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影响免疫组化的因素及对策
一）免疫组化染色假阳性及其对策
1、消除内源酶的影响在涉及免疫过氧化酶的各种染色中，均用过氧化物酶来标记抗体，酶的作用是催化底物，使显色剂显色，正常组织中也含有一定量的过氧化物酶，其同样也能催化底物显色，而影响免疫组化染色的特异性，因此在加入标记酶前应设法将其灭活，以保证染色反应的特异性。
通常情况下，去除内源酶的方法是先用3%的过氧化氢溶液作用，但在含有丰富血细胞的标本中，由于血细胞中存在大量具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢产生强烈的反应，产生气泡而破坏组织结构和细胞形态。在OCT包埋的冰冻切片中，使用3%的过氧化氢化溶液亦会产生类似现象。此时可用3%的过氧化氢甲醇溶液孵育20分钟的方法灭活内源性酶。
灭活内源酶对正确判断含血细胞较多的标本，如骨髓、胎盘、脾等的染色结果十分重要。同样，正常细胞也含生物素，尤以肝、脾、肾组织含量为多。在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合后继抗体，形成亲和素（或链亲合素）-生物素复合物，导致假阳性发生。消除这种非特异性着色的方法，是在采用生物素方法染色前，对标本进行亲和素处理，使其结合位点饱和。
2、抗体导致的非特异性着色高纯度、高效价的抗体是免疫组化染色的关键。出现下列情况时，可能发生非特异性着色。
（1）因抗原不纯而导致制备的抗体不纯，常见于多克隆抗体。可用亲和层析的方法除去非特异性抗体或应用高纯度的抗原制备抗体，采用单克隆抗体能避免非特异着色。
（2）标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇，解决的方法只有采用针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体。
3、消除非特异性背景着色
非特异性着色最常见的情况是蛋白质（抗体）吸附到组织切片中高度荷电的胶原及结缔组织成分上，防止非特异性背景着色的方法之一是在滴加一抗前在标本上加一种无关的蛋白质溶液，封闭荷电点不给一抗留有吸附余地，以保证一抗不会吸附到胶原纤维及结缔组织成分上。最常用的无关蛋白质溶液是所用二抗的同种动物非免疫血清。用产生二抗的同种动物血清，是为了避免二抗与预先加入的蛋白质结合引起假阳性染色。
用来阻断非特异性结合的血清不能有任何溶血现象。红细胞破裂会使其中的过氧化酶与底物作用，产生非抗原特异性的阳性着色。多克隆抗体因其成分复杂，更易造成背景染色。稀释液采用含1%BASpH7.4的PBS,同时在洗液中加入0.05%的吐温20（Tween20）有助于消除背景染色。
4、消除病理性色素的影响
当所检动物由于出血等原因造成吞噬含铁血黄素细胞增多时，为防止其与DAB显色呈现的黄褐色发生混淆，最好选用AEC显色剂。组织固定时间过长时，切片中容易产生福尔马林色素颗粒，影响结果观察，取材时应充分用流水冲洗，以消除影响。
5、切片制作不当引起的非特异性着色在严重变性、坏死及炎性病灶处，在胶原纤维和结缔组织部位，在切片裱贴不平、折皱处以及组织边缘部位常会出现非特异性着色。其中有的是因组织荷电状态改变而吸附抗体；有的机理不明；有的可能与组织边缘或皱折深部的槽形构型有关，解决的办法是在滴加一抗前，以二抗动物的正常血清（5%~10%）封闭、饱和电荷吸附位点和改善取材与制片技术。
6、清洗不充分而造成的非特异性着色应严格操作规程。缓冲液中含一定量的盐，其有利于减低背景着色，通常使用0.05mlo/LPBS,溶液内加入吐温20,效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。另外，在清洗后至加入下一步试剂前，不能干片，干片的部位会出现非特异着色。
7、DBA显色产生的某些背景颜色使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸镏水的pH值，以确保实验结果的正确性。粉剂DBA溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去。否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2.
