细胞的种类多种多样，大小和特性个不相同，故此细胞固定化的方法有很多种。归结起来，主要可以分为吸附法和包埋法两大类。吸附法利用各种吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定的方法称为吸附法。用于细胞固定化的吸附剂主要有硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体、和中空纤维等。酵母细胞带有负电荷，在pH3~5的条件下能够吸附在多孔陶瓷、多孔塑料等载体的表面，制成固定化细胞，用于酒精和啤酒等的发酵生产；在环境保护领域内使用的活性污泥中含有各种各样的微生物，这些微生物可以沉积吸附在硅藻土、多孔玻璃、多孔陶瓷、多空塑料等载体的表面，用于各种有机废水的处理，降低废水中的化学需氧量（COD)和生化需氧量（BOD）；各种霉菌会长出菌丝体，这些菌丝体可以吸附缠绕在多空塑料、金属丝网等载体上用于生产有机酸和酶等；植物细胞可吸附在中空纤维外壁，用于生产色素、香精、药物和酶等次级代谢产物；动物细胞大多属于贴壁细胞，必需依附在固体表面才能正常生长，故可吸附在容器壁、微载体、中空纤维外壁等载体上，制成固定化细胞，用于各种蛋白质的生产。包埋法将细胞包埋在多空载体内部而制成固定化细胞的方法称为包埋法。包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定方法。固定化酶及应用1．由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本高、不利于大规模使用。因此，酶在大规模生产中，使酶能反复使用，是很有经济价值的课题。固定化酶的使用，推动了酶在生产上的应用。固定化酶，就是将酶分子结合在特定的支持物上且不影响酶的功能。用于固定酶的底物有琼脂糖、丙烯酰胺、藻酸钠等。固定化酶技术的应用，一是可循环反复使用酶制剂。据报道，在某些情况下可使用上千次，极大地降低生产成本。二是在生产中，可通过离心法或过滤法把酶与反应液相互分开，在大规模的生产中所需工艺设备比较简单易行。三是稳定性能好等。2．采用固定化酶技术生产L-氨基酸。1969年日本利用固定化氨基酰酶，由乙酰化-DL-氨基酸连续生产L-氨基酸获得成功，是世界上固定化酶大规模应用的首例。1974年以来，已能将米曲霉的氨基酰化酶固ㄔ贒EAE-Sephadex上生产出L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸等。工业成本降低约40％，产品广泛应用于食品、医疗、农业等等。3．采用固定化酶生产高果糖浆。用α-淀粉酶将玉米粉水解生成寡糖，再用葡萄糖淀粉酶处理产生95％～97％葡萄糖。由于葡萄糖的甜度比蔗糖低得多，所以利用葡萄糖异构酶将葡萄糖异构化转变成果糖，就可以解决这一问题。现通过α-淀粉酶、糖化酶和固定化葡萄糖异构酶，将玉米粉转化成含葡萄糖50％、果糖42％、其它糖8％的反应物，称为高果糖浆或果葡糖浆。它虽然是一种混合物，但甜度与蔗糖相当，比葡萄糖高出许多。因此，在饮料、食品生产中大量应用。现在，一些发达国家高果糖浆的年产量已达几百万吨，高果糖浆在许多饮料的制造中已经逐渐代替了蔗糖。

pH值是培养基的常规监控项目，微生物的生长不仅依赖丰富的营养，还需要在适宜的pH值范围内才能正常生长繁殖或体现其生物特性，因此培养基pH值是否符合要求直接影响微生物检验结果。1、培养基配置：配料—溶解—调PH—过滤—分装—包扎—灭菌—摆斜面—贮存1.配料配方换算→在容器中加入少量水（蒸馏水，自然水）→按照配方称取各种药品（依次加入）→加足所需水量（一药一勺，取药后立即盖上瓶盖）。2.溶解淀粉溶解：少量冷水调成糊状加热溶解，特别是加有琼脂的培养基，一定要煮沸，琼脂的熔解温度95-97℃，且需要边加热边搅拌以防止烧焦。3.调PH用1N的盐酸或1N的 NaOH把培养基调节到所要求的值。4.过滤滤纸或棉花进行过滤。（有时可以省去）5.分装一般培养基放在三角瓶或试管中灭菌使用。(1)三角瓶若作静置培养，则100mL培养基/250mL的三角瓶，最多不能超过150mL培养基/250mL的三角瓶，否则灭菌时培养基沸腾容易污染棉塞，造成染菌；若作摇瓶培养，则15-20mL培养基/250mL的三角瓶，保证通气良好。(2)试管分装液体培养基一般装4-5mL，约试管的1/4高度；固体斜面培养基一般装3-4mL，约试管的1/5高度。6.包扎分装好后，塞上棉塞，在用牛皮纸将棉塞包裹好，防止灭菌时水份进入把棉塞弄湿。7.灭菌按配方上要求的温度、压力进行高压蒸汽灭菌。如果灭菌的温度太高，营养成分会被破坏，培养基中的糖、氨基酸会使培养基的颜色变深。8.摆斜面灭菌后需要摆斜面的试管要趁热斜着摆放，使其凝固成为一个斜面，约占试管长度的1/2。9.贮存培养基在30℃下放置一天，无污染的即可使用。一般用牛皮纸包裹好存放于2-8℃冰箱中备用注意事项：在配制时，首先要确保培养基未结块、颜色未发生变化或其他物理性状明显改变；应按照使用说明上的要求操作，称量应达到相应的精确度；纯化水是配制培养基最常用的溶剂，应确保溶剂的质量符合要求；配制培养基应采用干净且不会对培养基理化特性产生改变的容器。在分装前，应确保培养基完全溶解混匀，加热助溶是最常用的方法，应注意不要过度加热，尤其是含糖量较高的培养基，糖类不耐热的特性会使糖类在高温条件下产生有机酸而使pH值下降。2、培养基的pH控制培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。虽然培养基中含有缓冲物质成分，能使培养基的pH尽可能的保持在要求的范围内，但是配出的培养基若不符合要求，就要进行必要的调整。如果有已校准pH计，可用pH计，如果没有，可用精密的pH试纸，再根据需要用1 moL/L氢氧化钠或1moL/L盐酸（微调可用0.1氢氧化钠或0.1moL/L盐酸）调制所需的pH。培基的pH一般为7.4～7.6，也有酸性或碱性的。用氢氧化钠调整的需要高压灭菌的培养基，在调整pH时要调至高出所需0.1个～0.2个单位，因用氢氧化钠调整时，高压灭菌后，培养基的pH要降低0.1~0.2。如培养基中含有碳酸钙成分，可不pH。3、pH电极的维护保养目前，实验室使用pH计电极大部分都是复合电极。其优点是使用方便，不受氧化-还原物质的影响，且平衡速度快。使用时应注意以下事项：⒈复合电极不用时，可充分浸泡饱和氯化钾溶液中。切忌用洗涤液或其他吸水性试剂浸洗。⒉使用前，检查玻璃电极前端的球泡。正常情况下，电极应该透明而无裂纹；球泡内要充满溶液，不能有气泡存在。⒊测量浓度较大的溶液时，尽量缩短测量时间，用后仔细清洗，防止被测液粘附在电极上而污染电极。⒋清洗电极后，不要用滤纸擦拭玻璃膜，而应用滤纸吸干, 避免损坏玻璃薄膜、防止交叉污染，影响测量精度。⒌测量中注意电极的银—氯化银内参比电极应浸入到球泡内氯化物缓冲溶液中，避免电计显示部分出现数字乱跳现象。使用时，注意将电极轻轻甩几下。⒍电极不能用于强酸、强碱或其他腐蚀性溶液。⒎严禁在脱水性介质如无水乙醇、重铬酸钾等中使用

