，就发明发面的方法。直到十九世纪有了显微镜 ，人们才窥探到醉母菌的真面目。对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌的。材料器具 甜酒酿汁液，新鲜酵母 ，豆芽;显微镜，载玻片，盖玻皮，玻璃棒，镊子，滴管，吸水纸，酒精灯，石棉网，火柴，漏斗架，玻璃斗，量杯，三角烧瓶，烧杯，天平，量筒，棉絮;蔗糖，乳酸，碘液。步骤1.观察酵母菌(1)用滴管从甜酒酿的汁液中吸取一滴汁液，滴在载玻片上，用针摊开，盖上盖玻片，在低倍镜下就能清楚地看到甜酒酿的汁液中悬浮着无数酵母菌。再换高倍镜仔细观察一个酵母菌，可以看到酵母菌是椭圆形的单个细胞，细胞中有许多小颗粒，也有几个大的液泡(图示)。有的酵母菌的一端长出大小不同的突起，这是酵母菌的芽体。芽体成长脱落，就成为新的个体，有的芽体在从母体脱落前又长出突起。这种繁殖方法叫出芽繁殖。(2)在盖玻片一边加一滴碘液，从另一边用吸水纸把染液引入盖玻片下。不久就能看到被染成棕褐色的细胞核和变成蓝紫色的淀粉粒。2.培养酵母菌(1)用蔗糖液培养 在盛有100毫升的三角烧瓶里加5克蔗糖，煮沸。等到溶液稍稍冷却，加一小块鲜酵母，用玻璃棒搅拌均匀;再用棉絮塞紧瓶口。然后把烧瓶放在 25～30℃的温暖地方，数小时后就可见到溶液里有气泡产生，并散发出酒味。这是因为酵母菌正在把糖分解成乙醇和二氧化碳。(2)二三天后吸取溶液在显微镜下观察，就可看到已培养出大量酵母菌。注意事项1.观察酵母菌时，视野里杂质较多，有淀粉粒、半分解的淀粉团块、曲霉孢子和其他杂菌等等，只要掌握住酵母菌的形状和体内具有液泡，尤其是染色后体内具有褐色的核和蓝色的淀粉粒这些特点，就可以跟其他杂菌区分开来。2.发酵在缺氧的环境里仍能良好地进行，不必为了增加氧气去搅拌已放入菌种的培养液。分析和讨论酵母菌是少数能在缺氧环境里生存较长时间的一种微生物，它属于兼性菌类。在一般情况下进行有氧呼吸。如环境中有丰富的糖类，它进行缺氧呼吸。其过程如下：1.C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O+2.87×103兆焦(有氧呼吸)2.C6H12O6→2CO2+2C2H5OH+109×103兆焦(缺氧呼吸)建议 培养酵母菌还可以采用下列两种方法。1.用乳酸、豆芽汁和蔗糖液培养(1)取10克豆芽放入100毫升水中，加热煮沸半小时，盛起，用细布过滤。在滤液里加5克蔗糖和5毫升乳酸，配成液体培养液。(2)把鲜酵母半块或老面(发酵后晾干的面粉团)打碎，投入培养液中，放在黑暗温暖的地方，二三天后就可以培养出大量酵母菌。2.用巴斯德培养液培养酵母菌需要的无机营养来自外界环境。如果在培养液内适当增加氮、磷等元素，效果会更好。巴斯德培养液的配方如下：蔗糖15克，碳酸铵1克，磷酸氢钾0.2克，磷酸钙0.02克，硫酸镁0.02克，蒸馏水100毫升，培养方法跟上述的相同。

要做好一张血涂片，我们应该把它的原理，各种要求和影响因素熟记于心，还要加上适当的练习。血涂片的制作一、原理：将一小滴血液均匀涂在玻片上，呈单层分布，制成薄血片。用瑞氏染液进行染色。二、载波片的要求：制备血涂片使用的载玻片要有很好的清洁度。新的载玻片常有游离碱质，应用清洗液或10% 盐酸浸泡24小时，然后再彻底清洗。用过的载玻片可放入适量肥皂水或洗涤剂的水中煮沸20分钟，再用热水将肥皂和血膜洗去，用自来水反复冲洗，然后擦干备用。三、操作：1、用毛细吸管吸取EDTA抗凝的外周血5-7UL，或者直接采集患者末梢血，将血滴滴至载玻片的一端约1CM处或整片的3/4端。有磨砂片的玻片，可在接近磨砂头的部位来水反复冲洗，然后擦干备用。2、左手持载玻片，右手持玻片，将推片接近血滴处，然后轻轻接触血滴并压在血滴上，使血液呈“￣”字型展开，充满推片宽度。3、将推片与载玻片形成30度夹角，用均匀的速度将血向载玻片的另一端推动。红细胞压积发生变化时，应适当的调整推片与载玻片的角度以及推动血液是的速度。标准的血涂片应做到头、体、尾分明，两边和两端留有空隙。四、方法学评价:良好的血涂片是染色后血液形态学检查的前提。薄血膜推片法用血量少、操作简单，是应用最广泛的方法。某些抗凝剂可使血细胞形态发生变化，分类时应注意鉴别。根据不同的需要（如疟原虫）可采用厚血涂片法，阳性检出率高。血涂片染色1.