（二）免疫组化染色的假阴性及其对策
通常可因标本抗原保存，试剂质量及染色操作等因素引起假阴性。
1、组织处理不当固定不及时或固定时间过长常导致抗原丢失。浸蜡温度过高，时间过长将破坏抗原的抗原性。应改善技术条件，重新取材。
2、抗原修复由于目前所进行的常规石蜡切片标本均用甲醛固定，所形成的醛健、羧甲键等封闭了部分抗原决定簇，或由于蛋白之间发交联而使抗原决定簇隐蔽，因此在染色时，有些抗原需要先进行抗原修复或暴露。至于哪种抗原需要进行修复，需在建立染色程序时经实验确定。抗原修复分为化学方法和物理/化学方法。
（1）化学方法：主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等。需根据需要使用。（2）物理/化学方法：主要有以下几种
①单纯加热方法：将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的容器中，加热至沸腾，并持续10~15分钟，此方法操作简单、经济，适用于所有实验室，但对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。②高压加热方法：将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的高压锅中，加热至喷气，并持续1~2分钟。
③微波方法：将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，并持续10~15分钟，室温20~30分钟自然晾凉，使蛋白复性。此方法不仅利用热效应，且可通过微波的直接作用，打开蛋白之间的交联键，将已被封闭的抗原决定簇暴露和修复。
3、一抗的选用、稀释度及孵育时间第一抗体是免疫组化染色中最重要的试剂。应用何种一抗，应根据具体目的和要求决定。临床病原诊断，要求较高的敏感性和较广的识别谱时，可选用多克隆抗体或几株混合的单克隆抗体，来避免抗体反应谱过窄造成的假阴性。某些研究工作需要检测单一抗原决定簇的存在，此时必须选用单克隆抗体。一抗的参考稀释度常由“方格滴定”和相关检测结果推测得出，但因实验条件不同，对抗原活性的影响不同，最佳稀释度仍需经过摸索。任何一个抗体，其工作稀释度取决于如下因素：
（1）抗体的滴度即特异性抗体浓度；
（2）抗体的纯度，即抗体中杂蛋白的浓度。杂蛋白较高时，需要较高的稀释度；（3）孵育的时间，时间越长，所用的抗体稀释倍数越高；
（4）组织中抗原含量对抗体的应用浓度有不同的要求。在免疫反应中，过多的抗体将导致阴性结果，这种现象类似于凝集反应中的前带现象。因此需用“方格滴定”的方法找出适当的稀释度，
并得到最大强度的抗原染色和最低的背景着色。一般认为，某一稀释度下特异性染色较强且无背景着色，是较理想的稀释度，加长孵育时间可有效地降低所用抗体的浓度，有利于提高染色质量，节省抗体，可用37℃0.5h或4℃过夜的方法。只要控制好温度、抗体稀释度和孵育时间，一般都能得到理想的染色效果。
4、选择适宜的二抗二抗应用中常出现的总是是抗体本身与一抗不匹配，如抗兔的二抗，匹配鼠来源的一抗；或以抗鼠的二抗匹配兔来源的一抗，都会出现假阴性结果。
5、试剂造成的影响酶的活性降低，缓冲液内加有叠氮钠抑制了酶活性，底物中所加H2O2量少或失效，操作中漏加了某种试剂等，都会造成假阴性结果。如阳性对照不成立，则需认真检查操作程序，查找可能的原因。
1、消除内源酶的影响在涉及免疫过氧化酶的各种染色中，均用过氧化物酶来标记抗体，酶的作用是催化底物，使显色剂显色，正常组织中也含有一定量的过氧化物酶，其同样也能催化底物显色，而影响免疫组化染色的特异性，因此在加入标记酶前应设法将其灭活，以保证染色反应的特异性。
通常情况下，去除内源酶的方法是先用3%的过氧化氢溶液作用，但在含有丰富血细胞的标本中，由于血细胞中存在大量具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢产生强烈的反应，产生气泡而破坏组织结构和细胞形态。在OCT包埋的冰冻切片中，使用3%的过氧化氢化溶液亦会产生类似现象。此时可用3%的过氧化氢甲醇溶液孵育20分钟的方法灭活内源性酶。
灭活内源酶对正确判断含血细胞较多的标本，如骨髓、胎盘、脾等的染色结果十分重要。同样，正常细胞也含生物素，尤以肝、脾、肾组织含量为多。在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合后继抗体，形成亲和素（或链亲合素）-生物素复合物，导致假阳性发生。消除这种非特异性着色的方法，是在采用生物素方法染色前，对标本进行亲和素处理，使其结合位点饱和。
2、抗体导致的非特异性着色高纯度、高效价的抗体是免疫组化染色的关键。出现下列情况时，可能发生非特异性着色。
（1）因抗原不纯而导致制备的抗体不纯，常见于多克隆抗体。可用亲和层析的方法除去非特异性抗体或应用高纯度的抗原制备抗体，采用单克隆抗体能避免非特异着色。
（2）标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇，解决的方法只有采用针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体。
3、消除非特异性背景着色
非特异性着色最常见的情况是蛋白质（抗体）吸附到组织切片中高度荷电的胶原及结缔组织成分上，防止非特异性背景着色的方法之一是在滴加一抗前在标本上加一种无关的蛋白质溶液，封闭荷电点不给一抗留有吸附余地，以保证一抗不会吸附到胶原纤维及结缔组织成分上。最常用的无关蛋白质溶液是所用二抗的同种动物非免疫血清。用产生二抗的同种动物血清，是为了避免二抗与预先加入的蛋白质结合引起假阳性染色。
