随着全球经济一体化步伐加快，食品安全、生物、环保等领域的检测技术飞速发展，对于测量结果可靠性需求也不断增加。标准物质作为分析测量过程中的“化学砝码”，可实现准确一致的测量，保证量值有效传递。那究竟什么样的物质才可称为标准物质？标准物质的定义及特点国家质检总局1987年发布的《标准物质管理办法》指出“标准物质是指用于统一量值的标准物质”。2012年实施的计量技术规范JJF 1001-2011 《通用计量术语及定义》中对标准物质则有了更清晰的定义：“标准物质又称参考物质（Reference Material，RM）：具有足够均匀和稳定的特定特性的物质，其特性被证实适用于测量中或标称特性检查中的预期用途”。其中有证标准物质（Certified Reference Material，CRM）则是指：“附有由权威机构发布的文件，提供使用有效程序获得的具有不确定度和溯源性一个或多个特性量值的标准物质”。目前，国际上知名的有证标准物质包括美国NIST的SRM，欧洲IRMM的BCR、ERM和IRMM等。而我国标准物质则一般分为一级标准物质GBW和二级标准物质的代号以GBW( E)，二者均属于“有证标准物质”，其编号由国家市场监督管理总局统一指定、颁发，按国家颁布的计量法进行管理。通过研究定义可发现，标准物质一般都具有三个显著特点：具有特性量值的准确性、均匀性、稳定性；量值具有传递性；实物形式的计量标准。因此，标准物质尤其是有证标准物质，它们的用途非常广泛。国际法制计量组织（OIML）在OIML D18 中给出了有证标准物质在法制计量控制领域的基本功能，即用作标准来检定、校准和测试测量设备；证明测量程序和/ 或测量不确定度；在测量过程中校准测量设备。标准物质的作用我国的计量技术规范JJF 1507-2015 《标准物质的选择与应用》中则将标准物质的作用归纳为五点，以下将一一加以说明。1、校准现代仪器技术发展为化学分析者提供了高灵敏度、高专一性、高精密度的分析方法，这些方法基本都需通过校准物的信号与被分析物信号比较来确定被分析物的量，有证标准物质因此成为校准链上的重要一环。《计量法实施细则》中明确规定标准物质属于计量器具的一种，其也成为法定计量检定机构用来复现、保存和量值传递的计量标准器。标准物质通过不间断的校准链，以相对直接的方式实现测量结果对选定参考对象的计量溯源性，可保证检定、校准结果的准确、可靠、有效。2、建立计量溯源性实际测量中，通过使用不同等级的标准物质，按准确度由低到高，逐级进行量值的追溯，直到国际基本单位SI，这个过程实现了量值的“溯源”。而若从国际基本单位出发，用不同等级的标准物质由高至低进行量值传递，最终至实际测量现场的过程，则被称为量值的“传递”。通过标准物质的使用，最终形成化学测量完整的溯源一量传体系。3、为其他材料赋值有证标准物质常可用于材料赋值。如果赋值过程中用到的相关设备经过适当校准，并采取了充分的质量保证与质量控制措施，就有可能通过该有证标准物质建立特性值对规定测量单位的计量溯源性。在化学成分量测量领域，常使用标准物质通过混合、稀释等手段制备其他工作用标准物质或校准物，这些物质的特性值及不确定度取决于所使用标准物质，并受制备程序和环境条件的影响。此外，标准物质还可以通过经典称量滴定法或容量滴定法分析为其他材料赋值。4、测量方法/程序确认标准物质作为特性量值已知的物质，可用于研究和评价测量成分或特性的方法，判断该方法的准确度和重复性。有证标准物质可用于测量正确度确认，亦可用于其他确认目的，借此有效建立测定结果的计量溯源性。质量控制物质或其他未经定值的标准物质可用于方法确认，但由于特性值缺少计量溯源性，因此仅适合评估与精密度相关的量度。通过验证和改进测量方法的准确度，评价检测方法在特定场合的适应性，从而促进校准方法和测试技术的发展，已有很多单位将标准物质应用于标准方法的制定和实施过程中。5、测量质量控制标准物质可以为日常实验室质量控制指标如测量精密度、测量偏倚或回收率、灵敏度等提供均匀、稳定的样品，另外，利用标准物质开展的实验室间比对活动，也是一种有效的实验室外部质量控制手段。在缺乏合适基体的标准物质或考虑标准物质使用成本的情况下，可由实验室或具有同样要求的用户群自行制备质量控制标准物质。必要时，可运用有证标准物质为实验室制备的质量控制标准物质赋值或提供计量溯源性保证。标准物质的发展基于标准物质的这些重要作用，国务院2006年发布的《国家中长期科学和技术发展规划纲要( 2006-2020年)》在 “加强科技基础条件平台建设”条款中明确指出，要 “研究制定高精确度和高稳定性的计量基标准和标准物质体系”。2013年国务院又印发《计量发展规划( 2013-2020) 》，规划中明确指出要“开展基础前沿标准物质研究，扩大国家标准物质覆盖面，填补国家标准物质体系的缺项和不足。加强标准物质定值、分离纯化、制备、保存等相关技术、方法研究，提高技术指标。加快标准物质研制，提高质量和数量，满足食品安全、生物、环保等领域检测技术配套和支撑需求。完善标准物质量传溯源体系，保证检测、监测数据结果的溯源性、可比性和有效性。

　　1：DH5a菌株　　DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。　　基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1　　2：BL21(DE3)菌株　　该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。　　基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）　　3：BL21(DE3)pLysS菌株　　该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。　　基因型：F-，ompThsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS，Camr　　4：JM109菌株　　该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株　　基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’　　5：TOP/10菌株　　该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。　　基因型：F-，mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，φ80，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU，galK，rps，(Strr)endA1，nupG　　6：HB101菌株　　该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验　　基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1M110或SCS110　　大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响.部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI,BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：　　（1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；　　（2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coliJM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。