瑞氏-吉姆萨混合染色能集合瑞氏染色与吉姆萨染色的优点。2.染色方法：标记血涂片，将血涂片平放在染色架上，滴加A液覆盖整个血膜，30秒-1分钟后，滴加B液，将A、B液混匀，可用洗耳球轻吹液面，A、B液的比例为1:2，静置水平位置染色5-10分钟后，将载玻片拿起，轻轻晃动，使染料不再附着于血膜上。把水流调至最小，平持载玻片，与水流方向呈90度，在血膜头部冲入，向血膜的尾端调整玻片的角度，直至染料冲干净，冲洗干净后的血涂片，放置在血片架上将水自然控干，或倾斜玻片等待自然干燥。3.判断染色结果：在正常情况下，良好的染色结果为血膜外观为淡紫红色；低倍镜下，细胞分布均匀；细胞呈粉红色，少见染色颗粒，白细胞胞质能显示各类细胞的特有色彩，白细胞核染成紫红色。

一、实验步骤：（1）样品制备：对于贴壁生长细胞，胰酶消化，调整细胞浓度约1×105/ml，滴加于盖玻片上(置于6孔板中)，培养相应时间后，取出细胞爬片，用PBS 洗涤3次。（2）样品固定：95%乙醇固定20min，PBS洗涤2次，每次1min。（3）染核：苏木素染液染色2-3min，自来水洗涤。（4）分色：镜下观察，若细胞核染色过深，用1%盐酸酒精溶液分色数秒，自来水洗涤。（5）染胞质：浸入伊红染液染色1min，自来水洗涤。（6）吹干或自然晾干细胞 爬片后，中性树胶封片。若细胞用4%多聚甲醛固定，则染色时间相应延长，苏木素染色12-15min，伊红5min即可。二、注意事项：1、染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。2、切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚（晰）而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。3、切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。4、在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。5、切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。6、最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。

分光光度计是一种分析测量光谱的仪器，因为应用需求的不同，分光光度计有着不同的种类。分光光度计按照波长及应用领域的不同可以分为：(1)可见光分光光度计(2)紫外分光光度计(3)红外分光光度计(4)荧光分光光度计(5)原子吸收分光光度计现今生命科学领域比较流行的超微量分光光度计是属于紫外分光光度计的一种。(1)可见分光光度计用来测量待测物质对可见光(400～760nm)的吸光度并进行定量分析的仪器，称为可见分光光度计。可在600nm测定细菌细胞密度。(2)紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计用来测量待测物质对可见光或紫外光(200～760nm)的吸光度并进行定量分析的仪器。可以测定核酸和蛋白的浓度，也可以测定细菌细胞密度。紫外分光光度计又可分为单光束,假双光束,双光束。它们的用途又有区别。a) 单光束：适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。b) 双光束：自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。c) 假双光束也就是比例双光束，它的原理是由同一单色器发出的光被分成两束，一束直接到达检测器，另一束通过样品后到达另一个检测器。这种仪器的优点是可以监测光源变化带来的误差，但是并不能消除参比造成的影响。(3)红外分光光度计一般的红外光谱是指大于760nm的红外光谱，这是研究有机化合物最常用的光谱区域，能分析各种状态(气、液、固)的试样。红外光谱法的特点是：快速、样品量少(几微克-几毫克)，特征性强(各种物质有其特定的红外光谱图)、能分析各种状态(气、液、固)的试样以及不破坏样品。(4)荧光分光光度计荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。应用于科研、化工、医药、生化、环保以及临床检验、食品检验、教学实验等领域。通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化,从而阐明分子结构与功能之间的关系。(5)原子吸收分光光度计该法主要适用样品中微量及痕量组分分析常规仪器之一。是材料分析及质量控制部门进行常量、微量金属(半金属)元素分析的有力工具。以上几种常见的分光光度计种类区别便是本文为大家介绍的内容，希望大家能够在了解之后更好的运用分光光度计。