01、PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。02、假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备②引物的质量与特异性③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。一、模板1、模板中含有杂蛋白质2、模板中含有Taq酶抑制剂3、模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白4、在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚5、模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。二、酶失活需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。三、引物引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。四、Mg2+浓度Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。五、反应体积的改变通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul.或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。六、物理原因变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。七、靶序列变异如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。03、假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。一、引物设计不合适选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。二、靶序列或扩增产物的交叉污染这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。04、出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：1、将PCR反应的试管与反应板紧贴。2、当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。3、不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。4、对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。没有扩增产物：1、在提供MgCl 2 缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl 2 浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。2、泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl 2 ，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg 2+ 。3、检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。4、检查模板和引物的用量。5、增加循环次数和/或模板DNA的用量。泳道中出现模糊条带：1、减少循环次数或模板DNA的用量。2、提高退火温度，但不要超过68℃。3、重新设计引物或设计更长的引物。其他值得注意的条件：1、建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。2、最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。3、大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。4、优化Mg2+的浓度是必需的。5、基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。6、要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。7、降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。8、变性：第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。9、延伸：68--72℃下进行延伸操作。10、循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。11、长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。12、测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。引物设计：1、一般长度20-30bp；2、至少50%的GC含量；3、避免引物二聚体和二级结构；4、引物对的Tm值应该接近。

1、纯化的一般目标和方法首先，自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤(例如：匀浆、离心、硫酸铵沉淀等)成为稳定的可以用于色谱分离的样品。然后进行捕获色谱(capture chromatography)，主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质，此步最关心的是流速和载量，常采用高载量、快流速凝胶。经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱(intermediate chromatography)，目的是去除较难去除的杂质，此步最关心的是分辨率，常采用高分辨率的细颗粒凝胶。最后为了得到符合要求的最终产品，去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断，进行精制色谱(polishing chromatography)，常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。2、纯化前的准备工作(1)样品稳定性试验a、测定样品在pH 2-9的稳定性；b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性；c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性；d、测定样品在4-40℃的稳定性；e、室温下静置过夜，测定对蛋白水解酶的稳定性。(2)样品预处理a、去除样品中颗粒物(0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟)b、去除样品中脂类( 10000 g离心15分钟或有机溶剂抽提)c、去除样品中核酸(加入核酸酶消化或者使核酸沉淀)d、抑制样品中蛋白水解酶(加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第一步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白)(3)样品的保存条件：短期储存(小于24小时)a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀b、在密闭容器中冰箱冷藏较长期储存(数天)a、b、同上c、加入适当的抑菌剂长期储存a、同上b、冰冻或者最好冻干(真空冷冻干燥)保存。3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立a、目的蛋白含量测定酶活性测定、生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。b、总蛋白含量测定紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法(考马斯亮兰G-250)等。c、样品复杂度检测HPLC(离子交换、凝胶过滤、反相)、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳(CE)。4、蛋白质的来源(1)天然蛋白： 天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂，在分离过程中须采用多步骤才能去除各种杂质，并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。(2)重组蛋白： 重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要有三种表达定位：a、细胞质：在种情况下，必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质，同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放；在表达量较高的条件下，一般形成包涵体，包涵体含有过表达目的蛋白，且容易通过高速离心分离，但是包涵体的溶解与复性是较复杂的。b、外周质： 表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间，这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的作用并减少了宿主蛋白的污染。c、分泌到培养基：这种表达一般蛋白质浓度较低，主要受到培养基中的污染。

　　a 滴定管在装满滴定液后，管外壁的溶液要擦干，以免流下或溶液挥发而使管内溶液降温（在夏季影响尤大）。手持滴定管时，也要避免手心紧握装有溶液部分的管壁，以免手温高于室温（尤其在冬季）而使溶液的体积膨胀（特别是在非水溶液滴定时），造成读数误差。　　b 使用酸式滴定管时，应将滴定管固定在滴定管夹上，活塞柄向右，左手从中间向右伸出，拇指在管前，食指及中指在管后，三指平行地轻轻拿住活塞柄，无名指及小指向手心弯曲，食指及中指由下向上顶住活塞柄一端，拇指在上面配合动作。在转动时，中指及食指不要伸直，应该微微弯曲，轻轻向左扣住，这样既容易操作，又可防止把活塞顶出。　　c 每次滴定须从刻度零开始，以使每次测定结果能抵消滴定管的刻度误差。　　d 在装满滴定液后，滴定前“初读”零点，应静置1～2分钟再读一次，如液面读数无改变，仍为零，才能滴定。滴定时不应太快，每秒钟放出3～4滴为宜，更不应成液柱流下，尤其在接近计量点时，更应一滴一滴逐滴加入（在计量点前可适当加快些滴定）。滴定至终点后，须等1～2分钟，使附着在内壁的滴定液流下来以后再读数，如果放出滴定液速度相当慢时，等半分钟后读数亦可，“终读”也至少读两次。　　e 滴定管读数可垂直夹在滴定管架上或手持滴定管上端使自由地垂直读取刻度，读数时还应该注意眼睛的位置与液面处在同一水平面上，否则将会引起误差。　　读数应该在弯月面下缘最低点，但遇滴定液颜色太深，不能观察下缘时，可以读液面两侧最高点，“初读”与“终读”应用同一标准。　　f 为了协助读数，可在滴定管后面衬一“读数卡”（涂有一黑长方形的约4×1.5cm白纸）或用一张黑纸绕滴定管一圈，拉紧，置液面下刻度1分格（0.1ml）处使纸的上缘前后在一水平上；此时，由于反射完全消失，弯月面的液面呈黑色，明显的露出来，读此黑色弯月面下缘最低点。滴定液颜色深而需读两侧最高点时，就可用白纸为“读数卡”。若所用白背蓝线滴定管，其弯月面能使色条变形而成两个相遇一点的尖点，可直接读取尖头所在处的刻度。　　g 滴定管有无色、棕色两种，一般需避光的滴定液（如硝酸银滴定液、碘滴定液、高锰酸钾滴定液、亚硝酸钠滴定液、溴滴定液等），需用棕色滴定管。

ATCC是美国的一个微生物菌株保藏中心。每种已经定名的细菌都会有一个模式菌株,一般就是该种最早发现的那株菌株,称为标准菌株,用来作为和其他细菌之间比较的对照物。新种鉴定的时候作为参比的实验菌株就必须是标准菌株。细菌（学名：Bacteria）是指生物的主要类群之一，属于细菌域。也是所有生物中数量最多的一类，据估计，其总数约有5×10^30个。细菌的形状相当多样，主要有球状、杆状，以及螺旋状。细菌也对人类活动有很大的影响。一方面，细菌是许多疾病的病原体，可以通过各种方式，如接触、消化道、呼吸道、昆虫叮咬等在正常人体间传播疾病，具有较强的传染性，对社会危害极大。另一方面，人类也时常利用细菌，例如乳酪及酸奶和酒酿的制作、部分抗生素的制造、废水的处理等，都与细菌有关。在生物科技领域中，细菌也有着广泛的运用。细菌的个体非常小，目前已知最小的细菌只有0.2微米长，因此大多只能在显微镜下被看到。细菌一般是单细胞，细胞结构简单，缺乏细胞核、细胞骨架以及膜状胞器，例如线粒体和叶绿体。基于这些特征，细菌属于原核生物（Prokaryote）。原核生物中还有另一类生物称作古细菌（Archaea），是科学家依据演化关系而另辟的类别。为了区别，本类生物也被称为真细菌（Eubacteria）。远慕生物长期供应ATCC菌株保藏中心的菌株，货期快，操作流程简单，品种齐全。可以提供以下类别生物标准品:细胞株(3000多种);菌株(15000多种);动植物株(2500多种)以及重组物质等。详情与我们联系。