　　你知道什么是微生物检验吗?你对微生物检验了解吗?下面是远慕生物为大家带来的关于微生物检验必须要知道的三大耐药机制的知识，一起了解下吧。　　一、产生灭活抗生素的各种酶　　1、 β—内酰胺酶(β-lactamase)　　β—内酰胺类抗生素都共同具有一个核心β—内酰胺环，其基本作用机制是与细菌的青霉素结合蛋白结合，从而抑制细菌细胞壁的合成。产生β—内酰胺酶是细菌对β-内酰胺类抗菌药物产生耐药的主要原因。细菌产生的β-内酰胺酶，可借助其分子中的丝氨酸活性位点，与β—内酰胺环结合并打开β—内酰胺环，导致药物失活。迄今为止报道的β—内酰胺酶已超过300种，1995年Bush等将其分为四型：第1型为不被克拉维酸抑制的头孢菌素酶;第2型为能被克拉维酸抑制的β-内酰胺酶;第3型为不被所有β—内酰胺酶抑制剂抑制的金属β-内酰胺酶(需Zn2+活化)。可被乙2胺四乙酸和P-chloromercuribenzate所抑制;第4型为不被克拉维酸抑制的青霉素酶。临床常见的β—内酰胺酶有超广谱β—内酰胺酶、头孢菌素酶(AmpC酶)和金属酶。　　(1)超广谱β-内酰胺酶(Extended-Spectrumβ-lactamases,ESBLs)　　ESBLs是一类能够水解青霉素类、头孢菌素类及单环类抗生素的β—内酰胺酶，属Bush分型中的2型β—内酰胺酶，其活性能被某些β—内酰胺酶抑制剂(棒酸、舒巴坦、他唑巴坦)所抑制。ESBLs主要由普通β-内酰胺酶基因(TEM—1，TEM—2和SHV—1等)突变而来，其耐药性多由质粒介导。自1983年在德国首次发现ESBLs以来，目前已报道的TEM类ESBIs已有90多种，SHV类ESBLs多于25种。TEM型和SHV型ESBLs主要发现于肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，亦发现于变形杆菌属、普罗威登斯菌属和其他肠杆菌科细菌。　　国内近年来随着三代头孢菌素的广泛使用，产ESBLs菌的检出率逐年增加。NCCLs规定，凡临床分离的大肠埃希氏菌和克雷伯氏菌均应监测是否为产ESBLs菌株;若产生，无论体外对第三代头抱菌素、氨曲南的药敏结果如何，均应报告对三代头孢菌素及氨曲南耐药。另外，ESBLs菌株不仅对β-内酰胺类抗生素有很高的耐药率，而且对氨基糖苷类、喹喏酮类耐药率也在60%左右，因此，临床遇到由ESBLs引起的感染时，建议shou选含β—内酰胺酶抑制剂的复方抗生素制剂或亚胺培南;对于头孢吡肟等四代头孢，尚有争议，根据抗菌药的PK/PD理论，适当改变给药剂量和给药间隔。以使血药浓度超过细菌MIC的时间达40%给药间隔以上，或许是有效的。　　(2)头孢菌素酶(AmpC酶)届Bush分类中的1型(Ⅰ型) β—内酰胺酶。　　通常将其分为由染色体介导产生的AmpC β—内酰胺酶和由质粒介导产生的AmpC β—内酰胺酶，前者的产生菌有阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌等，后者主要由肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌产生。AmpC酶可作用于大多数青霉素，第一、二、三代头孢菌素和单环类抗生素。而第四代头孢菌素、碳青霉烯类不受该酶作用。该酶不能被β—内酰胺酶抑制剂所抑制。AmpCβ—内酰胺酶的产生有2种可能：①在诱导剂存在时暂时高水平产生，当诱导剂不存在时，酶产量随之下降，三代头孢菌素、棒酸和碳青霉烯类抗生素是诱导型AmpC酶的强诱导剂;②染色体上控制酶表达的基因发生突变，导致AmpC酶持续稳定高水平表达。由高产AmpC酶耐药菌引起的感染死亡率很高。　　实际上，所有的革兰氏阴性菌都能产生染色体介导的AmpC头孢菌素酶，在多数情况下为低水平表达;在肠杆菌、柠檬酸杆菌、沙雷氏菌、铜绿假单胞菌中可高频诱导产生，且常为高产突变株。当临床出现上述细菌感染，开始几天三代头孢菌素治疗敏感，而随后发生耐药时，我们可怀疑为高产AmpC酶的细菌感染，四代头孢菌素和碳青霉烯类抗生素不受具影响，可供临床选用。含酶抑制剂的复方制剂不能用于治疗产AmpC酶菌株的感染。　　(3)金属酶(metalloβ-1actamase)　　大部分β-内酰胺酶的活性位点是丝氨酸残基，但也有一小部分活性位点为金属离子的酶类。第一个发现的以金属离子为活性中心的酶是由蜡样芽抱杆菌产生的头孢菌素酶，能被EDTA所抑制，之后世界各地均发现了能产生这类酶的各种细菌。1988年Bush首次将该酶定名为金属β-内酰胺酶(metalloβ-1actamase)，简称金属酶。金属β-内酰胺酶耐受β—内酰胺酶抑制剂且可水解几乎所有β—内酰胺类抗生素(包括亚胺培南)。该酶已在气单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德氏菌中发现，其中嗜麦芽窄食单胞菌的亚胺培南耐药性由染色体介导，而脆弱拟杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌中质粒介导的突变株在日本已有报道。由粘质沙/雷氏菌产生的金属β—内酰胺酶IMP-1型可在类似接合子的intl3上移动，已经传播到铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和产碱杆菌。金属酶可以水解碳青霉烯类和最近开发的第四代头孢菌素。金属β-内酰胺酶有广泛传播的潜力，对几乎所有的β—内酰胺类抗生素均具有水解活性，是目前所知的最强的β-内酰胺酶-。　　2、氨基糖甙修饰酶(或钝化酶/灭活酶)　　在细菌对氨基糖甙类抗生素产生耐药的机制中，修饰酶介导的耐药最为流行，酶促修饰的氨基糖甙类抗生素不能与核糖体靶位作用，因此失去抗菌活性。修饰酶主要包括乙酰转移酶、磷酸转移酶和核苷转移酶。三类氨基糖苷修饰酶的作用机制各不相同：乙酰转移酶(AAC)修饰依赖于乙酰辅酶A的N-乙酰化：磷酸转移酶(APH)修饰依赖于ATP的O-磷酸化;核苷酸转移酶(ANT)修饰依赖于ATP的腺苷化。在革兰氏阴性病原菌中，最常见的氨基糖苷修饰酶是AAC(6’)，使氨基糖苷类抗生素1—、3—、2’—或6'—位乙酰化，如今已发现16种编码AAC(6’)的基因。铜绿假单胞菌和肠杆菌科细菌趋向于产生AAC(3)、AAC(6’)、ANT(2’’)以及APH(3’);葡萄球菌和粪肠球菌经常产生ANT(4’)(4’’)或双功能的AAC(6’)/APH(2”)。葡萄球菌对庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素的`耐药性和肠球菌的高度庆大霉素耐药性通常由双功能酶介导，这些酶通常(但非总是)由位于多重耐药质粒上的转座子(Tn924)编码，如葡萄球菌具有的转座子Tn5405编码的APH(3’)(提供卡那霉素、新霉素和阿米卡星耐药性)，而其他的定位于染色体。越来越多的菌株可产生2种或更多种酶，对抗氨基糖苷类抗生素。在过去几年里常见的组合是庆大霉素修饰酶ANT(2’’)和AAC(3)]与AAC(6’)结合，导致对庆大霉素、妥布霉素、耐替米星、卡那霉素和阿米卡星的广谱耐药性。　　氨基糖苷类抗生素对非发酵菌、肠杆菌科及一些革兰氏阳性球菌均有很好的抗菌活性，与β—内酰胺类抗生素联用有协同抗菌作用，在感染治疗中占有重要地位。但由于以上耐药机制的存在，细菌耐药问题也日趋严重，应该引起重视，可喜的是阿米卡星等对MRSA和产ESBLs菌株仍保持17%-40%的敏感率。　　二、改变药物作用靶位　　1、 青霉素结合蛋白(PBP)的改变导致的β—内酰胺类抗生素耐药　　青霉素结合蛋白(PBP)参与了肽聚糖合成的最后阶段。高分子量PBP常常为多模块，具有N末端糖基转移酶区和C末端转肽酶区。转肽酶区的活性位点丝氨酸与酶的天然结构相仿，可与与β—内酰胺类抗生素发生不可逆酰化。青霉素结合蛋白(PBP)的改变常导致如下两种临床重要的耐药表型。　　(1)耐甲氧西林金黄se葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus arueus,MRSA)　　MRSA是20世纪60年代英国首先报道的一种严重的临床耐药致病菌,20世纪80年代以来，世界各地都相继发生MRSA医院感染的暴发流行，并逐年增多。MRSA耐药分为固有耐药和获得性耐药，固有耐药是由染色体介导的，其耐药性的产生是因为细菌产生一种特殊的青霉素结合蛋白PBP2a(或PBP2’)，分子量为78000的蛋白质，与β内酰胺类抗生素的亲和力减低，从而导致细菌对β-内酰胺类抗生素耐药。PBP2a由mecA基因编码，95%以上的MRSA菌株能检测到mecA基因，而敏感株则无。获得性耐药是由质粒介导的，细菌获得耐药基因后，产生大量β-内酰胺酶(而不是PBPs)，使耐酶青霉素缓慢失活，表现出耐药性，多为临界耐药。　　在MRSA检测过程中，凡属MRSA，不管其对其他β-内酰胺类抗生素MIC值或抑菌圈的大小，实验室均应向临床报告为对所有青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、碳头孢烯类和β内酰胺类—酶抑制剂复合制剂耐药，以免误导临床用药。MRSA感染的治疗是临床十分棘手的难题之一，关键是其对许多抗生素具有多重耐药性，万古霉素是目前临床上治疗MRSA疗效肯定的抗生素，应用30多年来未发现耐药菌株。　　(2) 耐青霉素肺炎链球菌 (Penicillin resistant Streptococcus pneumoniae,PRSP)　　长期以来肺炎链球菌对青霉素高度敏感。MIC在0.005-0.01mg/L之间。1967年澳大利亚首次报道耐青霉素肺炎链球菌,MIC为0.5mg/L，此后世界许多国家和地区均有报道，且耐药率迅速上升。PRSP的耐药机制肺炎链球菌的青霉素结合蛋白(PBP)发生改变，使其与青霉素的亲和力减低。肺炎链球菌有6种PBP：1a、1b、2x、2a、2b和3，其中PBP2b最为重要，如果青霉素结合到PBP2b上并使之抑制即导致细菌溶解和死亡;反之，PBP2b发生突变，青霉素不能产生作用，则导致PRSP。在PRSP高耐菌株中(MIC≥2μg/m1)可有多达4种PBP(主要是1a、1b、2x、2b)同时发生改变[7]。　　肺炎链球菌是引起社区获得性肺炎的重要致病菌。目前，国内PRSP的发生率在4%左右，明显低于欧洲国家，在亚洲也属于中等水平，且MIC多小于1mg/L，因此，在社区获得性肺部感染病原菌中，PRSP尚不构成严重威胁，青霉素仍可作为shou选治疗药物。但是耐药没有国界，中国日前PRSP发生率尚低.但决不意味着不要重视，而是应该进一步加强PRSP的耐药监测。对于PRSP感染临床治疗推荐使用头孢噻肟/头孢曲松、新喹诺酮类(如司帕沙星)。若属PRSP严重感染则需应用万古霉素或加用利福平。　　2、 DNA拓扑异构酶的改变引起喹诺酮类抗生素耐药　　喹诺酮类药物的作用机制主要是通过抑制DNA拓扑异构酶而抑制DNA的合成，从而发挥抑菌和杀菌作用。细菌DNA拓扑异构酶有I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，喹诺酮类药物的主要作用靶位是拓扑异构酶Ⅱ和拓扑异构酶Ⅳ。拓扑异构酶Ⅱ又称DNA促旋酶，参与DNA超螺旋的形成，拓扑异构酶Ⅳ则参与细菌子代染色质分配到子代细菌中。革兰氏阴性菌中DNA促旋酶是喹诺酮类的第一靶位，而革兰氏阳性菌中拓扑异构酶Ⅳ是第一靶位。　　当编码组成DNA促旋酶的A亚单位和B亚单位及组成拓扑异构酶Ⅳ的parC和parE亚单位中任一亚基的基因发生突变均可引起喹诺酮类的耐药性。在所有的突变型中，以gyrA的突变为主，占80%左右，其次是gyrB、parC和parE突变。在所有这些突变类型中，若Ⅱ型拓扑异构酶上存在2个突变点(如gyrA和parC上)，它们引起对氟喹诺酮类的耐药远远大于只有一个突变点(如gyrA或gyrB上)，前者是后者的3-4倍。同时没有发现突变仅出现在parC基因这一现象。这可能是因为DNA促旋酶是氟喹诺酮类的重要靶位,gyrA亚单位的改变可引起酶结构发生变化致空间位障，阻止喹诺酮类进入喹诺酮类作用区，或引起物理化学变化，干扰喹诺酮与酶的相互作用。这些结果显示gyrA上突变的出现是引起细菌对喹诺酮类发生耐药的主要机制，而parC突变只是进一步引起铜绿假单胞菌对喹诺酮的高度耐药。　　DNA拓扑异构酶的改变是细菌耐喹诺酮类抗菌药的主要机制，其他耐喹诺酮类的机制还包括后面将要谈到的细菌膜通透性改变和主动外排机制。　　三、细胞膜透性屏障和抗生素主动外排泵　　细菌可以通过细胞壁的障碍或细胞膜通透性的改变，形成一道有效屏障，使得抗生素无法进入细胞内并达到作用靶位而发挥抗菌效能，这也是细菌在进化与繁殖过程中形成的一种防卫机制。这类耐药机制是非特异性的，主要见于革兰氏阴性菌。因为革兰氏阴性菌细胞壁粘肽层外面存在着类脂双层组成的外膜，外层为脂多糖，由紧密排列的碳氮分子组成，阻碍了疏水性抗菌药进入菌体内。另外细菌外膜上还存在着多种孔蛋白，分子较大者为OmpF，分子较小者为OmpC，它们可形成特异性通道(OprD)和非特异性的通道(OprF)，作为营养物质和亲水性抗菌药物的通道。抗菌药物分子越大，所带负电荷越多，疏水性越强，则不易通过细菌外膜。细菌发生突变失去某种特异孔蛋白后即可导致细菌耐药性,另外由于外膜蛋白OprF的缺失，使药物不易通过而产生耐药性。如铜绿假单胞菌特异性孔蛋白OprD2缺失即导致碳青霉烯类抗生素耐药。　　另外一种导致细菌非特异性耐药的机制是细菌主动外排泵的存在，可以将进入细菌体内的药物泵出膜外，从而逃避抗生素的作用。主动外排系统由于能特异地将进入细胞内的多种抗菌药物主动泵出细胞外，导致细胞获得耐药性。如大肠埃希氏菌中的多药外排泵AcorAB-TolC系统可以导致细菌对包括四环素、氯霉素、红霉素、β—内酰胺类、利福平、氟喹诺酮类、氧化剂、有机溶剂、碱性染料等多种结构不相关的药物耐药。铜绿假单胞菌的MexAB-OprM系统的主动外排作用也是导致铜绿假单胞菌固有的多重耐药性的重要因素之一。　　细菌的膜耐药机制主要表现在铜绿假单胞菌的多药耐药性。铜绿假单胞菌几乎囊括了包括膜耐药在内的所有细菌耐药机制，其耐药已成为当前感染治疗中较为棘手的问题之一，尤其值得重视和研究。