　　用于标记抗体或抗抗体的酶须具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产。当前应用较多的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP应用最广。　　过氧化物酶　　过氧化物酶广泛分布于植物中，辣根中含量最高，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm。　　酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275　　纯酶的RZ多在3.0以上，最高为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占 75%，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：（1）邻苯二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓H2SO4终止反应，颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用的一种；（2）联大茴香胺（OD）,产物为橘黄色，最大吸收值在400nm，颜色较稳定；（3）5－氨基水杨酸（5－AS）：产物为深棕色，最大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；（4）邻联甲苯胺（OT）产物为蓝色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，但反应快，颜色明显。　　碱性磷酸酶　　系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，廉价无毒性。酶解产物呈黄色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中，37℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。

菌种保藏的方法很多，但原理大同小异。首先要挑选优良纯种。利用微生物的孢子、芽孢及营养体；其次，根据其生理、生化性，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的形状，防止变异。不管采用哪种保藏方法，在菌种保存过程中要求不死亡、不污染杂菌和不退化。短期：斜面保藏斜面保藏是目前最普遍的短期保藏法，操作简单，使用方便，但需定期接种。因此工作量较大，而且传代次数多易发生变异，因此，仅适用于短期经常使用的菌种。1. 配制培养基，营养成分浓度稍低为宜，特别是糖类尽可能降低，产酸菌种，则应添加少量碳酸钙；2. 斜面装液量，斜面以倾斜后不超过试管长度 1/2 为宜；3. 斜面培养，温度较最适稍低，时间较最适略长；4. 生长完成后，密封置于 2~8℃的冰箱中保藏。每传代一次，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌可保存 1~3 个月，酵母菌 2 个月，细菌1个月。活化使用：将斜面从冰箱中取出，细菌挑取菌落增菌，或霉菌切块传代培养，培养好即可使用。长期：冷冻保藏冷冻保藏是目前使用较为广泛的长期保藏法之一，适用于所各类微生物，较之于斜面保藏，减少了工作量，延长了保藏时间。1. 准备斜面或平板新鲜培养物一个，10%的无菌甘油溶液；2. 用甘油溶液将菌体或孢子洗脱下来，形成菌悬液；3. 菌悬液分装，冻存管装液 1mL/支，后置于程序降温盒；4. 将程序降温盒置于-80℃冰箱冻存；5. 可保藏 1-2 年。活化使用：1. 将冻存菌株置于冻存盒中取出，准备水浴溶解，切勿常温融化；2. 将菌株迅速置于水浴速溶，细菌 40℃，真菌 30℃，约 2min 全部溶解后接种到适宜培养基；3. 采用适宜条件培养完成即可。