NK细胞和K细胞的不同点：1、数量不同K细胞占血液中淋巴细胞总数的5％～7％，NK细胞占血中淋巴细胞总数的2％～5％。2。免疫杀伤方式不同K细胞必须在抗体协助下才能具有免疫杀伤作用,NK细胞不需抗原激活,更不需抗体的协助,它可直接杀伤靶细胞。3、细胞体积不同K细胞体积略大,是中型淋巴细胞,其直径约为9～12μm。NK细胞是大淋巴细胞,平均直径为12～15μm,胞质较多,在胞质内有许多大小不等的嗜天青颗粒。4、免疫性质不同K细胞主要攻击比微生物大的靶细胞,可以是病毒感染的细胞,如慢性活动性肝炎中的肝细胞,由于这种细胞体积大,难以被吞噬，K细胞具有细胞外的杀伤作用,将它们清除,对肿瘤细胞也有明确的杀伤作用。NK细胞的这种抗感染和抗肿瘤的杀伤作用是广谱的，所NK细胞是非特异性的杀伤靶细胞的重要成分，是消灭癌变细胞的第一道防线。

　　冻干机适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母等的真空冷冻干燥保藏，但不适于霉菌的菌丝型、菇类、藻类和原虫等。生物菌种冻干保存步骤，其操作流程如下：　　1、安瓿管准备　　安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。　　2、保护剂的选择和准备　　保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。　　3、冻干样品的准备　　在适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后(参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》(试行))，与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜(以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支)。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。　　4、预冻　　一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。　　5、冷冻干燥　　采用冻干机进行冷冻干燥。将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。　　终止干燥时间应根据下列情况判断：　　安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；　　真空度接近空载时的最-高值；　　样品温度与管外温度接近；　　选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结；　　选用一个安瓿管，装1-2%氯-化钴，如变深兰色，可视为干燥完结；　　冷冻干燥完毕后，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。　　6、真空封口及真空检验　　将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。　　7、保藏　　安瓿管应低温避光保藏。　　8、质量检查　　冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。

质控菌株本质上是标准菌株的商业衍生产品，其应有可靠的溯源证明追溯至其使用的标准菌株来源，在微生物实验室仅可作为工作菌株进行使用，在使用前也应进行特性和纯度的确认。质控定量菌株使用起来非常方便，基本就是用无菌水复溶带菌小球，震荡后即可或在其允许的存放条件及时间内使用。自从2015版药典生效后，质控菌株这一标准菌株的商业衍生物慢慢热了起来，原来的微生物实验室，多数使用CMCC菌株，因此基本购买中检所的0代标准菌株制成1代标准贮备菌株然后再制成工作菌株进行使用，或购买地方所制备的2-3代商业衍生物作为工作菌株。其实在此之前已有不少外企使用质控菌株作为其微生物实验室菌株实验的基本耗材，但市场上的商品基本局限于ATCC、NCTC、NCPF等欧美国家菌种保藏中心的菌株，针对于CMCC菌株（中国医学细菌保藏管理中心）的质控菌株基本难寻踪迹。一、质控菌株的分类：一类满足低浓度接种量需求，含菌量一般为＜100cfu，为各类微生物培养基促生长实验，微生物实验阳性对照、无菌工艺模拟试验中培养基灵敏度检查，无菌或微生物限度检查实验方法学验证等的接种量需求。另一类为满足高浓度接种量需求，含菌量一般在105-106cfu，为对防腐剂、抑菌剂及消毒剂等抗微生物活性物质的效能测试或挑战实验，该类实验对微生物有下降几个对数降的统计需求，因此需要相对浓度较高的菌液。二、质控菌株的优势：1、精确的已知菌株cfu数量，减少实验失败率这点优势真的非常大，实验室建立一个各类菌株稳定的稀释至定量的方法至少需要3~6个月不等，培养人员可有效执行该方法每人基本需要3个月，检验所买来菌株的原始情况不一样，即使同一株菌，一样的复苏方法、培养条件、培养时间，同样的稀释方法但是不同人稀释出来的菌量还是不一样，每个微生物实验室肯定遇到过当天稀释加入供试品后发现第二天计数结果超限，或者当天计数第二天放在冰箱里取出的菌液里的菌株都死光了没有出现该有的阳性反应的情况，这些实验都是需要重做的，如果是原料检验或者是成品检验就比较难交代了，因此质控菌株的可稳定定量这个特性显得对实验室尤为有意义，这使得微生物实验的成功率大大提高。2、质控菌株的cfu数量稳定，缩小样本间差异这点在做微生物各类验证中非常有用，因为要做各类样本的对比，如果加入菌株的量差距越小，对于结果的评价就更为准确，比如供试品阳性实际加入量为10cfu，阳性对照实际加入量为90cfu，虽然都满足＜100cfu，但是对于最终微生物生长的判断就会带来一定问题，如果是无菌检查等仅看菌株长势的实验，可能就会有生长微弱和良好的不同判断，同样对于定量实验也可能会对实验回收率产生影响。但如果使用质控菌株即可更准确的进行结果判断，规避此类问题。3、极大减少实验准备时间，易使用降成本传统菌株实验需要经过菌株复苏、培养、稀释等过程，还需要准备培养基、耗材配合实验，如黑曲霉光复苏完培养就需要5-7天，再加做实验，最少也要从7天之前开始准备了，但是质控菌株实验只需要无菌水及人员有一定无菌操作能力加上使用移液枪的能力即可，对于铜绿、黑曲霉等实验控制难度较大的菌株也不需人员再费时练习，普通实验室人员即可胜任，从另一方面考虑其实也可降低人员成本。三、质控菌株的问题：1、溯源问题：因其为商业派生菌株，因此其所使用菌株的可追溯性和分析证书相当重要，生产过程一定要受控并满足标准物质生产商的标准，在使用前其特性及纯度一定要进行确认。2、菌量稳定问题：产品应能确保同一批次及不同批次间的菌量稳定；另外在产品复溶后，在其规定条件的保存时间内应尽量使得菌量稳定，应尽量减少标准误差。3、产品运输及贮存时温度问题：因为为活体菌株产品因此其温度，特别高温对产品可能有一定影响，因此在运输及贮存过程中应严格依据产品温度要求进行。其实以上问题在供应商审计阶段着重对质控菌株产品的溯源、菌量稳定技术及产品运输方式进行考察，找到质控稳定及资质优异的供应商即可解决。对于现代微生物实验室来说，质控菌株的使用是实验室发展的必经之道，使用质控菌株可极大减少实验及人员管控成本，且大大提高微生物实验的成功率，并使得微生物实验迈入定量化的理性时代，期待有更多更好的CMCC的质控菌株产品问世，为中国药企的微生物实验室带来便利和支持。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以zui大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。细胞冻存是细胞培养、引种、保种和保证实验顺利进行的重要技术手段。在细胞建株和建系中，及时冻存原始细胞是十分重要的。在杂交瘤单克隆抗体的制备过程中，杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞的冻存保种常常是*的实验操作。因为在没有建立一个稳定的细胞系或稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能因细胞的污染、分泌抗体能力的丧失或遗传变异等导致实验失败，如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而前功尽弃。1、常用冻存液组成成分20％血清（FBS）、10％DMSO、70％1640培养液；或90％血清（FBS）、10％DMSO，更可防止细胞内冰晶形成。将DMSO和FBS加入DMEM中，各自含量占总体积的10%，然后滤膜过滤后分装保存备用。2、DMSO在冻存液中的作用DMSO在4℃时对细胞无明显毒性，分子量小、溶解度大、易透过细胞膜，降低细胞外未结冰溶液中溶质浓度，使细胞免受高浓度溶质的损伤,细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩；DMSO与水分子结合，可使冰点下降，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶损伤。3、注意事项1.DMSO 不用高压灭菌；DMEM不能高温高压灭菌，可以过滤除菌。2.DMSO要用新的，而且要避光保存。3.DMSO：含10%FBS的DMEM=1:9(体积比)。

