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芽胞悬液获取的两种方法介绍
目前中国药典、消毒技术规范中用于各种化学消毒剂、干热、环氧乙烷、高压蒸汽等灭菌效果的验证和评价的芽胞悬液的获得主要通过自制和商品化两种途径。
一、自制芽胞悬液
(1) 菌种处理：取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5～10ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18～24小时。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18～24小时。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，于37℃培养18～24小时，即为第3代培养物。
(2) 转种固体培养基：用10.0ml吸管吸取5.0～10.0ml第3～5代的18～24小时营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面，再将多余肉汤培养物吸出，将罗氏瓶置于37℃温箱内，培养5～7天。
(3) 观察芽胞形成：用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽胞染色法染色，并在显微镜(油镜)下进行镜检。当芽胞形成率达95％以上时，即可进行以下处理。否则，应继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽胞形成率后再进行以下处理。
改良芽胞染色法：
①用接种环取菌样涂布于玻片上，待自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。
②将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的5.0％孔雀绿水溶液。将平皿盖好，放54℃～56℃条件下，加热30分钟。取出。去滤纸，用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。
③加0.5％沙黄水溶液，染1分钟。水洗，待干后镜检。芽胞呈绿色，菌体呈红色。
(4) 制成芽胞悬液：罗氏瓶培养物，用10.0ml吸管加10.0ml无菌蒸馏水于每一罗氏瓶中，以L棒轻轻推刮下菌苔。吸出第1批洗下的菌悬液，再向瓶内吸加5.0ml无菌蒸馏水，重复洗菌一遍。将第1和第2批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇5分钟，打碎菌块，使成均匀的芽胞悬液。（注意：必要时，将盛装菌悬液的三角烧瓶置45℃水浴中24小时，使菌自溶断链。分散成单个芽胞。）
(5)纯化芽胞液：用无菌棉花或纱布过滤芽胞悬液，清除其中的琼脂凝块。将过滤后的芽胞悬液，置无菌离心管内，以3000转／分速度离心30分钟。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽胞重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，先后共3遍。将洗净的芽胞悬浮于三角烧瓶内蒸馏水中，并加入适量小玻璃珠。将芽胞液放于80℃水浴中10分钟(或60℃，30分钟)，以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，保存于4℃冰箱中备用。有效使用期为半年。
(6)芽胞悬液在使用时，应用平板法先进行活菌培养计数。怀疑有杂菌污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。
二、商品化芽胞悬液
HKM™定量芽胞悬液（菌种名称：萎缩芽孢杆菌（曾用名：枯草芽孢杆菌黑色变种）ATCC9372）
产品介绍：该芽胞悬液是根据国际通用标准菌株ATCC9372，参照国家药典、消毒技术规范、相关标准等，经严格质量控制制备而成。该菌株悬液含有一定数量的芽胞，用于自制生物指示剂应用于各种化学消毒剂、干热、环氧乙烷等灭菌效果的验证和评价，无菌冷灌装生产线的性能验证，染菌载体的制备以及生物安全柜灭菌效果的验证等。也可用于直接培养等。
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