微生物实验步骤繁多，在样品多的情况下很容易出错。跟着远慕生物一起来看看，如何避免犯同款错误！使用过期或吸潮试剂试剂过期和吸潮会影响微生物的生长繁殖，吸潮的试剂称重不准确。要根据试剂的特性放置于相应的环境进行保存；做实验前要注意试剂是否在保质期内，查看开瓶日期及瓶口密封性，确认试剂是否变质和吸潮。器皿清洗不彻底实验器皿的清洗是实验前的一项重要准备工作，是实验的基本条件。玻璃器皿可采用干热或湿热灭菌的方式灭菌，剪刀、勺子等物品要做到做样专用。培养基制备未记录每次配制要做好标记，如名称、容量、灭菌温度等，在批次批量大的情况下，防止发生混乱。偷懒不做空白实验梯度不成比例却无法溯源空白试验可以有助于实验出错的情况下更好地去溯源问题所在，一定要记得做空白实验！洗球耳没有清洗干净可能会导致微生物的污染吸液洗耳球应定期清洗灭菌，移液管上部也需要塞棉花。没有严格按照无菌操作的要求例如某些样品没有在酒精灯旁边接种操作时在无菌环境中尽量保证无菌操作，无菌室的环境监测也是非常重要的。移液枪或分液器未校准得到的结果不精准，导致溶液分装不准确3-6个月对移液枪或分液器进行校准一次，也可借助自动化设备，高效校准。规格多，分装混乱溶液配制就是微生物实验室的家常便饭，分液错误又会直接影响实验结果。微生物检测小妙招！在微生物检测中，各种缓冲液、无菌生理盐水、液体培养基等溶液的分装工作重复而且繁琐，占用了实验人员大量时间。而自动化设备的应用，不仅能够提高实验室工作效率，还能高效避免人为操作带来的误差，提高可重现性。

测定培养基pH的最准确的方法是使用pH计，使用前必须用已知pH的（通常pH为4-7）标准缓冲溶液进行校准。将pH计的电极用蒸馏水冲洗后浸入到烧杯的培养基中，就可以从pH计的刻度读出培养基的pH。每个生产厂商对每种不同pH计都提供有详细的操作说明。接下来远慕为大家详细解答。配制培养基时，使用带机械搅拌的pH计可以很容易地调整pH。培养基位在能够不停搅拌的容器（如大烧杯）中配制，使用磁力搅拌器，磁力搅拌器带有聚乙烯或聚四氟乙烯包装的磁棒。含琼脂的培养基需在融化后调整其pH，用可加热的磁力搅拌器很容易办到。调节pH时用已知pH的标准缓冲液溶液先对pH计进行校准。然后将复合电极和电阻温度计（如果有）置于培养基，从烧杯远离电极的一端缓慢加人适量的盐酸和氢氧化钠，保到培养基达到并保持所需的pH。pH计的温度补偿应考虑到温度对电极系统的影响：在一些稀释液和培养基中，pH随温度的变化而有相当大的变化。对于液体培养基和稀释液而言，通常既可以在25℃下，也可以在其使用时的温度下调整和测定。琼脂培养基必须在溶解后进行pH的调整，溶解的温度在45℃以上。因此，固体培养基应在其使用温度确定pH。这时应使用平头的复合电极，同时用手动校准pH计的温度补偿。在制备培养基时,若测定出培养基在熔化状态和凝固状态的pH有所不同时，说明在调整pH产生误差。同样，制备的培养基在加热灭菌处理（如高压灭菌〉时，也可能会产生pH的变化。对于脱水培养基，生产厂商己考虑到这一点，通常不谣要再调整其pH。但应认真核对待用培养基的pH。如果脱水的琼脂培养基在再次溶解或制备的过程中必须调整pH，那么在灭菌操作步骤之后用过滤灭菌的盐酸和氢氧化钠溶液进行调整，以避免造成因再次灭菌而形成的培养基的过度加热。当用不同的原枓或药品制备培养基时，必须在高压灭菌后检测培养基的pH。此外，如果发现培养基的在每次高压灭菌后都发生相同变化，可在配制培养基时对pH进行适当调整。但仍需测定培养基灭菌后的最终pH。测定培养基pH的最准确的方法是使用pH计，使用前必须用已知pH的（通常pH为4-7）标准缓冲溶液进行校准。将pH计的电极用蒸馏水冲洗后浸入到烧杯的培养基中，就可以从pH计的刻度读出培养基的pH。每个生产厂商对每种不同pH计都提供有详细的操作说明。配制培养基时，使用带机械搅拌的pH计可以很容易地调整pH。培养基位在能够不停搅拌的容器（如大烧杯）中配制，使用磁力搅拌器，磁力搅拌器带有聚乙烯或聚四氟乙烯包装的磁棒。