首先，请确保标液按证书上建议的保存条件进行保存，保证化合物的稳定。溶剂挥发、化合物分解等各种因素会使标准溶液的浓度标准值发生改变，造成后续使用时定值不准。因此远慕生物建议：1、标液原液原则上不建议多次或者长期使用，最好是一次性配制成储备液。如需多次或长期使用，请分装成可供单次使用的包装、在证书条件下保存，最重要的是，尽快用完！2、贮备液、工作液分装成可供单次使用的包装、在证书条件下保存为宜；3、化学性质不稳定的化合物，工作溶液现配现用；4、分装需使用密封性好、化学稳定性好的储存瓶或进样瓶：● 化合物性质比较不稳定，建议选择棕色瓶身；● 如需较长时间保存，瓶身材质可选择中高硼硅玻璃材质避免杂质溶出；● 瓶盖密封性钳口>螺口>卡口；● 勿选预切口的瓶盖垫。5、分装好后，瓶中剩余空间小于三分之一，减少溶剂挥发也避免溶液过满接触到盖子造成杂质溶出。6、分装好的溶液瓶口朝上放置，盖紧瓶盖后用封口膜或者铝箔密封。

pH计,酸度计主要指实验室酸度计,主要分为台式pH计|酸度计，便携式pH计|酸度计，笔式pH计|酸度计三大类别。一、pH计|酸度计原理用pH计|酸度计进行电位测量是测量pH最精密的方法。pH计|酸度计由三个部件构成：1.一个参比电极；2.一个玻璃电极，其电位取决于周围溶液的pH值；3.一个电流计，该电流计能在电阻极大的电路中测量出微小的电位差。由于采用最新的电极设计和固体电路技术，现在最好的pH计|酸度计可分辨出0.005pH单位。参比电极的基本功能是维持一个恒定的电位，作为测量各种偏离电位的对照。银-氧化银电极是目前pH计|酸度计中最常用的参比电极。玻璃电极的功能是建立一个对所测量溶液的氢离子活度发生变化作出反应的电位差。把对pH敏感的电极和参比电极放在同一溶液中，就组成一个原电池，该电池的电位是玻璃电极和参比电极电位的代数和。E电池＝E参比+E玻璃，如果温度恒定，这个电池的电位随待测溶液的pH值变化而变化，而测量pH计|酸度计中的电池产生的电位是困难的，因其电动势非常小，且电路的阻抗又非常大1－100MΩ；因此，必须把信号放大，使其足以推动标准毫伏表或毫安表。电流计的功能就是将原电池的电位放大若干倍，放大了的信号通过电表显示出，电表指针偏转的程度表示其推动的信号的强度，为了使用上的需要，PH计|酸度计电流表的表盘刻有相应的pH数值；而数字式pH计|酸度计则直接以数字显出pH值。二、pH计|酸度计调试实验室常用的pH计|酸度计有老式的国产雷磁25型酸度计最小分度0.1单位和pHS-2型PH计|酸度计最小分度0.02单位，这类pH计|酸度计的pH值是以电表指针显示。新式数字式pH计|酸度计有国产的科立龙公司的KL系列，其设定温度和pH值都在屏幕上以数字的形式显示。无论哪种pH计|酸度计在使用前均需用标准缓冲液进行二重点校对。首先阅读仪器使用说明书，接通电源，安装电极。在小烧杯中加入pH值为7.0的标准缓冲液，将电极浸入，轻轻摇动烧杯，使电极所接触的溶液均匀。按不同的pH计|酸度计所附的说明书读取溶液的pH值，校对pH计|酸度计，使其读数与标准缓冲液pH7.0的实际值相同并稳定；然后再将电极从溶液中取出并用蒸馏水充分淋洗，将小烧杯中换入pH4.01或0.01的标准缓冲液，把电极浸入，重复上述步骤使其读数稳定。这样就完成了二重点校正；校正完毕，用蒸馏水冲洗电极和烧杯。校正后切勿再旋转定位调节器，否则必须重新校正。三、pH计|酸度计的使用所测溶液的温度应与标准缓冲液的温度相同。因此，使用前必须调节温度调节器或斜率调节旋钮。先进的pH计|酸度计在线路中安插有温度补偿系统，仪器经初次较正后，能自动调整温度变化。测量时，先用蒸馏水冲洗两电极，用滤纸轻轻吸干电极上残余的溶液，或用待测液洗电极。然后，将电极浸入盛有待测溶液的烧杯中，轻轻摇动烧杯，使溶液均匀，按下读数开关，指针所指的数值即为待测溶液的pH值，重复几次，直到数值不变数字式pH计|酸度计在约10s内数值变化少于0.01pH值时，表明已达到稳定读数。测量完毕，关闭电源，冲洗电极，玻璃电极要浸泡在蒸馏水中。四、pH计|酸度计的保养玻璃电极在初次使用前，必须在蒸馏水中浸泡一昼夜以上，平时也应浸泡在蒸馏水中以备随时使用。玻璃电极不要与强吸水溶剂接触太久，在强碱溶液中使用应尽快操作，用毕立即用水洗净，玻璃电极球泡膜很薄，不能与玻璃杯及硬物相碰；玻璃膜沾上油污时，应先用酒精，再用四氯化碳或乙醚，最后用酒精浸泡，再用蒸馏水洗净。如测定含蛋白质的溶液的pH时，电极表面被蛋白质污染，导致读数不可靠，也不稳定，出现误差，这时可将电极浸泡在稀HCl（0.1mol/L）中4－6分钟来矫正。电极清洗后只能用滤纸轻轻吸干，切勿用织物擦抹，这会使电极产生静电荷而导致读数错误。甘汞电极在使用时，注意电极内要充满氯化钾溶液，应无气泡，防止断路。应有少许氯化钾结晶存在，以使溶液保持饱和状态，使用时拨去电极上顶端的橡皮塞，从毛细管中流出少量的氯化钾溶液，使测定结果可靠。另外，pH测定的准确性取决于标准缓冲液的准确性。酸度计用的标准缓冲液，要求有较大的稳定性，较小的温度依赖性。五、PH计数字不稳定现象原因总结1、检查电极是否已损坏；2、应该是电极使用的时间太长了，先校准看一下是否有效；3、可试下用2.5MMOL/L的KCL溶液浸泡探头；4、清洗一下玻璃球，是不是时间长了，上面附着了一些有机物，导致反应不灵敏；5、在水中存在着一个化学平衡~CO2 + H2O→H+ + HCO3-，由于一般的纯水或地表水都显弱碱性导致该平衡向正反应方向移动故PH会一直上升~个人觉得是这样的；6、在被测水样中加入中性盐（如Kcl）作为离子强度调节剂，改变溶液中的离子总强度，增加导电性，使测量快速稳定。此方法国家标准GB/T6P04.3—93中规定："测量水样时为了减少液接电位的影响和快速达到稳定，每50ml水样中加入一滴中性0.1moL/LKCL溶液。"虽然此方法改变了水样中的离子强度，在一定程度上引起了其PH值得变化，但经实验证明此变化在数值上只改变了0.01pH左右，是完全可以接受的。但采用这种方法时，一定要注意所加的Kcl溶液不应含任何碱性或酸性的杂质。因此，Kcl试剂要采用高纯度的，所配溶液的水质也要高纯度的中性水质；7、在测定时，吸收CO2，PH不断上升；8、pH计测pH值，原理是有指示电极和参比电极而构成的电极插入到溶液中形成原电池,?在室温(25℃)时每单位PH值相当于59.1mv的电动势变化值,在仪器上直接以pH的读数表示,温差在仪器上有补偿装置.因为纯净水的离子很少，不能形成稳定的原电池，所以在被测水样中加入中性盐（如KCl）作为离子强度调节剂，改变溶液中的离子总强度，增加导电性，使测量快速稳定；9、ph计读数不稳定：被测定溶液是酸性用pH=4的缓冲液校正斜率，测定溶液是碱性用pH=9的缓冲液校正斜率．调斜率的溶液pH越接近被测溶液的pH值越好；10、有可能是接触不良；11、感觉pH计如果轻微晃动的话，读数也会变的；12、应该不是电极的原因，我想是你的电极干了，你自己看看，一般电极上面都有个小洞，里面装些3mol/LKCL就应该搞定了；13、电极在使用过程中pH值不稳定 基本上和校正没有关系，它与电源电压波动、电极的性能、电极的引导线、电极插孔的接触、被测定溶液的温度等有关。在校正时候，如果被测定溶液接近酸性，就用“6‘定位，如果是碱性的就要用”9“定位了。两者不能任意选；14、应该是电极的问题，使用前先活化。并且，电极不管使用不使用，一年都要淘汰了。测偏酸性溶液，用接近4和7的缓冲液校正；测偏碱性的溶液则应用7和10的缓冲液校正；15、纯净水的pH直用pH计测的出来才怪，首先 用弄明白pH计的测定原理啊:是通过水中含有的离子在电极的作用下定向移动形成电流而显示读数，纯进水的离子太少,电解率低,怎么会测的稳定；16、可能是接触不良.或是电极浸泡液(3MOL/L的KCL溶液)少了,未将电极完全浸泡在电极浸泡液中.还有就是电极老化了,或该换了；17、我想跟室温有关,温度偏低时或者空气流动快,都会影响pH计,要保持室温稳定,而且测定时要把门和窗关好；18、如果测纯水，不稳定是正常的，本来里面含的离子少，缓冲能力弱，环境对它影响十分大，一般取个相对稳定的值就可以了。