用来阻断非特异性结合的血清不能有任何溶血现象。红细胞破裂会使其中的过氧化酶与底物作用，产生非抗原特异性的阳性着色。多克隆抗体因其成分复杂，更易造成背景染色。稀释液采用含1%BASpH7.4的PBS,同时在洗液中加入0.05%的吐温20（Tween20）有助于消除背景染色。
4、消除病理性色素的影响
当所检动物由于出血等原因造成吞噬含铁血黄素细胞增多时，为防止其与DAB显色呈现的黄褐色发生混淆，最好选用AEC显色剂。组织固定时间过长时，切片中容易产生福尔马林色素颗粒，影响结果观察，取材时应充分用流水冲洗，以消除影响。
5、切片制作不当引起的非特异性着色在严重变性、坏死及炎性病灶处，在胶原纤维和结缔组织部位，在切片裱贴不平、折皱处以及组织边缘部位常会出现非特异性着色。其中有的是因组织荷电状态改变而吸附抗体；有的机理不明；有的可能与组织边缘或皱折深部的槽形构型有关，解决的办法是在滴加一抗前，以二抗动物的正常血清（5%~10%）封闭、饱和电荷吸附位点和改善取材与制片技术。
6、清洗不充分而造成的非特异性着色应严格操作规程。缓冲液中含一定量的盐，其有利于减低背景着色，通常使用0.05mlo/LPBS,溶液内加入吐温20,效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。另外，在清洗后至加入下一步试剂前，不能干片，干片的部位会出现非特异着色。
7、DBA显色产生的某些背景颜色使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸镏水的pH值，以确保实验结果的正确性。粉剂DBA溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去。否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2.
（二）免疫组化染色的假阴性及其对策
通常可因标本抗原保存，试剂质量及染色操作等因素引起假阴性。
1、组织处理不当固定不及时或固定时间过长常导致抗原丢失。浸蜡温度过高，时间过长将破坏抗原的抗原性。应改善技术条件，重新取材。
2、抗原修复由于目前所进行的常规石蜡切片标本均用甲醛固定，所形成的醛健、羧甲键等封闭了部分抗原决定簇，或由于蛋白之间发交联而使抗原决定簇隐蔽，因此在染色时，有些抗原需要先进行抗原修复或暴露。至于哪种抗原需要进行修复，需在建立染色程序时经实验确定。抗原修复分为化学方法和物理/化学方法。
（1）化学方法：主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等。需根据需要使用。（2）物理/化学方法：主要有以下几种
①单纯加热方法：将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的容器中，加热至沸腾，并持续10~15分钟，此方法操作简单、经济，适用于所有实验室，但对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。②高压加热方法：将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的高压锅中，加热至喷气，并持续1~2分钟。
③微波方法：将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，并持续10~15分钟，室温20~30分钟自然晾凉，使蛋白复性。此方法不仅利用热效应，且可通过微波的直接作用，打开蛋白之间的交联键，将已被封闭的抗原决定簇暴露和修复。
3、一抗的选用、稀释度及孵育时间第一抗体是免疫组化染色中最重要的试剂。应用何种一抗，应根据具体目的和要求决定。临床病原诊断，要求较高的敏感性和较广的识别谱时，可选用多克隆抗体或几株混合的单克隆抗体，来避免抗体反应谱过窄造成的假阴性。某些研究工作需要检测单一抗原决定簇的存在，此时必须选用单克隆抗体。一抗的参考稀释度常由“方格滴定”和相关检测结果推测得出，但因实验条件不同，对抗原活性的影响不同，最佳稀释度仍需经过摸索。任何一个抗体，其工作稀释度取决于如下因素：
（1）抗体的滴度即特异性抗体浓度；
（2）抗体的纯度，即抗体中杂蛋白的浓度。杂蛋白较高时，需要较高的稀释度；（3）孵育的时间，时间越长，所用的抗体稀释倍数越高；
（4）组织中抗原含量对抗体的应用浓度有不同的要求。在免疫反应中，过多的抗体将导致阴性结果，这种现象类似于凝集反应中的前带现象。因此需用“方格滴定”的方法找出适当的稀释度，
并得到最大强度的抗原染色和最低的背景着色。一般认为，某一稀释度下特异性染色较强且无背景着色，是较理想的稀释度，加长孵育时间可有效地降低所用抗体的浓度，有利于提高染色质量，节省抗体，可用37℃0.5h或4℃过夜的方法。只要控制好温度、抗体稀释度和孵育时间，一般都能得到理想的染色效果。
4、选择适宜的二抗二抗应用中常出现的总是是抗体本身与一抗不匹配，如抗兔的二抗，匹配鼠来源的一抗；或以抗鼠的二抗匹配兔来源的一抗，都会出现假阴性结果。
5、试剂造成的影响酶的活性降低，缓冲液内加有叠氮钠抑制了酶活性，底物中所加H2O2量少或失效，操作中漏加了某种试剂等，都会造成假阴性结果。如阳性对照不成立，则需认真检查操作程序，查找可能的原因。
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