含琼脂的培养基需在融化后调整其pH，用可加热的磁力搅拌器很容易办到。调节pH时用已知pH的标准缓冲液溶液先对pH计进行校准。然后将复合电极和电阻温度计（如果有）置于培养基，从烧杯远离电极的一端缓慢加人适量的盐酸和氢氧化钠，保到培养基达到并保持所需的pH。pH计的温度补偿应考虑到温度对电极系统的影响：在一些稀释液和培养基中，pH随温度的变化而有相当大的变化。对于液体培养基和稀释液而言，通常既可以在25℃下，也可以在其使用时的温度下调整和测定。琼脂培养基必须在溶解后进行pH的调整，溶解的温度在45℃以上。因此，固体培养基应在其使用温度确定pH。这时应使用平头的复合电极，同时用手动校准pH计的温度补偿。在制备培养基时,若测定出培养基在熔化状态和凝固状态的pH有所不同时，说明在调整pH产生误差。同样，制备的培养基在加热灭菌处理（如高压灭菌〉时，也可能会产生pH的变化。对于脱水培养基，生产厂商己考虑到这一点，通常不谣要再调整其pH。但应认真核对待用培养基的pH。如果脱水的琼脂培养基在再次溶解或制备的过程中必须调整pH，那么在灭菌操作步骤之后用过滤灭菌的盐酸和氢氧化钠溶液进行调整，以避免造成因再次灭菌而形成的培养基的过度加热。当用不同的原枓或药品制备培养基时，必须在高压灭菌后检测培养基的pH。此外，如果发现培养基的在每次高压灭菌后都发生相同变化，可在配制培养基时对pH进行适当调整。但仍需测定培养基灭菌后的最终pH。

细菌培养的基础是配制培养基牛肉膏蛋白胨培养基的配方然后再加热溶解，补足水分，其制作过程包括以下4个环节：①清洁玻璃器皿  一般用肥皂液煮沸30 min,或用重铬酸钾和浓硫酸配制的溶液浸泡数10 min，然后用清水冲洗，晾干后保存备用。②配制液体培养基  a．根据需要配制培养基数量，先在烧杯中注入少量蒸馏水；b．按培养基配方称量各种成分的原料，依次使之溶解；c．补足需水量；d．如用牛肉膏、蛋白胨配制时，需加热熔化后溶解；e．加热后，补足水分即可。③配制固体培养基  在液体培养基里加入一定量的琼脂，加热熔化即可。④调pH  先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基滴加1 mol/L 的NaOH溶液，边加边搅拌，并随时用pH试纸测pH,直到7.4～7.6为止。反之则用1 mol/L的HCl进行调节。⑤过滤分装  用纱布趁热过滤，将滤液分装于试管中，其量约为试管体积的1/5（不要玷污管壁）。⑥加棉塞  培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染；保证通气良好，加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内。⑦包扎  每10支试管用线绳捆成一捆，并且在管口外面包上一层牛皮纸，然后用线绳扎好。在每捆试管外/挂上标签，注明培养基名称、配制日期和制作者姓名。（2）灭菌  高压蒸汽灭菌的效果是细菌培养的关键。具体操作如下：①打开高压灭菌锅，取出里面的灭菌桶，向锅内加水（最好用开水）水面与底架平齐为宜。②将扎好的试管管口向上，竖放在灭菌桶内，再将灭菌桶放回灭菌锅。注意：灭菌桶内的物品不能放得太挤，否则会影响灭菌效果。③加盖，并将排气软管插入灭菌桶的排气槽内。以两两对称的方式，同时旋紧相对的两个紧固螺栓，以防漏气。④排出锅内的冷空气。⑤当锅内的压力上升到规定压力时，维持压力20 min，切断电源。⑥压力降至0以后，打开排气阀，排气完毕打开灭菌锅。（3）搁置斜面   如果要制作斜面培养基，将灭菌后的培养基冷却到50℃，每个试管带棉塞的一端搁在一根木棒上，使培养基形成斜面，斜面的长度不超过试管总长度的一半。(4) 检验灭菌效果灭菌好的培养基在37℃培养箱中培养24h，检验灭菌效果。