　　下面的操作方法可以使约3~5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。　　1.   溶解2~10 mg 蛋白于1 ml 的BuphTm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。如果蛋白含有不恰当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。　　2.  在打开之前，平衡生物素至室温。加2 mg Sulfo-NHS-Biotin于100 ul 超纯水中，加入足够量浓度的生物素，一般对于10 mg/ml 蛋白来说超过12倍分子数，对于2 mg/ml 蛋白溶液应超过20倍，或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中　　3.  室温30分钟，或冰上放置2小时。　　4.  用30 ml PBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5 ml 或1 ml 于单独的管中。　　5.  以280 nm 的吸收值测定蛋白含量。　　6.  生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入叠氮钠、甘油等保存。　　HABA法检测生物素标记效果　　试剂配制：　　1.  PBS（100 mM 磷酸盐，150 mM Nacl　pH7.2）　　2.  HABA/亲和素溶液：10 mg 亲和素、600 ul10 mM　HABA于19.4 ml 的PBS中，该溶液的A500大约在0.9~1.3之间，溶液于4℃保存可稳定2周。如果有沉淀形成（HABA溶液）可过滤后使用。　　比色法检测生物素/蛋白质摩尔质量比：　　1.  吸取900 ul　HABA/亲和素溶液于1ml比色杯。　　2.  测定该溶液在500 nm 处的吸收值并记录为“A500　HABA/Avidin”。　　3.  吸取100 ul 生物素标记的蛋白于杯中并测定500 nm 的吸光度值，记为A500　HABA/Avidin/Biotin （数值必须恒定15s 以上）如果A500　HABA/Avidin/Biotin的值不超过（≤）0.3，重新稀释待测样品并检测。　　注：计算结果时必须考虑稀释度。　　4.  计算Biotin/Protein摩尔比　　①A=生物素化的蛋白毫摩尔浓度＝蛋白浓度（mg/ml）/蛋白的分子量　　②B=500nm处的吸光度变化 △A500=（0.9×A500HABA/Avidin）-A500HABA/Avidin/Biotin　　③C=生物素的毫摩尔浓度=mmol Biotin/ml反应溶液=△A500/（34,000×光程）　　④Biotin/Protein摩尔比=C•10•稀释倍数/

牛血清白蛋白是血液中的主要成分（38g/100ml），分子量68kD，等电点4.8，含氮量16%，含糖量0.08%，仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。牛血清蛋白溶液可以作为测量蛋白质含量的标准曲线用。一般买回来的牛血清蛋白是细小片状的乳白色粉末。牛的血清蛋白也以铁为基本原料。1、特纯级牛血清蛋白用途：用作酶标、金标等诊断试剂的封闭剂，生化试验等。电场対超感牛血清白蛋白截留率的影响性状：淡黄色干燥粉末2、无脂肪酸牛血清蛋白用途：用作酶标、金标等诊断试剂的封闭剂、保护剂，尤其适用于容易受脂肪酸影响的产品和试验。性状：淡黄色干燥粉末3、无蛋白酶牛血清蛋白用途：用于酶标、金标等诊断试剂的封闭剂、保护剂，尤其适合血液脂类的诊断试验、脂类诊断试剂及对纯度要求高的产品。性状：淡黄色干燥粉末4、细胞培养级牛血清蛋白用途：无血清培养基的蛋白添加剂，供细胞培养使用。性状：淡黄色干燥粉末白蛋白

  凝胶层析分离物质的优缺点  1.凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质—凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。  2.分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100%。  3.分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。  4.应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽，如SephadexG类为102～105d；Sepharose类为105～108d。  5.分辨率不高，分离操作较慢。由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分离时流速必须严格把握。因而分离操作一般较慢。而且对于分子量相差不多的物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异吸附现象。  凝胶层析的应用  ⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。  ⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。  ⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的的分子量。  ⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。