　　在日常工业过程中，我们都需要测试水质的pH值，即酸碱度。大家都知道弱碱性的水是健康的，什么是弱碱性呢，也就是在25度下，pH在7.1-7.5之间的水就是弱碱性的水。什么是pH值呢，pH值即氢离子活度的负对数，zui简单的方法是用pH试纸来检测，但这种方法不准确，因此现在都用pH电极来检测，不仅方便，还能快速现场检测。　　pH测试的重要性主要体现在以下几个方面：　　化学反应速度　　pH值会影响溶液的化学反应速度，比如在pH值>5时，氢氟酸对玻璃的腐蚀性就没有那么强。　　化学药品的溶解度　　试剂在水中的溶解度也跟溶液的酸碱度有关。　　微生物的生理特性　　不同的pH值，微生物的反应产物也会不一样。比如发酵液的pH值必须严格监控，才能保证成品的质量安全。　　自来水　　我们日常生活中使用的自来水，也必须经过pH检测。国家饮用水规范要求在6.5和8.5之间。　　食品　　毋庸质疑，食品安全是*位的。比如面包的酸碱度必须控制在一个合格的范围，不仅能保证面包松软可口，更重要的是可以保证食用的安全，这才是zui重要的。　　纸张　　在不同的pH值下生产出来的纸张色泽光滑度是不一样的，因此，也必须检测pH值 。　　药品　　同理，制药过程也需要监测pH值。不仅能保证药品质量安全，还能保证药效。

　　细菌鉴定的酶类试验是细菌的生化反应中酶类的存在与否等生化特性，这些反应能够导致反应体系的PH值变化或产生显色物质，加入合适的酸碱指示剂或显色剂就可以反映出来。　　氧化酶试验　　氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化的细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。　　试验方法　　1）菌落法：直接滴加氧化酶试剂于被检菌菌落上；　　2）滤纸法：取洁净滤纸一小块，蘸取菌少许，然后加氧化酶试剂；　　3）试剂纸片法：将滤纸片浸泡于氧化酶试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸上。　　结果判读　　细菌在与试剂接触10s内呈深紫色，为阳性。为保证结果的准确性，分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。　　临床应用及意义　　主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别，前者为阴性，后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。此外，也用于假单胞菌属与肠杆菌科细菌的区别，前者阳性，而后者阴性。产碱杆菌属等均为阳性。　　异常结果： 奈瑟菌属有脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等9种致病菌，引起流行性脑脊髓膜炎　　上呼吸道症状：鼻咽炎等全身感染症状：高热、出血点或瘀血点，脑膜炎症状：头痛、呕吐、颈项强直;引起淋病，引起新生儿淋病性眼结膜炎。　　触酶试验　　触酶又称过氧化氢酶，具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，出现气泡。大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌科阴性，故常用此试验来鉴定。分枝杆菌的鉴别则用耐热触酶试验，结核分枝杆菌为阴性，戈氏分枝杆菌和地分枝杆菌为阳性。　　试验方法　　取洁净玻片1张，用接种环挑取细菌，加3％的H2O2 1滴，立即观察结果。　　结果判读　　若立即出现大量气泡为阳性。无气泡为阴性。　　临床应用及意义　　大多需氧和兼性厌氧菌均产生过氧化氢酶，但链球菌科阴性，故常用此试验来鉴定。此外，金氏杆菌属的细菌也为阴性。分枝杆菌的鉴别则用耐热触酶试验，结核分枝杆菌为阴性，戈氏分枝杆菌和地分枝杆菌为阳性。　　注意事项　　① 试验时应避免接触含铁物质，以免出现假阳性。　　② 10g/L盐酸四甲基对苯二胺或10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液为无色溶液，在空气中易被氧化而失效，故应经常更换新试剂，并盛于棕色瓶中，若试剂已变成深蓝色，应弃去不用。

分离培养基上菌落的生长现象 1.观察菌落：菌落的各种特征包括大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明度和粘度等。 根据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为三型： （1）光滑型（S型）菌落 （2）粗糙型（R型）菌落 （3）粘液型（M型）菌落 2.血琼脂上的溶血 α溶血：又叫草绿色溶血，菌落周围血培养基变为绿色环状；红细胞外形完整无缺。 β溶血：又称完全溶血，红细胞的溶解在菌落周围形成一个完全清晰透明的环。 γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化；红细胞没有溶解或无缺损。 双环：在菌落周围完全溶解的晕圈外有一个部分溶血的第二圆圈。如产气荚膜梭菌。 3.气味：通过某些细菌在平皿培养基上代谢活动产生的气味，结合液体培养基上的性状，有助于细菌的鉴定。如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦气味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、放线菌（泥土味）等。 4.色素 脂溶性色素：使菌落本身出现颜色改变。如金黄se葡萄球菌的金黄色色素。 水溶性色素：使菌落周围的培养基出现颜色变化。如铜绿假单胞菌的铜绿色色素。

　　培养基的成分包括:碳源、氮源、矿物质,以及其他必需物质。这些成分通过生物反应过程，生成生物物质、生物化工产品，并放出CO2、H2O和热量。 培养基的成分还可以由发酵过程中所需的元素出发，如C、H、O、N、S、P、Mg、K等。此外,必要时还有一些需要量很少的微量元素,如Fe、Zn、Cu、Mn、Co、Mo、B等。在发酵过程中某些生物本身不能合成的物质，如氨基酸、维生素或核苷酸等，必要时亦作为营养物质加入到培养基中。　　碳源　　具有双重作用。生物在产生生物物质或生物化工产品过程中，它不仅为其提供碳源，也为其提供能源。碳水化合物是微生物发酵中的主要碳源，包括淀粉、葡萄糖、蔗糖和乳糖等。此外，植物油如豆油、棉籽油、玉米油等亦常被应用作为碳源。这类油常与表面活性剂合用，以消除发酵过程中所产生的泡沫。甲醇可用以生产单细胞蛋白。正烷烃类可用以生产有机酸、氨基酸和维生素等，甚至二氧化碳也可作为光合细菌的碳源。　　氮源　　包括无机氮源和有机氮源。无机氮源包括氨、铵盐及硝酸盐等，它们在被应用时应注意发酵中pH的变化；有机氮源包括氨基酸、蛋白质及尿素等，有机氮源的加入往往加快了生物的生长。因考虑到成本因素，一些有机氮源，如黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、鱼粉、酵母粉等常被选用。　　培养基的组成中除了水分外，碳源和氮源的含量是最大的。碳源含量一般不超过10%，氮源含量较低，一般碳氮比应为3～4:1。碳、氮源含量不能过高的原因是避免产生基质或产物对反应的抑制和因渗透压过高引起细胞失水而死亡。　　矿物质　　培养基中 Mg、P、K、S、Ca、Cl常是主要的矿物质的组成成分，其他如Co、Cu、Fe、Mn、Mo及Zn也往往不可少，但需要量很小，可从其他主要培养基成分中得到。如是使用合成培养基就需要把这些微量元素加进去。它们不仅为生物生长所必需，也是为了得到某些产物所必不可少者。例如生物合成青霉素或头孢菌素需要一定量的硫；生物合成维生素B12需要一定量的钴。　　维生素　　某些生物在培养过程中需要某些维生素，往往在天然培养基中已经提供了必要的维生素，但在某些特殊情况下需单独加入维生素。例如在谷氨酸生产过程中需加入生物素,某些植物细胞培养中需要硫胺素(维生素B1)。

传统检测有三种方法：1、直接显微镜观察，正常情况，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度以及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。可以通过显微镜观察菌落特征对微生物种类进行判断。2、选择培养基培养微生物或人为提供有利于目的菌株生长的条件，选择培养基，其作用是允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长。选择培养一般是通过观察微生物的同化作用类型或某一特征进行间接判断，得到的微生物往往并不只有一种，但是能够大致确定这些微生物存在的共有特征从而对其分类。3、鉴别培养基，根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品。与选择培养相比，鉴别培养基的鉴别所得结果的范围比较小，一般可直接测定某微生物的种类。现代定义微生物：个体难以用肉眼观察的一切微小生物之统称。微生物包括细菌、病毒、真菌、和少数藻类等。（但有些微生物是肉眼可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等。）病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”，但是它的生存必须依赖于活细胞。根据存在的不同环境分为空间微生物、海洋微生物等，按照细胞机构分类分为原核微生物和真核微生物。主要特征1、体小面大2、吸多转快3、生长繁殖快微生物的这一特性使其在工业上有广泛的应用，如发酵、单细胞蛋白等。微生物是人类不可或缺的好朋友。

以光合细菌培养方法为例光合细菌培养的方法，按次序分为容器、工具的消毒，培养基的制备，接种和培养管理四个步骤。（一）容器、工具的消毒参考、此处从略。（二）培养基的制备1．培养用水如果培养的光合细菌是淡水种，菌种培养可用蒸馏水，生产培养可用消毒的自来水（或井水）配制。如果培养的光合细菌是海水种，则用天然海水配制培养基，注意在海水中加入磷元素时，不能用磷酸氢二钾，应用磷酸二氢钾，不然会产生大量沉淀。2．灭菌和消毒菌种培养用的培养基应连同培养容器用高压蒸气灭菌锅灭菌。小型生产性培养可把配好的培养液用普通铝锅或大型三角烧瓶煮沸消毒。大型生产性培养则把经沉淀砂滤后的水用漂白粉（或漂白液）消毒后使用。3．培养基配制根据所培养种类的营养需要选择合适的培养基配方。按培养基配方把所需物质称量，逐一溶解，混合，配成培养基。也可先配成母液，使用时按比例加入一定的量即可。（三）接种培养基配好后，应立即进行接种。光合细菌生产性培养的按种量比较高，一般为20%～50%，即菌种母液量和新配培养液虽之比为1∶4～1∶1，不应低于20%，尤其是微气培养，接种量更应高些，否则光合细菌在培养液中很难占绝对优势，影响培养的最终产量和质量。（四）培养管理光合细菌的培养过程中，管理工作包括日常管理操作和测试，生长情况的观察、检查以及出现问题的分析处理等三个方面。

细胞培养实验室发生支原体污染的风险较高。支原体天然存在于周围空气（气溶胶形式）、人的体表（携带和隐藏）以及未彻底消毒的器物表面，而细胞培养基中由于含有血清，营养丰富，很容易导致支原体的快速繁殖。支原体的污染肉眼不易察觉，直到严重的阶段才会出现培养基变色、细胞异常等情况。支原体可造成细胞代谢改变，基因表达谱发生变化，从而严重干扰实验进程。因此，在细胞培养过程中，定期监测是否存在支原体污染，及时预防支原体污染是每个科研人员的工作之一。为防止支原体污染细胞，可采取以下措施：1、保持无菌技术：始终在无菌环境中工作，使用适当的个人防护设备，例如手套和实验室外套，定期对实验室进行清洁，可以使用支原体祛除试剂：Mycoplasma-off，无需配制，即喷即用；Water Shield可用于水槽、水浴锅等处的支原体祛除和预防。保持良好的实验室卫生：保持实验室清洁和维护良好，包括设备和表面。2、使用无支原体细胞系：建议从信誉良好的供应商提供的无支原体细胞系开始。3、定期检测支原体：定期检测细胞培养物是否存在支原体污染至关重要。可以使用各种测试，包括基于 PCR 的方法、荧光染色和 ELISA。4、避免交叉污染：保持细胞培养分离，避免交叉污染。正确标记和处理细胞系。通过采取这些措施，可以降低支原体污染的风险，并保持基于细胞的实验的完整性和可靠性。