1．固体培养基标本或液体培养物划线接种到固体培养基表面后，单个细菌经分裂繁殖可形成一个肉眼可见的细菌集团，称为菌落（colony）。(1)菌落的形态特征：大小、形状（露滴状、圆形、菜花样、不规则等）、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白色、黑色、绿色、无色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为3型：①光滑型菌落（S型菌落）：菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，新分离的细菌大多呈光滑型菌落。②粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皱纹或颗粒状，边缘大多不整齐。R型菌落多为S型细菌变异失去菌体表面多糖或蛋白质形成。R型细菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型细菌弱。但也有少数细菌新分离的毒力株就是R型，如炭疽孢杆菌、结核分枝菌等。③粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠、有光泽、似水珠样。多见于厚荚膜或丰富粘液层的细菌、结核杆菌等。(2)菌落溶血特征：菌落溶血有下列3种情况：①α溶血：又称草绿色溶血，菌落周围培养基出现1~2mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；②β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；③γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。(3)色素：有些细菌产生水溶性色素，使菌落和周围的培养基出现绿色、金黄色、白色、橙色、柠檬色等颜色，产生的色素有水溶性或脂溶性。(4)气味：某些细菌在培养基中生长繁殖后可产生特殊气味，如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦的臭味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、白色假丝酵母菌（酵母味）和放线菌（泥土味）等。2．液体培养基细菌在液体培养基中有3种生长现象：大多数细菌在液体培养基生长繁殖后呈均匀混浊；少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌等则呈沉淀生长；枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌等专性需氧菌一般呈表面生长，常形成菌膜。3．半固体培养基半固体培养基主要用于细菌动力试验，有鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外，在穿刺线两侧也可见羽毛状或云雾状混浊生长。无鞭毛的细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长，穿刺线两边的培养基仍然澄清透明，为动力试验阴性。

微生物培养基质按照物理状态可分为：固体培养基、半固体培养基、液体培养基和脱水培养基。按照微生物的种类可分为：细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基。按照化学分类可分为：天然培养基、合成培养基和半合成培养基。一、微生物培养基质有哪些种类1、按照物理状态区分：分为固体培养基、半固体培养基、液体培养基和脱水培养基。2、按照微生物种类区分：分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基。3、按照化学分类区分：分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基。4、按照营养成分是否完全区分：分为基本培养基、完全培养基、补充培养基。5、按照生产目的区分：分为种子培养基和发酵培养基。6、按照培养物的培养过程区分：分为初代培养基和继代培养基。7、根据作用的不同区分：分为诱导培养基、增值培养基、生根培养基。二、微生物培养基质成分一般包括什么微生物培养基质一般包括水、无机盐、有机物、植物激素、培养体支持材料以及辅助性物质。1、无机盐：氮、磷、钾、钠等。2、有机物：碳水化合物、维生素、天然复合物、肌醇、氨基酸。3、植物激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸。4、培养体支持材料：琼脂、卡拉胶、玻璃纤维。5、辅助性物质：抗生素、抗氧化物、活性炭。