生物素，是一个分子量只有244.31Da的小分子，经活化后可与蛋白、抗体等生物大分子结合，不仅可以很好地保持大分子的生物活性，而且与亲和素结合使用时具有多级放大作用，使其广泛应用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究。那么如何使用生物素标记抗体或蛋白呢？下面远慕给大家分享一下。工具/原料1. 10ul，50ul，200ul，1000ul可调高精度移液器2. 恒温箱（37℃）3. 离心机（离心力可达到12,000×g）4.生物素标记试剂盒（Cata.No:EBLK0002, Elabscience)实验前准备1.仔细阅读使用说明书。2.计算待使用NH2-Reactive Biotin的量。3.提前20min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温（注：不需要用到的NH2-Reactive Biotin继续放置冰箱中）。4.溶解NH2-Reactive Biotin：加入30ulDMF至NH2-ReactiveBiotin瓶中，静置10min，待其充分溶解，此时生物素的浓度为10mM。操作步骤：（本操作步骤按照1mg的量进行标记）1.取1mg待标记抗体于Filtration tube中，并加入相应体积的Labeling Buffer，使抗体的终浓度为2mg/ml，12,000 x g离心10min。（注：①Filtration tube的最大体积为0.5ml②待标记抗体浓度低时，可先超滤离心一次）2. 加入13.3ul NH2-Reactive Biotin 和适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使终体积为0.5ml，并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育30min。12,000 x g离心10min。3. 加入适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使终体积为0.5ml，并轻轻吹打混匀，12,000 x g离心10min。4. 操作3重复一次。5. 加0.2ml Labeling Buffer至Filtration tube中，轻轻吹打。将滤芯倒转放置于另一个离心管中，6,000 x g离心10min。6. 收集离心管中的溶液，即为生物素标记的抗体。

　　DAB染色液用于免疫组化染色，应用在Dako 自动染色系统上。　　DAB染色液的使用方法　　1.DAB显色液配制　　10mM Tris-HCl (pH7.6)   9mL  +DAB (diaminobezidin 3，3-二氨基联苯胺) +0.3%(W/V)  NiCl2 或CoCl2   1mL ,显色时加入5-10mL 30%H2O2 混匀后立即使用　　2. 显色　　准备好含有待测蛋白的固相膜：包括电泳、转印、封阻、一抗（或生物素）处理、辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗（或链霉亲和素）处理、清洗等步骤。　　3.加入适量的DAB显色液，铺满整个固相膜表面（可按比例增减）。　　4. 置于平式摇荡仪上，在室温下孵育2至5分 钟，避免光照（暗室操作），直至棕褐色沉淀出现。　　5.用镊子夹起固相膜，放进无离子水里清洗。　　6.空气中晾干。　　7. 拍照记录 。　　DAB染色液的注意事项　　1． DAB溶液应低温密封保存。如有结晶析出，应确保结晶完全溶解再行使用；　　2． 显色工作液应现用现配，新鲜配制的工作液应为无色或浅棕色，如颜色过深，请勿使用；　　3． DAB在常温下不稳定，每次取用后均应及时加盖密封放回冰箱，以免因DAB分解影响实验，或因渗漏造成实验环境污染；　　4． DAB有潜在致突变作用，操作时应注意穿戴好防护用具。

辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP），是临床检验试剂中的常用酶。该产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多个同工酶组成，分子量为40,000，等电点为pH3～9，酶催化的最适pH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右（最高可达3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。用途（1） RZ＞3 活性 ＞250u/mg， 主要应用于免疫学，是高纯度的过氧化酶。采用特殊色谱纯化技术以除去会影响免疫学反应的同工酶B .（2） RZ＞2 活性 ＞180u/mg ，主要应用于临床化学，我们的客户也有将这个规格的产品应用于免疫学研究的。此时，一个标准化的分析方法就变得尤为重要。（3） RZ＞1 活性 ＞100u/mg，主要应用于血糖试纸和尿液分析试纸。（4） RZ＞0.6 活性 ＞60u/mg ，主要应用于尿液分析试纸。