原代细胞是指从机体的组织（如人组织、小鼠组织、大鼠组织和兔组织等）经蛋白酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体培养的 细胞，称为原代细胞。一股认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细抱培养。在人工条件下使其原代细胞生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞疡变、细胞工程等问题的研究。那么关于原代细胞的传代培养，我们应该怎么做呢?一股有以下两种方法：一、贴壁细胞的消化法传代1、吸除或倒掉瓶内旧培养液。2、加入1ml左右消化液（胰蛋白鳄或与EDTA混合液）轻轻接动培养瓶，使瓶底细胞都浸入溶液中.3、消化2-5分钟后把培养瓶放置在显微镜下进行观察，发现原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时，弃去消化液，加入培养液终止消化。4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中继续培养.第二天观察贴壁生长情况。二、悬浮细胞的传代1、直接传代①让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸掉1/2-2/3。②用吸管吹打形成细胞悬液后，分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中培养。2、离心法传代①将细胞连同培养液一并转移到离心管内，离心800-1 OOOrpm, 5分钟。②去除上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液。③将细胞悬液分别接种到另外两到三个培养瓶中，置37℃培养箱中培养。

1 检验目的做疾病的病原学诊断，查找于疾病有关的病原菌以及了解与疾病的关系，指导临床治疗及预后和流行病学的调查。2 原理人体很多部位与外界相通，存在栖息菌群，但不致病，当菌群失调或分离到致病菌则具有临床意义；另外机体某些部位是无菌的，如检出则视为致病菌。并排除采样及操作污染。3 标本要求（1）标本类型：，骨髓，脑脊液，胸水，腹水，尿液，等；痰液，前列腺液，脓液，组织分泌物或穿刺液等。（2）标本采集：见标本采集手册（3）标本储存和运输：室温放置，室温运输并立即送检。人泌尿生殖道标本如白带前列腺液等需临床标本接种于巧克力平板或特殊的运送培养基并置保温设备中送检。（4）标本拒收状态：非无菌方式采集的标本或未按要求部位采取的标本。4 容器和添加剂类型均使用灭菌器皿盛放标本5 试剂（1）试剂名称：革兰氏染液、氧化酶试剂、3%触酶、血平板、麦康凯平板、相关试剂等（2）试剂生产厂家：上海远慕生物科技有限公司6 设备：（1）接种针、接种环、酒精灯、（2）BACT-IST微生物鉴定系统。（3）、GNP-P270隔水式恒温培养箱、SW-CJ-IF超净工作台、MCO-15A三洋牌二氧化碳培养箱、0414-1台式、FA1004电子天平7 操作步骤（1）血液、骨髓、脑脊液等标本按照培养目的增菌培养12-18小时后盲目接种或待自动分析仪报警后接种。（2）接种：以上增菌标本及其他临床标本用接种环取标本接种环划线血平板及其他选择性培养基上,35℃培养过夜，观察结果。（3）涂片：肉眼见细菌生长，取生长物涂片做革兰氏染色；（4）纯培养：根据需要接种血平板、巧克力、中国蓝/麦康凯或厌氧平板过夜培养以获得纯培养。（5）鉴定：按照鉴定仪要求调配菌液浓度8 生物参考区间血液，骨髓，脑脊液等无菌部位采取的标本未见细菌生长；其他标本如大便，痰液为正常菌群或未见致病菌。9患者检验结果的可报告区间细菌鉴定到种或属；菌群调查报告比例。10 临床意义：为医生提供病原学诊断，并为进一步药敏实验提供依据。

1．生化鉴定是细菌鉴定中最重要的一种，主要是借助细菌对营养物质分解能力的不同及其代谢产物的差异对细菌进行鉴定，包括蛋白质分解产物试验、触酶试验、糖分解产物试验、氧化酶试验、凝固酶试验等。2．血清学鉴定适用于含较多血清型的细菌，常用方法是玻片凝集试验，并可用免疫荧光法、协同凝集试验、对流免疫电泳、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验等方法快速、灵敏地检测样本中致病菌的特异性抗原。用已知抗体检测未知抗原（待检测的细菌），或用已知抗原检测患者血清中的相应抗细菌抗体及其效价。血清学鉴定操作简单快速，特异性高，可在生化鉴定基础上为细菌鉴定提供确定诊断。3．分子生物学检测适用于人工培养基不能生长、生长缓慢及营养要求高不易培养的细菌，检测方法包括核酸扩增技术、核酸杂交、生物芯片及基因测序等。常见的核酸扩增技术有聚合酶链反应、连接酶链反应等，主要用于耐甲氧西林、结核分枝杆菌等病原菌的检测。核酸杂交有斑点杂交、原位杂交等，用于致病性大肠埃希菌、沙门菌、空肠弯曲菌等致病菌的检测。生物芯片包括基因芯片和蛋白质芯片，主要是对基因、蛋白质、细胞及其他生物进行大信息量分析的检测技术。4．微生物自动鉴定系统鉴定可快速、准确地对临床近千种常见分离菌进行鉴定，目前已在临床实验室广泛使用。其中，细菌16S rRNA编码基因已成为较理想的基因分离靶序列，逐渐成为临床细菌鉴定、分离的金标准。5．质谱技术是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，用于分析细菌的化学分类和鉴定，具有高灵敏度和高质量检测范围的优点。主要是对核酸、蛋白质、多肽等生物大分子串联质谱进行分析。

使用培养箱注意一些技术细节：（1） 培养箱应由专人负责管理，操作盘上的任何开关和调节旋扭一旦固定后，不要随意扭动，以免影响箱内温度，CO2、湿度的波动，同时降低机器的灵敏度。（2） 所加入的水必须是蒸馏水或无离子水，防止矿物质储积在水箱内产生腐蚀作用。每年必须换一次水。经常检查箱内水是否够。（3） 箱内应定期用消毒液擦洗消毒，搁板可取出清洗消毒，防止其它微生物污染，导致实验失败。（4） 定期检查超温安全装置，以防超温。方法为按进监测报警按扭，转动固定螺丝，直到超温报警装置响，然后关闭超温安全灯。（5） 如长期不使用二氧化碳时，应将CO2开关关闭，防止CO2调节器失灵。（6） 所使用的CO2必须的纯净的，否则降低CO2传感器的灵敏度和污染CO2过滤装置。（7） 在无湿度控制的培养箱内，为保持箱内CO2 的稳定，要在箱内底层放入一个盛水的容器。

一）免疫组化染色假阳性及其对策1、消除内源酶的影响在涉及免疫过氧化酶的各种染色中，均用过氧化物酶来标记抗体，酶的作用是催化底物，使显色剂显色，正常组织中也含有一定量的过氧化物酶，其同样也能催化底物显色，而影响免疫组化染色的特异性，因此在加入标记酶前应设法将其灭活，以保证染色反应的特异性。通常情况下，去除内源酶的方法是先用3%的过氧化氢溶液作用，但在含有丰富血细胞的标本中，由于血细胞中存在大量具有活性的过氧化物酶，能与过氧化氢产生强烈的反应，产生气泡而破坏组织结构和细胞形态。在OCT包埋的冰冻切片中，使用3%的过氧化氢化溶液亦会产生类似现象。此时可用3%的过氧化氢甲醇溶液孵育20分钟的方法灭活内源性酶。灭活内源酶对正确判断含血细胞较多的标本，如骨髓、胎盘、脾等的染色结果十分重要。同样，正常细胞也含生物素，尤以肝、脾、肾组织含量为多。在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合后继抗体，形成亲和素（或链亲合素）-生物素复合物，导致假阳性发生。消除这种非特异性着色的方法，是在采用生物素方法染色前，对标本进行亲和素处理，使其结合位点饱和。2、抗体导致的非特异性着色高纯度、高效价的抗体是免疫组化染色的关键。出现下列情况时，可能发生非特异性着色。（1）因抗原不纯而导致制备的抗体不纯，常见于多克隆抗体。可用亲和层析的方法除去非特异性抗体或应用高纯度的抗原制备抗体，采用单克隆抗体能避免非特异着色。（2）标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇，解决的方法只有采用针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体。3、消除非特异性背景着色非特异性着色最常见的情况是蛋白质（抗体）吸附到组织切片中高度荷电的胶原及结缔组织成分上，防止非特异性背景着色的方法之一是在滴加一抗前在标本上加一种无关的蛋白质溶液，封闭荷电点不给一抗留有吸附余地，以保证一抗不会吸附到胶原纤维及结缔组织成分上。最常用的无关蛋白质溶液是所用二抗的同种动物非免疫血清。用产生二抗的同种动物血清，是为了避免二抗与预先加入的蛋白质结合引起假阳性染色。用来阻断非特异性结合的血清不能有任何溶血现象。红细胞破裂会使其中的过氧化酶与底物作用，产生非抗原特异性的阳性着色。多克隆抗体因其成分复杂，更易造成背景染色。稀释液采用含1%BASpH7.4的PBS,同时在洗液中加入0.05%的吐温20（Tween20）有助于消除背景染色。4、消除病理性色素的影响当所检动物由于出血等原因造成吞噬含铁血黄素细胞增多时，为防止其与DAB显色呈现的黄褐色发生混淆，最好选用AEC显色剂。组织固定时间过长时，切片中容易产生福尔马林色素颗粒，影响结果观察，取材时应充分用流水冲洗，以消除影响。5、切片制作不当引起的非特异性着色在严重变性、坏死及炎性病灶处，在胶原纤维和结缔组织部位，在切片裱贴不平、折皱处以及组织边缘部位常会出现非特异性着色。其中有的是因组织荷电状态改变而吸附抗体；有的机理不明；有的可能与组织边缘或皱折深部的槽形构型有关，解决的办法是在滴加一抗前，以二抗动物的正常血清（5%~10%）封闭、饱和电荷吸附位点和改善取材与制片技术。6、清洗不充分而造成的非特异性着色应严格操作规程。缓冲液中含一定量的盐，其有利于减低背景着色，通常使用0.05mlo/LPBS,溶液内加入吐温20,效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。另外，在清洗后至加入下一步试剂前，不能干片，干片的部位会出现非特异着色。7、DBA显色产生的某些背景颜色使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸镏水的pH值，以确保实验结果的正确性。粉剂DBA溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去。否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H2O2.（二）免疫组化染色的假阴性及其对策通常可因标本抗原保存，试剂质量及染色操作等因素引起假阴性。1、组织处理不当固定不及时或固定时间过长常导致抗原丢失。浸蜡温度过高，时间过长将破坏抗原的抗原性。应改善技术条件，重新取材。2、抗原修复由于目前所进行的常规石蜡切片标本均用甲醛固定，所形成的醛健、羧甲键等封闭了部分抗原决定簇，或由于蛋白之间发交联而使抗原决定簇隐蔽，因此在染色时，有些抗原需要先进行抗原修复或暴露。至于哪种抗原需要进行修复，需在建立染色程序时经实验确定。抗原修复分为化学方法和物理/化学方法。（1）化学方法：主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等。需根据需要使用。（2）物理/化学方法：主要有以下几种①单纯加热方法：将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的容器中，加热至沸腾，并持续10~15分钟，此方法操作简单、经济，适用于所有实验室，但对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。②高压加热方法：将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的高压锅中，加热至喷气，并持续1~2分钟。③微波方法：将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，并持续10~15分钟，室温20~30分钟自然晾凉，使蛋白复性。此方法不仅利用热效应，且可通过微波的直接作用，打开蛋白之间的交联键，将已被封闭的抗原决定簇暴露和修复。3、一抗的选用、稀释度及孵育时间第一抗体是免疫组化染色中最重要的试剂。应用何种一抗，应根据具体目的和要求决定。临床病原诊断，要求较高的敏感性和较广的识别谱时，可选用多克隆抗体或几株混合的单克隆抗体，来避免抗体反应谱过窄造成的假阴性。某些研究工作需要检测单一抗原决定簇的存在，此时必须选用单克隆抗体。一抗的参考稀释度常由“方格滴定”和相关检测结果推测得出，但因实验条件不同，对抗原活性的影响不同，最佳稀释度仍需经过摸索。任何一个抗体，其工作稀释度取决于如下因素：（1）抗体的滴度即特异性抗体浓度；（2）抗体的纯度，即抗体中杂蛋白的浓度。杂蛋白较高时，需要较高的稀释度；（3）孵育的时间，时间越长，所用的抗体稀释倍数越高；（4）组织中抗原含量对抗体的应用浓度有不同的要求。在免疫反应中，过多的抗体将导致阴性结果，这种现象类似于凝集反应中的前带现象。因此需用“方格滴定”的方法找出适当的稀释度，并得到最大强度的抗原染色和最低的背景着色。一般认为，某一稀释度下特异性染色较强且无背景着色，是较理想的稀释度，加长孵育时间可有效地降低所用抗体的浓度，有利于提高染色质量，节省抗体，可用37℃0.5h或4℃过夜的方法。只要控制好温度、抗体稀释度和孵育时间，一般都能得到理想的染色效果。4、选择适宜的二抗二抗应用中常出现的总是是抗体本身与一抗不匹配，如抗兔的二抗，匹配鼠来源的一抗；或以抗鼠的二抗匹配兔来源的一抗，都会出现假阴性结果。5、试剂造成的影响酶的活性降低，缓冲液内加有叠氮钠抑制了酶活性，底物中所加H2O2量少或失效，操作中漏加了某种试剂等，都会造成假阴性结果。如阳性对照不成立，则需认真检查操作程序，查找可能的原因。