昆虫表达体系是四大蛋白表达系统（原核细胞，酵母，昆虫细胞，真核哺乳动物表达体系）之一。昆虫表达系统的原理是通过将转移载体中的表达组件转座到大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体上，提取穿梭质粒DNA转染昆虫细胞后，得到的子代病毒即为重组病毒。将病毒上清侵染昆虫细胞，获得表达的重组蛋白。昆虫表达体系有很多优点：1、具有糖基化，乙酰化，磷酸化作用等蛋白翻译加工修饰；2、易于操作。杆状病毒基因组较小，分子生物学特性简单；3、昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养；4、可表达较大的外源性基因而不影响本身增殖；5、可以高效表达外源基因。一、常见的蛋白表达系统为了表达和纯化目的蛋白，常见的蛋白表达体系包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞表达系统和体外翻译体系等，其中实验室中比较常用的是大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达细胞。大肠杆菌可以表达一些对于翻译后修饰没有什么要求的蛋白，操作最简单便捷，适合低成本大量表达目的蛋白；昆虫细胞可以表达一些需要简单的糖基化修饰等的蛋白，操作比大肠杆菌复杂但比哺乳动物细胞要简单一些，目的蛋白的表达纯化的成本高于大肠杆菌但低于哺乳动物细胞；哺乳动物细胞适合表达需要复杂翻译后修饰的蛋白，目的蛋白的表达纯化的成本相对较高。体外翻译系统大多用于蛋白翻译的研究，仅在特殊情况下才会用于目的蛋白的表达和纯化；酵母用于目的蛋白的表达和纯化相对比较常见一些，其中获得的蛋白的修饰程度和成本介于大肠杆菌和昆虫表达系统之间。昆虫或者哺乳动物表达系统，相当于把生物体作为了反应器，用于表达和纯化所需的目的蛋白。产品中包含了大肠杆菌蛋白表达纯化系统、昆虫细胞蛋白表达纯化系统和哺乳动物蛋白表达纯化系统。提供的大肠杆菌蛋白表达纯化系统主要采用pET系列质粒，转化到BL21系列等菌株中，进行目的蛋白的表达，后续使用镍柱或GST柱进行目的蛋白的纯化。该系统不仅适合小量目的蛋白的表达纯化，也适合较大量的目的蛋白的表达纯化。昆虫蛋白表达纯化系统，可以采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统, 通过LipoInsect?转染试剂感染Sf9等昆虫细胞，最终通过镍柱、GST柱等方法进行目的蛋白的表达和纯化。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是由Luckow等人于1993年发展的一种快速有效产生重组杆状病毒的方法，也是到目前为止使用最为广泛的昆虫表达系统。哺乳细胞表达系统包括小量目的蛋白的表达纯化和大量目的蛋白的表达纯化两种。进行小量目的蛋白的表达纯化时，通常可以采用pCMV等系列真核表达载体，使用脂质体或磷酸钙等转染试剂转染细胞后，进行目的蛋白的表达，随后可以采用目的蛋白抗体或所带的标签抗体进行免疫沉淀，也可以考虑采用镍柱或GST柱进行目的蛋白的纯化；进行大量目的蛋白的表达纯化时，可采用Lipo293F?转染试剂大量转染293f细胞，从而实现大规模的蛋白表达与后续的纯化。二、昆虫蛋白表达和纯化系统昆虫杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression Vector Systems, BEVS)是一个二元系统。第一个部分是病毒感染的昆虫宿主，通常是鳞翅目昆虫细胞系，有时也可以是鳞翅目的昆虫。第二个部分是杆状病毒表达载体，其功能是将编码目标蛋白的外源基因导入宿主细胞中、组装杆状病毒并进行目的蛋白的表达。1.昆虫细胞鳞翅目昆虫(Order Lepidoptera)包括蛾(moth)和蝴蝶(butterfly)，它们是杆状病毒家族中多种病毒的宿主。目前已经建立了超过250种的昆虫细胞株。杆状病毒表达载体涉及的最常用的鳞翅类昆虫细胞株有两个，其中一个是Sf9, 由Smith和 Summers在1987年亚克隆IPLB-SF-21而建立的。IPLB-SF-21细胞系是在1977年从草地贪夜蛾(又称为秋天行军虫)蛹的卵巢组织中分离出来的；另外一个是HighFive, 最初是从粉纹夜蛾(又称为甘蓝银纹夜蛾)(cabbageIooper)的成熟卵巢组织中分离到的细胞株。Sf9/Sf21和HighFive两种细胞系都能以贴壁或悬浮状态生长。通过感染在培养板或培养瓶中生长的 Sf9/Sf21或 HighFive细胞，可以很方便地实现实验室规模的蛋白质生产的目的。昆虫细胞培养的条件和方法与哺乳动物细胞的培养方法不太一样，昆虫细胞的培养温度是25-30℃，最适温度是28℃而不是37℃；另外，Sf9/ Sf21和HighFive细胞贴壁不紧, 在传代培养时不需要EDTA或胰酶(trypsin)处理；昆虫细胞的生长也不需要CO2培养箱，因为昆虫细胞培养液通常是用磷酸盐而不是碳酸盐作为缓冲液。Sf9/Sf21和HighFive细胞都可以在有或没有血清的培养液中生长。多种不同的昆虫细胞培养液都能够从多个不同的制造商买到，其中包括ExpressionSystems、Invitrogen(GIB-CO)、HyClone和Sigma-Aldrich。有血清培养液主要有Grace's insect cell culture medium，TNM-FH，IPL-41,TC-100和Schneider's insect medium等，而无血清培养液主要有SF-900II SFM，SF-900III SFM和Express-Five SFM等特别适合蛋白的大规模表达。需要指出的是，Sf9/Sf21和HighFive细胞都会倾向于逐渐适应某种特定的培养液，如果突然将它们的培养液从有血清培养液变为无血清培养液时往往会导致培养细胞的损失。因此通常建议采用"缓慢培养液更换法"，如在连续传代中，应该将无血清培养液的比例从0% 依次升高至25%、50%、75%，直至100%。即使使用这种相对缓慢的血清戒除法，当将细胞刚刚置于不含血清的培养液时，这些细胞也会经历短暂的生长停止或生长缓慢，但这些细胞会在新培养液中缓慢生长12天后恢复至正常的生长速率。"缓慢培养液更换法"不仅可实现从有血清培养液到无血清培养液的转换，还可以用于将昆虫细胞从一种无血清培养液转移到另一种无血清培养液。昆虫细胞可作为杆状病毒感宿主而进行高水平的外源蛋白的表达，来自昆虫杆状病毒表达系统的重组蛋白通常具有正确的翻译后修饰和生物学活性，其翻译后蛋白修饰状态与哺乳动物类似，当然这种加工与哺乳动物细胞对蛋白质的加工并不总是相同，比较明显的一个例子就是蛋白的N-糖基化修饰有所不同。Invitrogen将一个最初命名为SfSWT-I的源于Sf9细胞的转基因昆虫细胞系命名为Mimic Sf9, 该细胞系具有更完整的N-糖基化途径，在含有血清的培养液中能够表达出人源化的重组糖蛋白。2. 昆虫杆状病毒表达系统与大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞等其它常用的重组蛋白表达系统相比，昆虫杆状病毒表达系统具有以下独特的优点：(1) 与大肠杆菌表达系统相比，对于某些容易在大肠杆菌表达系统中由于二硫键错误配对或者缺乏蛋白翻译后修饰(如磷酸化和糖基化等)而形成包涵体的蛋白，在大多数情况下，在昆虫表达系统中高水平表达的重组蛋白往往可溶，而且能折叠正确，并且含有对某些蛋白活力所必须的翻译后修饰(如磷酸化和糖基化等)。(2) 与酵母和哺乳动物表达系统等其它真核表达系统相比，外源基因表达水平高，非常适应大规模表达所需的高密度悬浮培养，而且比较容易分离纯化。(3) 昆虫细胞由于悬浮生长，容易进行放大培养，从而可进行大规模的重组蛋白表达纯化，昆虫杆状病毒表达系统广泛应用于科研和工业生产领域，重组蛋白产量最高可达1g/L。(4) 昆虫细胞可用于同时表达多种重组蛋白，可通过多种重组病毒同时感染昆虫细胞或用含有多个表达框的一种病毒感染昆虫细胞来实现。所以该系统特别适合表达多亚基的蛋白复合物以进行蛋白的结构功能研究等。(5) 生物安全性高。昆虫杆状病毒具有严格的宿主范围，通常仅限于非脊椎动物，因此具有生物安全性高这一特点。3. Bac-to-Bac杆状病毒表达系统Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是由Luckow等人于1993年发展的一种快速有效产生重组杆状病毒的方法，也是到目前为止使用最为广泛的昆虫杆状病毒表达系统。该系统主要包括以下两个组分：(1) 用于插入目的基因的pFastBac载体，在该系列载体中，目的基因的高水平表达由Autographa californica多核多角体病毒(multiple nuclear polyhedrosis virus, AcMNPV)的多角体启动子(polyhedrin(PH)promoter)驱动。载体多克隆位点的两侧均为Tn7元件，同时还含有一个庆大霉素抗性基因(gentamicin resistance gene)和形成mini Tn7所需的SV40 polyA signal。(2)含杆状病毒穿梭载体bacmid (bMON14272, 136kb)和辅助质粒(helper plasmid，用于表达转座必须的转座蛋白) pMON7124的大肠杆菌DH10Bac宿主菌株。Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统利用遗传转座(genetic transposition)得到重组病毒。DH10Bac宿主包含的bacmid bMON14272含小型F复制子，卡那霉素抗性基因，mini-attTn7位点和lacZα互补因子(可通过蓝白斑筛选)；辅助质粒pMON7124包含四环素抗性和tnsABCD区域，该区域表达转座反应所需的转座蛋白。当pFastBac重组质粒转化进入DH10Bac细胞后，pFastBac载体上的mini-Tn7位点和DH10Bac宿主菌中bacmid上的mini-attTn7位点之间发生转座(transposition)，产生重组bacmid。该转座会导致bacmid上的LacZ基因的破坏，因此可以通过在细菌培养平板上进行蓝白斑筛选来鉴别含有重组bacmid的DH10Bac菌落，从白色菌落的DH10Bac克隆中可分离出含有编码目的基因的重组bacmid DNA，后者进一步感染昆虫细胞后可产生含有重组子的杆状病毒即可启动外源重组蛋白的表达。表达目的蛋白的杆状病毒在被扩增和滴度测定后，高滴度的杆状病毒即可用于感染昆虫细胞以进行大规模的目的蛋白的表达。4. Bac-to-Bac杆状病毒表达系统进行目的蛋白表达的实验步骤(1)把目的基因克隆至pFastBac系列载体产生重组质粒。根据pFastBac系列载体的多克隆位点选做合适的酶切位点，按照读码框插入待表达的目的基因序列。最后通过测序验证插入序列是否正确。(2)转化pFastBac重组质粒到DH10Bac大肠杆菌中，37℃培养48小时。可以选择pFastBac1-EGFP (D2802)作为对照质粒，可以选购DH10Bac甘油菌(D0346)用于制备感受态细胞。转化后利用蓝白斑筛选重组菌株。重组菌株由于转座会导致LacZ基因的破坏而呈现白斑，用于蓝白斑筛选的LB琼脂糖平板应含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG。(3)选做：挑取白斑，重新划线以确认获得的白色克隆是真实的白斑。平板含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG，37℃培养过夜。(4)挑取白斑，培养过夜。须使用含有50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素和10μg/ml四环素的LB培养液。(5)小量抽提试剂盒提取重组bacmid DNA。推荐使用杆状病毒穿梭载体bacmid小量提取试剂盒(D0031)提取重组bacmid DNA。重组Bacmid DNA应该分装冻存于-20℃，因为反复冻融会导致bacmid断裂等从而显著降低其转化效率。如两星期内使用，可保存于4℃。(6) 重组bacmid的PCR鉴定。利用 PCR反应对阳性克隆进行进一步的验证。PCR 反应所用引物为pUC/M13 forward primer (5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3')，和pUC/M13 reverse primer (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3')。没有发生转座的bacmid其所扩增所产生的片段长度为350bp，重组bacmid扩增所产生的片段的长度为350bp加上插入片段的长度。(7)重组bacmid转染昆虫细胞。推荐使用生产的昆虫转染试剂LipoInsect? (C0551)，将提取的重组Bacmid转染进入昆虫细胞。建议使用Grace's Insect Cell Culture Medium培养液进行转染，转染时如果使用的昆虫转染试剂LipoInsect?，实验步骤请严格按照其说明书进行。转染后，28℃培养24小时，细胞和细胞核开始变大；转染后24-72小时，细胞慢慢停止生长、脱落，细胞表面长出芽孢状结构；转染后72小时候细胞开始裂解，此时病毒开始释放到培养液中。如果同时转染了pFastBac1-EGFP (D2802)，在转染72小时后可以观察到大部分细胞呈现绿色荧光，转染后96小时几乎所有的细胞都呈现绿色荧光，这样可以作为整个病毒包装体系的阳性对照。(8)收集P1代杆状病毒。转染96小时后，收集培养液上清，500g离心5分钟以沉淀细胞和细胞碎片，取上清即为P1代杆状病毒。此时病毒滴度通常为1X106-1X107pfu/ml。P1代病毒可短期保存于4℃，或分装于含2% FBS的培养液中后在-80℃较长期保存。反复冻融会大大降低病毒活力，其滴度有可能降低10至100倍。(9)P1代杆状病毒的扩增。P1代病毒再次感染昆虫细胞可获得P2代病毒。如果采用悬浮培养的昆虫细胞进行病毒扩增，建议使用10ml培养液并且控制细胞密度为2X106/ml；如果使用6孔板贴壁培养的细胞进行扩增，细胞密度应为2X106/well，MOI (multiplicity of infection)为0.05-0.1(即每100个细胞用5-10pfu的病毒进行感染)。28℃培养48-72小时后，70-80%的细胞死亡时，收集细胞和上清，500g离心5分钟，取上清即为P2代病毒。此时病毒滴度约为1X107-1X108pfu/ml。可收集本步骤离心后的细胞碎片沉淀，加入适量的1X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(P0015A)，裂解后进行SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot检测，以分析确定目的蛋白是否已经正常表达。(10)选做：P2代杆状病毒的扩增。如果P2代病毒滴度仍然偏低，可对P2代病毒再次进行扩增，扩增方法同P2代病毒的扩增方法。P2代病毒感染昆虫细胞后最终会获得滴度更高的P3代病毒。(11)病毒感染昆虫细胞进行目的蛋白的大规模表达。可选择Sf9/Sf1/HighFive的任何一种细胞株进行蛋白大规模表达。但如果表达的是分泌蛋白，建议选用HighFive。建议在昆虫细胞的对数生长期进行病毒感染，此时细胞密度在1X106/ml -2X106/ml为佳，MOI可从5-10开始尝试。建议在不同的时间阶段，如感染后24、48、72或96小时收集细胞，裂解细胞，SDS-PAGE并进行Western Blot检测以确定最佳的停止蛋白表达的时间。因为昆虫细胞内有很多蛋白酶，表达时间过长会导致目的蛋白的降解。分泌蛋白的表达高峰通常在感染后30-72小时，而非分泌蛋白的表达高峰通常在感染后48-96小时。5. 目的蛋白的纯化利用pFastBac1进行目的蛋白的表达的时候，根据蛋白纯化方式的需要以及融合表达目的蛋白以提高其表达量的需要，可以在质粒构建时添加His标签或GST标签。为了防止额外添加的His和GST等蛋白标签影响目的蛋白的生物学功能和结构研究，可在融合蛋白和标签之间添加蛋白酶酶切位点，如TEV或PreScission的酶切位点。昆虫表达蛋白的纯化步骤和大肠杆菌表达蛋白的纯化步骤基本一致。如果蛋白主要以可溶形式表达，离心收集昆虫细胞，超声裂解细胞，但由于昆虫细胞内蛋白酶种类比较多，需要添加各种蛋白酶抑制剂。离心收集超声后上清，使用镍柱或GST柱等纯化目的蛋白。推荐使用BeyoGold? His-tag Purification Resin (P2210/P2218/P2220)进行His标签蛋白的纯化，推荐使用BeyoGold? GST-tag Purification Resin(P2250/P2251/P2253/P2255) 进行GST标签蛋白的纯化，同时可以利用离子交换、分子筛层析等进一步纯化目的蛋白。可以使用PreScission Protease (P2302/P2303)或者TEV Protease (P2307/P2308)进行柱上酶切或者洗脱后酶切(如果使用TEV Protease，我们推荐使用洗脱后酶切)以取代蛋白标签。纯化获得的蛋白，可以添加适量甘油后保存，或者如果有需要也可以适当浓缩后保存等。?。