①选择合适的出发质粒出发质粒也叫亲本质粒，它应含有质粒克隆载体bi备的元件，如复制起始位点、选择标记基因、克隆位点、启动子和终止子等。②正确获得构建质粒克隆载体的元件一般采用限制性核酸内切酶切割出质粒DNA分子，获得含有某种元件的DNA片段，还可以采用PCR技术从靶DNA中扩增出含某种元件的特异性DNA片段。③组装合适的选择标记基因构建的质粒克隆载体应该组装什么样的选择标记基因，必须根据要转化的受体细胞的特性来决定。④选择合适的启动子为了构建表达质粒的克隆载体，必须组装合适的启动子，当设计真核生物的基因须在原核生物中表达式，常改用原核生物或病毒(噬菌体)基因的启动子，而原核生物基因在真核细胞中表达时，仍可用原核生物基因的启动子。

该实验主要有两个用途：1．重组质粒的鉴定。当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因，一旦重组成功，质粒环化（包括自身环化），抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抗相应抗生素的能力，可以含该抗生素的培养基中生长传代，不然，重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。2.为扩增质粒和其它载体作准备。由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20~30分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝，因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。（作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过的工程菌。）实验原理本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重组质粒，产生5×106~2×107个转化的菌落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在42℃的温度时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入LB培养液，于37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。实验准备一．器材天平、秤量匙、秤量皿加热磁力搅拌器、搅拌子可调移液器P1000、P200、P20及其经消毒的盒装蓝、黄吸头经消毒的1.5ml Eppendorf管、试管架及其水浴用试管架定时器、记号笔、一次性手套和筒纸42℃恒温水浴4℃和-70℃冰箱煤气灯或酒精灯恒温培养摇床（调至37℃，225rpm）37℃培养箱玻璃涂棒（普通玻璃吸管，细头部在煤气灯上烧成“L”形）消毒过的洁净培养皿（直径10cm）二．试剂LB培养基细菌培养用胰化蛋白胨10g细菌培养用酵母提取物5gNaCl 5g加800ml水，放入磁力搅拌棒，在磁力搅拌器上搅拌至彻底溶解，用5M NaOH（约0.2 ml）调节pH值至7.0，加水定容至1000 ml。高压15 lbf/in2（1.034×105pa）消毒30分钟，冷却后可加入氨苄青霉素（50mg/ml）500ul，视载体特性而定，混匀，即为含抗生素的LB培养液。存放于避光处。含有琼脂的培养基即在以上1000ml培养基中加入15g细菌培养用琼脂。抗生素琼脂平板待含有琼脂的培养基冷却后，加入抗生素，倾入培养皿，约30~50 ml，用煤气灯火焰掠过培养基表面，以消除气泡。冷却后，标记，封于塑料袋中，倒置，于4℃冰箱内避光保存。pH试纸（或pH计）三．实验材料来源于实验一的重组质粒受感态大肠杆菌碎冰及碎冰保温盛器实验步骤自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约15分钟，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。细菌50 ulDNA 5 ul轻轻混匀，静置冰上30分钟。于42℃水浴中热休克细菌45秒，迅速移入湿冰中，静置2分钟，加入900ul LB培养液，放入37℃恒温箱摇床，225rpm摇晃培养1小时。取50ul涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜。次日，检查各培养皿中是否出现菌落。实验结果转化成功，培养皿中可见散在的菌落。转化失败，培养皿上无菌落，或菌落布满如苔样，后者提示可能是抗生素浓度不够或失效。

目前中国药典、消毒技术规范中用于各种化学消毒剂、干热、环氧乙烷、高压蒸汽等灭菌效果的验证和评价的芽胞悬液的获得主要通过自制和商品化两种途径。一、自制芽胞悬液(1) 菌种处理：取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5～10ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18～24小时。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18～24小时。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，于37℃培养18～24小时，即为第3代培养物。(2) 转种固体培养基：用10.0ml吸管吸取5.0～10.0ml第3～5代的18～24小时营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面，再将多余肉汤培养物吸出，将罗氏瓶置于37℃温箱内，培养5～7天。(3) 观察芽胞形成：用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽胞染色法染色，并在显微镜(油镜)下进行镜检。当芽胞形成率达95％以上时，即可进行以下处理。否则，应继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽胞形成率后再进行以下处理。改良芽胞染色法：①用接种环取菌样涂布于玻片上，待自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。②将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的5.0％孔雀绿水溶液。将平皿盖好，放54℃～56℃条件下，加热30分钟。取出。去滤纸，用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。③加0.5％沙黄水溶液，染1分钟。水洗，待干后镜检。芽胞呈绿色，菌体呈红色。(4) 制成芽胞悬液：罗氏瓶培养物，用10.0ml吸管加10.0ml无菌蒸馏水于每一罗氏瓶中，以L棒轻轻推刮下菌苔。吸出第1批洗下的菌悬液，再向瓶内吸加5.0ml无菌蒸馏水，重复洗菌一遍。将第1和第2批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇5分钟，打碎菌块，使成均匀的芽胞悬液。（注意：必要时，将盛装菌悬液的三角烧瓶置45℃水浴中24小时，使菌自溶断链。分散成单个芽胞。）(5)纯化芽胞液：用无菌棉花或纱布过滤芽胞悬液，清除其中的琼脂凝块。将过滤后的芽胞悬液，置无菌离心管内，以3000转／分速度离心30分钟。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽胞重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，先后共3遍。将洗净的芽胞悬浮于三角烧瓶内蒸馏水中，并加入适量小玻璃珠。将芽胞液放于80℃水浴中10分钟(或60℃，30分钟)，以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，保存于4℃冰箱中备用。有效使用期为半年。(6)芽胞悬液在使用时，应用平板法先进行活菌培养计数。怀疑有杂菌污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。二、商品化芽胞悬液HKM™定量芽胞悬液（菌种名称：萎缩芽孢杆菌（曾用名：枯草芽孢杆菌黑色变种）ATCC9372）产品介绍：该芽胞悬液是根据国际通用标准菌株ATCC9372，参照国家药典、消毒技术规范、相关标准等，经严格质量控制制备而成。该菌株悬液含有一定数量的芽胞，用于自制生物指示剂应用于各种化学消毒剂、干热、环氧乙烷等灭菌效果的验证和评价，无菌冷灌装生产线的性能验证，染菌载体的制备以及生物安全柜灭菌效果的验证等。也可用于直接培养等。

微生物实验室如果从事致病菌检测、培养基质控验收、方法验证等相关工作，就应该备有质控菌株。实验室需对使用的质控菌株进行规范性管理，以便有效地、安全地使用，保证实验结果的准确性，今天远慕生物为大家总结了实验室质控菌株复苏保存过程中常见的问题。1. 菌株保存的是第三代，-80℃保存，再取出来活化的话属于第几代？答：保存的是第三代复活出来后，如果采用平板或肉汤活化相当于转接了一代，就是第四代了，如果还在瓷珠里的话就还是原来的代数。如果是保存在斜面上，这一支斜面一直就是第三代，如果转接到另一支斜面就是第四代了。传代原则，菌株活化复苏不论以任何形式繁殖了一次就算是传了一代。但如果仅是物理位置的转移没有繁殖就不是传代，需要注意。2. 菌株传代保存到瓷珠里一定要挑单菌落吗？答：不一定非挑单菌落，但是一定要挑相同特征的菌落，就是说从同一个菌落纯化出来的，以保证它们的特性完全一致。原则是尽量多挑，宁多勿少。3. 菌株冷冻保存是-70℃还是-80℃有具体标准规定么？答：其实是有标准的，《SN/T 2632-2010 微生物菌株常规保藏技术规程》是关于菌株保藏的一个标准，大家可以学习一下，各个保存方式都有介绍，但是瓷珠是比较新兴的保存方式暂时里面还没有收录。4. 怎样延长质控菌株的保存时间呢？答：大量的实验证明质控菌株在低温、干燥、缺氧、缺营养的条件下保存效果是最好的，越接近这种保存条件，菌株的保存时间越长。5. 怎样纯化质控菌株？答：纯化就是从TSA上或别的非选择性平板上转挑取单菌落划线再分离出单菌落，这就相当于纯化了。6. 我们只保存第一代菌株是不是要重新传代保存呢，认证老师会不会认为这是个错误？答：应该不会，认证老师不会提出这种问题的，不过最好是第一代菌株保存一些、第二代菌株保存一些，使用时工作菌株最好使用第三代菌株，第一代菌株可作为长期保存用。7. 为何要将第三代作为工作菌株？答：多传代几次后菌株的活力会明显提高，但最多传代到第五代后就不能用了，因为第五代后菌株虽然不会完全变异，但变异率会明显增加，因此选用第三代作为工作菌株是比较合适的，若使用第一、第二代菌株活力没有那么强。8. 质控菌株是不是传代超过五代就必须销毁处理？答：不一定。传代超过五代只是存在菌种变异可能，但如果传代到第六代、第七代……，经过形态、生化特性、DNA特征等验证，性状保持稳定，那么这些五代后的菌还是可以正常使用。9. 菌种编号意义？答：以金黄se葡萄球菌CMCC（B）26003为例CMCC为中国医学菌种保藏中心缩写，其它常见菌种保藏中心还包括ATCC（美国标准菌种收藏所）、CICC（工业微生物菌种保藏中心）、FSCC（食品安全菌种保藏中心）；B的意思是细菌，对应还有F（真菌）；26003为CMCC的保藏编号。10. 同样是金黄se葡萄球菌，ATCC6538与ATCC25923有什么不同？表明其来源不同，生化特性有也有所不同。比如ATCC6538溶血能力较ATCC25923要强。11. 使用磁珠保藏管保存质控菌株，加入菌液摇匀后为什么要吸干菌液？防止剩余菌液冷冻后形成冰晶损伤保存的菌株。12. TSA斜面一般多少度保存，可以放在冷藏里吗？2-8℃保存，放在冷藏是可以的；注意弧菌和绿脓杆菌要放到室温20-25℃保存，否则会很快死亡。13. 复苏冻干质控菌株是否可以采用液体培养基？答：可以，但建议使用平板培养基复苏冻干菌株。有助于分辨复苏出来菌株是否有污染，同时可初步观察菌落形态以鉴定菌株纯度。使用液体复苏的话只能观察到培养基混浊，无法确定是否有污染。14. 复苏冻干质控菌株是否可以采用显色培养基？答：不建议采用显色培养基复苏冻干菌株。冻干菌株复苏需要一个最适生长环境，复苏培养基不能选用选择性培养基或显色培养基，这些培养基里面含有抑菌成分不利于菌株复苏。15. 产气荚膜梭菌做冻存时是否需要保持厌氧状态？答：不需要，产气荚膜梭菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度要求并不太严格，按照一般菌株冻存方法进行冻存即可。

相对定量相对定量得到的结果为特定样本中目的基因相对于另一参照样本的量的变化。在某些不需要对基因进行绝对定量，只需要确定基因相对表达差异的情况下，如某样品在经过某种处理后目的基因表达量是增加了还是减少了，用相对定量的方法就可以得到结果，相对定量是一种更普遍、更简单的方法。内参基因实验操作中，由于选取样品时，其细胞个数不可能完全相同、RNA提取的得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研究中需要使用内参基因来标准化样品，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。相对定量就是通过检测目的基因相对于内参基因的表达变化来实现定量的。内参基因是在各种生理条件下表达量恒定的基因，这些基因也常被称为看家基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作内参照，常用的内参基因有GAPDH基因、β-Actin基因、18S rRNA基因等。内参基因需满足：在研究样本之间的表达是相似的；处理因素不会影响其表达；与待测基因同时进行相同的PCR扩增。尽管在大多数情况下内参基因的表达非常稳定，但是其表达在某些情况下也会发生变化，并不是任何内参基因都适合任何实验。在选择内参基因时，应仔细考虑各种因素，选择合适的内参基因或内参基因组合。基因表达变化倍数计算方法比较Ct法是运用数学公式来计算基因表达的相对变化量，用该方法进行基因表达定量时，来自于同一样品的目的基因和内参基因都要进行Real-Time qPCR反应，定量的结果由目的基因与内参基因Ct之间的差值来反应。该方法除了使用内参基因以外，还使用了参照样品，使得能够比较机体的不同组织或不同实验处理组之间的基因表达变化。使用该方法的前提条件是目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为1，但是内参基因毕竟与目的基因存在较大的异源性，所以在反应过程中会出现扩增效率不一致的问题。在Real-time qPCR实验开始之前必须分别对目的基因和内参基因绘制标准曲线，比较两者扩增效率的差别，假如两者扩增效率之间的差异小于0.1，就可以用该方法分析。扩增效率测定相对定量的标准曲线绘制方法与绝对定量基本相似，不同之处是绝对定量中只用构建目的基因的标准曲线，而且用于构建标准曲线的标准品的量是预先已知的，而相对定量中需要同时构建目的基因和内参基因两条标准曲线，并且相对定量中所用的标准品不需已知其准确的拷贝数或浓度。该方法的第一步是制备标准品，通常选择提取得到的浓度较高的待测样品RNA即可，将其反转为cDNA后，进行连续的5倍或10倍梯度稀释，得到5～6个用于绘制标准曲线的梯度稀释样品。第二步就是分别用梯度稀释标准品绘制目的基因和内参基因的标准曲线，然后根据标准曲线计算目的基因和内参基因的扩增效率。参照样品的选择根据不同的实验类型，具有以下3种情况：某处理方法对基因表达的影响，将未处理的样本作为参照样本；检测基因在不同时间的表达差异，将0时刻的样本作为参照样本；比较基因在不同组织中的表达差异，人为选定一个组织作为参照样本。

　　在理论研究中，营养缺陷型不仅被广泛应用于阐明微生物代谢途径上，而且在遗传学的研究中具有特殊的地位。在转化、转导、原生质体融合、质粒和转座因子等遗传学研究中，营养缺陷型是常用的标菌种。此外，营养缺陷型菌株还是研究基因的结构与功能常用的材料。　　在生产实践中，营养缺陷型可以用来切断代谢途径，以积累中间代谢产物；也可以阻断某一分支代谢途径，从而积累具有共同前体的另一分支代谢产物；营养缺陷型还能解除代谢的反馈调节机制，以积累合成代谢中某一末端产物或者中间产物；也可将营养缺陷型菌株作为生产菌株杂交、重组育种的遗传标记。营养缺陷型菌株广泛应用于核苷酸及氨基酸等产品的生产。　　1、阻断代谢途径，积累中间代谢产物。　　2、阻断分支代谢，改变代谢方向，积累另一终端代谢产物。　　3、解除反馈抑制，积累代谢产物。　　4、利用渗漏缺陷型进行代谢调控育种。

细胞培养技术已经成为当今生命科学各领域的基础技术和基本技能，它也是细胞工程、基因工程和生物医学工程的重要研究手段。那我们在实际的动物细胞培养实验中需要注意哪些基本要求呢？1、实验前准备实验前必须分门别类地制订操作卡片，如清洗卡、消毒卡、细胞常用液（细胞培养液、BSS液、消化液）配制卡、牛血清检测分装卡、细胞原代和传代操作卡等。各卡片上注明实验所需器材的名称、规格、数量、操作要领和实验注意事项等。实验前应按卡片收集、清点所需用品，一并放入超净台内，这样可避免操作时因物品不全而往返拿取所浩成的污染。同时，根据每个实验的要求，准备好瓶管支架器械消毒盒等。实验器材准数要大于实验使用数，瓶盖数要大于瓶数。这样才能有条不紊地做实验，也减少了忙乱操作所引起的污染。2、无菌室和操作室消毒无菌室内每周用乳酸蒸气（或过氧乙酸）加紫外线消毒1~2次。实验前，将实验器材放入超净台内，打开超净台紫外线灯，同时启动超净台风机，40 min后消毒完毕，关闭紫外线灯。这样，超净台内空气被净化，超净台面构成相对无菌的环境。3、无菌操作要求①手指不能触及器材使用端。如触及，器材需更换或烧灼后再使用（如瓶口）。②减少手与器材的接触面，学会手指操作。③一切操作，如打开或封闭瓶口，安装吸管、注射器等，都要在火焰前方进行。瓶口、吸管、注射器使用前要经过火焰消毒后使用。④瓶口顺风斜放在支架上。试剂用后立即封闭瓶口。瓶口长时间敞开会增加落菌的机会。⑤不同的细胞同时操作时，要专管专用，并要勤换吸管，防止扩大污染和交叉污染。⑥瓶口液滴不能倒回瓶内。液滴用干酒精棉球擦拭，瓶口再经火焰消毒。⑦操作者动作要准确敏捷，尽量避免空气流动。4、实验中操作要求洗手、着装与外科临床要求相同。双手用肥皂洗净后浸泡于消毒液中，并用75%的酒精擦拭。细胞培养用液从冰箱取出，试剂瓶口和外壁经洒精外布擦洗后人超净台，超净台面要用酒精纱布擦拭。超净台上的物品面布局合理，污染废液缸、酒精棉球缸在右侧位，酒精灯在中央位，试剂瓶在左侧位。拆除大包装，点燃洒精灯（95%洒精）、火焰无色或微黄色表示酒精杂质少，酒精燃烧wan全（不能使用废酒精或工业酒精，这类酒精燃烧时产生的化学物质易附着到吸管或其他瓶、皿上，带入培养液中会伤害细胞）。浸泡75%酒精中的金属器械用台面消毒镊子取出，经无菌干纱布擦拭后，迅速通过火焰（器械不能在火焰中灼烧过长时间），冷却后使用，避免烫伤细胞。细胞培养液、牛血清、酶液的吸管，使用后不能再用火焰消毒，因为吸管中残留的培养液被烧焦碳化，再使用时，会把有害碳化物带入培养液中毒害细胞。操作中手指被污染时，可用酒精纱布或棉球擦拭。在实验过程中，不要面向操作台讲话或咳嗽，避免将唾沫中微生物带入超净台内，污染空气。实验者离开超净台时，立即用肘关节关闭侧窗口，避免无菌室内细菌随空气流入净化操作区。5、实验后要求实验完毕，关闭超净台风机和电源，未使用过的器材放入饭盒内，用过的玻璃器材投入清水中浸泡，包装纸叠卷，绳成束分类归人，最后，超净台面用酒精纱布或棉球擦拭，紫外线消毒。6、注意事项无菌操作离不开火和酒精，操作中避免事故发生。要用打火机点火。火柴点火时，火星熄灭后投入废缸内（缸内有废酒精棉球）。酒精溅出台面或瓶外壁时，立即擦干；一旦发生着火事故，立即关闭超净台风机，用饭盒、湿布扑灭火焰。

实验概要可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。基本类型有单向扩散和双向扩散两种。本文介绍了单向和双向两种琼脂扩散试验的操作流程。单向琼脂扩散试验主要用于检查血清中各种免疫球蛋白和补体成份的含量；双向琼脂扩散试验可用来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体的效价。实验原理1. 单向琼脂扩散试验是一种定量试验，将抗体混合于琼脂内，倾注于玻片或平皿上，凝固后在琼脂上打孔，再将抗原标本加入孔内，经过一定的时间，在孔的周围出现抗原抗体复合物形成的沉淀环，环的大小与抗原含量和扩散时间相关。用不同浓度的抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量即可从准标曲线中求出。2. 抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。实验步骤1. 单向琼脂扩散试验(Single immunodiffusion test)-人血清中IgG、IgA、IgM的测定1) 材料IgG、IgA、IgM免疫板、参考血清、待检血清、微量加样器(10微升)、量尺、纱布、生理盐水、带盖方盘。2) 方法a. 免疫琼脂板制备：将1.5%琼脂(用PH8.2、0.05M的巴bi妥缓冲液配成)，加热溶化，待琼脂冷至56℃加入适量抗血清(抗血清最终稀释度取决于抗血清所标化的稀释度)，混匀，制成厚1.5mm的琼脂板，待琼脂凝固后打孔，孔径为3mm，孔距1～1.2cm。b. 稀释参考血清及待检血清：参考血清用0.5ml蒸馏水溶解后使用，参考血清、待检血清稀释按要求进行。c. 加样：将上述稀释参考血清分别滴入相应的抗体免疫板的一排孔内，其余孔滴加待检的稀释血清，每个检样加两个孔，每孔滴加10微升。d. 扩散：将免疫板置水平湿盘内，放进37℃温箱，IgG免疫板扩散24小时，IgA、IgM板48小时后取出置黑色背景前观察结果，(如果沉淀环不清晰，也可用1%鞣酸液浸泡免疫板半小时后观察)，必要时可以染色后观察。e. 绘制标准曲线及血清标本中IgG、IgA、IgM定量测定：测量沉淀环直径。沉淀环直径的大小除与抗原量相关，还与分子量和扩散时间有关。这种沉淀环直径与抗原含量的关系不是直线相关，而是对数关系，这种关系有两种计算方法：Mancini曲线－适用于大分子抗原和长时间扩散(＞48小时)的结果处理。使用方格计算纸划线，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。公式表示：C／d2 ＝K(C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数)。Fehey曲线－适用于小分子抗原和较短时间(24小时)扩散的结果处理。使用半对数纸划线，浓度的对数与沉淀环之间呈线性关系。公式表示：logC／d＝K(C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数)。2. 双向琼脂扩散试验(Double immunodiffusion test)1) 材料羊抗人全血清，小牛血清，正常人混合血清，精制琼脂粉，生理盐水、载玻片，打孔器(直径3mm)、湿盒、吸管等。2) 方法a. 用生理盐水配制1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5ml趁热浇于载玻片上，制成琼脂板。b. 待琼脂凝固后，按右图用打孔器打孔，并用针头挑去孔中琼脂(孔距为5mm)。c. 在①孔中加正常人混合血清，在②孔中加小牛血清，③孔中加羊抗人全血清，注意不要溢出。d. 将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱内放置24小时后观察结果。

PCR产物的检测方法：琼脂糖凝胶电泳这是实验室最常用的方法，简便易行，只需少量DNA即可进行实验。其原理是不同大小的DNA分子通过琼脂糖凝胶时，由于泳动速度不同而被分离，经溴化乙锭（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子发出荧光而判定其分子的大小。用于电泳检测PCR产物的琼脂糖浓度常为1%—2%，应该使用纯度高的电泳纯级琼脂糖，这种琼脂糖已除去了荧光抑制剂及核酸酶等杂质。（1）制胶琼脂糖凝胶厚度约为3~5mm。过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入100ml 0.5×TBE液，微波炉加热2-5min，使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室温等温度下降至60℃时，加入终浓度0.5μg/ml的EB液，充分混匀后倒板（注意排除气体）。（2）加样和电泳上样时一般取PCR反应液5~10μl，加入3μl溴酚兰液，充分混匀，加入凝胶加样孔中。电泳仪可用一般稳压可调中压电泳仪，电泳工作液为0.5×TBE液，接通电源，使样品由负极向正极移动。60-100V恒压电泳约30-60分钟。（3）检测将凝胶板放在紫外透射仪的石英玻璃台上进行检测，DNA产物与荧光染料EB形成橙黄色荧光复合物。观察各泳道是否有橙黄色荧光带出现，并与扩增时所设的阳性对照比较，判断阳性或阴性结果。也可在电泳时以标准分子量作对照，判断其扩增片段是否与设计的大小相一致。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳繁琐，但在引物纯化、PCR扩增指纹图、多重PCR扩增、PCR扩增产物的酶切限制性长度多态性分析时常用到。聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨DNA片段的有效范围：(1)制胶在两块制胶玻璃板中间放上垫片，放上制胶架，拧紧制胶螺丝夹紧玻璃板。制备适量合适浓度的凝胶，使之略多于胶板。不同浓度（%）聚丙酰胺凝胶的制法：在加入TEMED和10%过硫酸铵后，立即混匀，倒入放置45℃角的玻璃板内，完全注满（注意不要有气泡），迅速将玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔顶并夹紧，待30-60分钟胶聚合后，取下胶板，放入电泳槽中固定。（2）加样和电泳上下槽中加入1×TBE电泳缓冲液，溢过加样孔，拔出梳子，排出加样孔中的气泡，将PCR产物或限制性内切酶消化产物2与1上样缓冲液混匀，用微量注射器加入加样孔底部，使样品在孔底成一层，两侧孔中加入标准分子量的DNA Marker。以2-10V/cm电压电泳，电泳时间足够长，使片断足以分开，待指示剂走到适宜位置时关闭电源，将胶片取出。（3）银染分开两块玻璃板，将凝胶片放入100ml银染固定液中振荡15min，双蒸水洗3次，每次2min，然后将凝胶片转入100ml 0.2%的AgNO3中于摇床上染色约10min，吸去AgNO3液，用双蒸水洗3次，每次30s，加入100ml显色液约7-10min，待DNA带显示清除时，吸去显色液，加入固定液Na2CO3，静置2-3min，取出凝胶观察。

血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：⑴将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。⑵加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。⑶加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。⑷加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。⑸加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

　　标准品一词常作为泛称。在色谱分析工作中，我们进行样品理化分析时常用的标准品大多属于“化合物纯度/浓度标准品”。此时，“标准品”这一称呼涵盖了非医药行业常说的“标准物质”、“标准样品”以及医药行业常说的“中药对照品”、“化学对照品”等。　　“标准品”一词作为特指时，专指药典体系标准物质中的“标准品”。《中国药典》四部0291国家药品标准物质通则中有明确定义，此部分内容目前在2020版药典中未作修订。　　常见容器包括不同规格的玻璃安瓿瓶与带盖玻璃瓶。　　通常情况下，固体、半固体纯品通常使用带盖玻璃瓶装，也有使用安瓿瓶装的情况，比如中检院的国家药品标准物质。　　液体纯品或标液型产品常使用安瓿瓶装，易挥发物质也有使用毛细管瓶装的情况。根据是否需要避光保存，容器有无色透明的材质与棕色半透明材质。　　如何取用标准品：　　1.稀释标液或者称量纯品前，要提前将标准品放在操作环境，确保产品回复至室温，操作前保证瓶身清洁干燥（可用吸水纸擦去表面水滴）。　　2.称量纯品时选择合适的天平，通常小数点后4位或5位，根据需要称量的质量决定。　　3.称量纯品前，提前打开天平预热，调节水平（将天平上的小气泡赶至正中央）。　　4.称量纯品的方式有增量法与减量法，常用增量法。　　5.减量法适用于小规格纯品型产品（比如5mg及以下规格）完全溶解直接配制母液；或者某支纯品已经取用过几次、不清楚剩余含量打算全部溶解的情况。

一、专属鉴别试验药物的专属鉴别试验是证实某一种药物的依据,它是根据每一种药物化学结构上的差异所引起的物理化学特性,选用某些特te有的灵敏度高的反应来鉴别药物的真伪。如巴bi妥类药物含有丙二酰脲的相同母核,可根据其母核上取代基不同,而具有不同的理化性质来鉴别不同的丙二酰脲类药物:苯巴bi妥其母核上连接的基团为苯基,利用其苯基硝化和缩合反应进行专属鉴别试验的确证鉴别;司可巴bi妥母核上连有不饱和烃键,利用加成特性和还原特性进行专属鉴别的确证鉴别。一般鉴别试验与专属鉴别试验的不同点在于,一般鉴别试验是以某些药物的共同化学结构为依据,根据相同的物理化学性质进行药物真伪的鉴别,以区别不同类别的药物。而专属鉴别试验则是在一般鉴别试验的基础上,利用各种药物的化学结构差异来鉴别药物的,以区别同类药物或区别具有相同化学结构中的某一个药物,达到最终确证药物真伪的目的。二、化学鉴别法化学鉴别法是根据药物与化学试剂在一定条件下发生化学反应所产生的颜色、沉淀气体、荧光等现象,鉴别药物真伪的方法,供试品按质量标准中的鉴别项目的要求进行鉴别试验,若试验现象相同,则认定为同一种药物。化学鉴别法对无机药物主要是利用其阴阳离子的性质进行鉴别:对有机药物主要是利用其官能团或整个分子结构表现的性质进行鉴别。化学鉴别法是药物分析中最chang用的鉴别方法。其主要包括以下内容。1.显色反应鉴别法即向供试品溶液中加入适当试剂,在一定条件下发生化学反应,生成易于观测的有色产物。常见的反应类型如下。(1)茚三酮呈色反应——多为含脂肪氨基结构的药物;(2)异羟肟酸铁反应——多为含芳酸及其酯类和酰胺类结构的药物;(3)三氯化铁呈色反应——多为含酚羟基或水解后产生酚羟基的药物;(4)重氮化偶合呈色反应一—多为芳伯氨基或能产生芳伯氨基结构的药物;(5)氧化还原呈色反应或其他颜色反应。2.沉淀反应鉴别法供试品溶液中加入适当试剂,在一定条件下发生化学反应,生成不同颜色的沉淀物,有的具有特殊的沉淀形状。常见的反应类型如下。(1)与硫氰化铬胺(雷氏盐)的沉淀反应——多为生物碱及其盐类药物和具有芳香环的有机碱及其盐类药物。(2)与重金属离子的沉淀反应——在一定条件下药物和重金属离子反应,生成沉淀物。(3)其他沉淀反应。3.气体生成反应鉴别法供试品溶液中加入适当试剂,在一定条件下发生化学反应,生成气体。常见的反应类型如下。(1)产生氨气,利用其特殊的气味鉴别——多为胺(铵)类药物、酰胺类药物经强碱处理后,加热,产生氨气。(2)产生硫化氢气体,利用其特殊的气味鉴别——多为化学结构中含硫的药物,经强碱处理后,加热,产生硫化氢气体。(3)含碘有机药物,直火加热后,可产生紫色碘蒸气。(4)含醋酸酯和乙酰胺类药物,经硫酸水解后可产生醋酸乙酯的香味。4.荧光反应鉴别法常见的荧光发射形式有以下几种类型。(1)药物本身在可见光下发射荧光。(2)药物溶液加硫酸呈酸性后,在可见光下发射荧光。(3)药物和溴反应后,在可见光下发射荧光。(4)药物和间苯2酚反应后以及经其他反应后,发射荧光。

为了减少由于保存不当造成的化学试剂的损失。客户应该清楚的了解一些不稳定的化学试剂如何保存?实验室中不稳定的化学试剂应该怎么保存?化学试剂存放要依据物质自身的物理性质和化学性质，降低或杜绝物质变性、自然损耗。实验室中有很多不稳定的化学试剂。有的易挥发、有的易燃易爆、有的试剂在保存的时候需要密封保存。常用不稳定试剂的分类及要求(1)与水蒸气，水发生反应的物质要密封，并远离水源保存。如电石(CaC2),生石灰(CaO)，浓硫酸，无水硫酸铜()，各种干燥剂(硅胶，碱石灰，P2O5，CaCl2等)，K, Na, Mg, Na2O2, 更要同时具备所有要求。(2)易与氧气作用的试剂，如亚硫酸盐，苯酚，亚铁盐，碘化物，硫化物等应将其固体或晶体密封包村，不宜长期存放其水溶液;亚硫酸，氢硫酸溶液要密封存放;钾，钠，白磷更要采用液封形式。(3)易挥发、低燃点的试剂要密封，放于阴凉、通风、远离火源处保存。(4)与二氧化碳反应的物质要密封包村。如碱类，NaOH,Ca(OH)2,Ba(OH)2,等;如弱酸盐类，水玻璃，偏铝酸钠，苯酚钠，Na2O,Na2O2等。由于其相应的溶液较固体更易反应，所以更要注意密封保存。(5)易挥发或自身分解的试剂要密封，放于阴凉通风处保存。如浓硝酸，浓盐酸，浓氨水，AgNO3，液溴(水封)等。

无机分析试剂无机分析试剂（Inorganic analytical reagent）是用于化学分析的常用的无机化学物品。其纯度比工业品高，杂质少。有机分析试剂试剂有机分析试剂（Organic reagents for inorganic analysis）是在无机物分析中供元素的测定、分离、富集用的沉淀剂、萃取剂、螯合剂以及指示剂等专用的有机化合物，而不是指一般的溶剂、有机酸和有 机碱等。这些有机试剂必须要具有较好的灵敏度和选择性。随着分析化学和化学工业的发展，将会研制出灵敏度和选择性更好的这类试剂，如1967年以来出现的 对一些金属（如碱金属、碱土金属）及铵离子具有络合能力的冠醚（Crown ether）类化合物就是这样。基准试剂基准试剂（Primary standards）是纯度高、杂质少、稳定性好、化学组分恒定的化合物。在基准试剂中有容量分析、pH测定、热值测定等等分类。每一分类中均有第一基准 和工作基准之分。凡第一基准都必须由国家计量科学院检定，生产单位则利用第一基准作为工作基准产品的测定标准。商业经营的基准试剂主要是指容量分析 类中的容量分析工作基准[含量范围为99.96%~100.05%（重量滴定）]。一般用于标定滴定液。标准物质标准物质（Standard substance）是用于化学分析、仪器分析中作对比的化学物品，或是用于校准仪器的化学品。其化学组分、含量、理化性质及所含杂质必须已知，并符合规 定或得gong认。微量分析试剂微量分析试剂（Micro-analytical reagent）适用于被测定物质的许可量仅为常量百分之一（重量约为1~15毫克，体积约为0.01~2毫升）的微量分析用的试剂。分析标准品有机分析标准品有机分析标准品（Organic analytical standards）是测定有机化合物的组分和结构时用作对比的化学试剂。其组分必须精确已知。也可用于微量分析。农药分析标准品农药分析标准品（Pesticide analytical standards）适用于气相色谱法分析农药或测定农药残留量时作对比物品。其含量要求精确。有由微量单一农药配制的溶液，也有多种农药配制的混合溶液。原子吸收光谱标准品原子吸收光谱标准品（Atomic absorption spectroscopy standards）是在利用原子吸收光谱法进行试样分析时作为标准用的试剂。折光率液折光率液（Refractive index liquid）为已知其折光率的高纯度的稳定液体，用以测定晶体物质和矿物的折光率。在每个包装的外面都标明了其折光率。当量溶液当量溶液（Normal solution）为一升溶液中含有一克当量溶质的水溶液，即指浓度是1N的溶液。 指示剂 指示剂（Indicator）是能由某些物质存在的影响而改变自己颜色的物质。主要用于容量分析中指示滴定的终点。一般可分为酸碱指示剂、氧化还原指示 剂、吸附指示剂等。指示剂除分析外，也可用来检验气体或溶液中某些有害有毒物质的存在。仪器分析试剂仪器分析试剂（Instrumental analytical reagents）是利用根据物理、化学或物理化学原理设计的特殊仪器进行试样分析的过程中所用的试剂。色谱用色谱用（For chromatography）试剂是指用于气相色谱、液相色谱、气液色谱、薄层色谱、柱色谱等分析法中的试剂和材料，有固定液、担体、溶剂等。电子显微镜用电子显微镜用（For electron microscopy）试剂是在生物学、医学等领域利用电子显微镜进行研究工作时所用的固定剂、包埋剂、染色剂等的试剂，极谱用极谱用（For polarography）试剂是指在用极谱法作定量分析和定性分析时所需要的试剂。光谱纯光谱纯（Spectrography）试剂通常是指经发射光谱法分析过的、纯度较高的试剂。分光纯分光纯（Spectrophotometric pure）试剂是指使用分光光度分析法时所用的溶液，有一定的波长透过率，用于定性分析和定量分析。生化试剂生化试剂（Biochemical reagent）是指有关生命科学研究的生物材料或有机化合物，以及临床诊断、医学研究用的试剂。由于生命科学面广、发展快，因此该类试剂品种繁多、性质复杂。其他国标试剂国标试剂：该类试剂为我国国家标准所规定，适用于检验、鉴定、检测试剂级（RG，红标签）：作为试剂的标准化学品。教学试剂：可以满足学生教学目的，不至于造成化学反应现象偏差的一类试剂。zhi定级 （ZD），该类试剂是按照用户要求的质量控制指标，为特定用户订做的化学试剂。高纯试剂（EP）：包括超纯、特纯、高纯、光谱纯，配制标准溶液。 此类试剂质量注重的是：在特定方法分析过程中可能引起分析结果偏差，对成分分析或含量分析干扰的杂质含量，但对主含量不做很高要求。指示剂（ID）：配制指示溶液用。 质量指标为变色范围和变色敏感程度。可替代CP,也适用于有机合成用。生化试剂（BR）：配制生物化学检验试液 和生化合成。质量指标注重生物活性杂质。可替代指示剂，可用于有机合成生物染色剂（BS）：配制微生物标本染色液。 质量指标注重生物活性杂质。可替代指示剂，可用于有机合成电子纯（MOS）：适用于电子产品生产中，电性杂质含量极低 电镀级:适用于电镀工业生产的，对电镀有害的杂质较少，纯度大致高于工业级 ，略低于化学纯。 当量试剂（3N、4N、5N）：主成分含量分别为99.9%、99.99%、99.999%以上。电泳试剂：质量指标注重电性杂质含量控制。此外，还有特种试剂，生产量极小，几乎是按需定产，此类试剂其数量和质量一般为用户所zhi定。 合成试剂：所谓合成试剂：就是在标明成分主含量的前提下，严格给出该产品的有关各种物理常数的一类化学试剂。

目的 认识酵母菌 的形态特征，了解培养酵母菌的方法。实验前的思考 人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学会酿酒。约在6000年前，就发明发面的方法。直到十九世纪有了显微镜 ，人们才窥探到醉母菌的真面目。对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌的。材料器具 甜酒酿汁液，新鲜酵母 ，豆芽;显微镜，载玻片，盖玻皮，玻璃棒，镊子，滴管，吸水纸，酒精灯，石棉网，火柴，漏斗架，玻璃斗，量杯，三角烧瓶，烧杯，天平，量筒，棉絮;蔗糖，乳酸，碘液。步骤1.观察酵母菌(1)用滴管从甜酒酿的汁液中吸取一滴汁液，滴在载玻片上，用针摊开，盖上盖玻片，在低倍镜下就能清楚地看到甜酒酿的汁液中悬浮着无数酵母菌。再换高倍镜仔细观察一个酵母菌，可以看到酵母菌是椭圆形的单个细胞，细胞中有许多小颗粒，也有几个大的液泡(图示)。有的酵母菌的一端长出大小不同的突起，这是酵母菌的芽体。芽体成长脱落，就成为新的个体，有的芽体在从母体脱落前又长出突起。这种繁殖方法叫出芽繁殖。(2)在盖玻片一边加一滴碘液，从另一边用吸水纸把染液引入盖玻片下。不久就能看到被染成棕褐色的细胞核和变成蓝紫色的淀粉粒。2.培养酵母菌(1)用蔗糖液培养 在盛有100毫升的三角烧瓶里加5克蔗糖，煮沸。等到溶液稍稍冷却，加一小块鲜酵母，用玻璃棒搅拌均匀;再用棉絮塞紧瓶口。然后把烧瓶放在 25～30℃的温暖地方，数小时后就可见到溶液里有气泡产生，并散发出酒味。这是因为酵母菌正在把糖分解成乙醇和二氧化碳。(2)二三天后吸取溶液在显微镜下观察，就可看到已培养出大量酵母菌。注意事项1.观察酵母菌时，视野里杂质较多，有淀粉粒、半分解的淀粉团块、曲霉孢子和其他杂菌等等，只要掌握住酵母菌的形状和体内具有液泡，尤其是染色后体内具有褐色的核和蓝色的淀粉粒这些特点，就可以跟其他杂菌区分开来。2.发酵在缺氧的环境里仍能良好地进行，不必为了增加氧气去搅拌已放入菌种的培养液。分析和讨论酵母菌是少数能在缺氧环境里生存较长时间的一种微生物，它属于兼性菌类。在一般情况下进行有氧呼吸。如环境中有丰富的糖类，它进行缺氧呼吸。其过程如下：1.C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O+2.87×103兆焦(有氧呼吸)2.C6H12O6→2CO2+2C2H5OH+109×103兆焦(缺氧呼吸)建议 培养酵母菌还可以采用下列两种方法。1.用乳酸、豆芽汁和蔗糖液培养(1)取10克豆芽放入100毫升水中，加热煮沸半小时，盛起，用细布过滤。在滤液里加5克蔗糖和5毫升乳酸，配成液体培养液。(2)把鲜酵母半块或老面(发酵后晾干的面粉团)打碎，投入培养液中，放在黑暗温暖的地方，二三天后就可以培养出大量酵母菌。2.用巴斯德培养液培养酵母菌需要的无机营养来自外界环境。如果在培养液内适当增加氮、磷等元素，效果会更好。巴斯德培养液的配方如下：蔗糖15克，碳酸铵1克，磷酸氢钾0.2克，磷酸钙0.02克，硫酸镁0.02克，蒸馏水100毫升，培养方法跟上述的相同。