　　昆虫细胞是主要提取来自昆虫的一类真核细胞。通过培养制造宿主的病毒，可以引起昆虫流行病，但对人畜和植物无害，因而可作病毒杀虫剂，还可以生产某些药用蛋白。细胞培养瓶是培养昆虫细胞常用的一种细胞培养耗材，那么在培养昆虫细胞时需要注意哪些问题呢？　　1、温度与环境：昆虫细胞一般应该在27℃、非湿化的环境中培养，建议不要进行二氧化碳交换，所以细胞培养瓶尽量选择密闭的盖子。　　2、培养基：不同细胞对培养基的需求也有所差异，应该根据细胞生长特性，选择昆虫细胞专用的培养基。　　3、贴壁昆虫细胞：细胞密度低于汇合状态的20% 时，细胞生长会受到抑制。健康状态的细胞是对数期收获的细胞，所以在传代时应选择对数期进行。但是，如果培养的是强贴壁性昆虫细胞，则应在细胞达到汇合状态或者刚刚开始从培养瓶底部脱离时进行传代，因为此时细胞容易脱离。　　4、贴壁昆虫细胞在无血清培养条件下，昆虫细胞与基质贴附非常牢固，需要花费较大力气才能使其脱落。要使细胞脱落，可以采用拍掌的动作快速振摇一下细胞培养瓶。为了避免污染，进行此操作前必须盖紧盖子。　　5、悬浮培养：一些昆虫细胞系可能需要一定的过程来适应悬浮培养。进行细胞悬浮培养时无需更换培养基，定期传代时需要吸出细胞悬液，然后加入适量培养基，将细胞稀释到适当的密度。添加新鲜培养基后可使细胞营养素达到完全补充。　　以上是细胞培养瓶培养昆虫细胞需要注意的五个方面，此外还要注意尽量不要剧烈摇晃细胞培养瓶，避免对细胞造成损伤。

　　2023年端午节时间为6月22日，星期四，根据《国务院办公厅公布2023年放假安排》2023年端午放假通知如下：2023年6月22日星期四端午节当天放假1天，与周六连休，6月25号星期日正式上班。　　节假日期间我司不安排人员值班，如有产品咨询以及技术问题留言到我司网站，我们会在节假日为您报价处理，感谢您对上海远慕生物的信赖和支持！在此我司全体员工提前祝各位科研人员以及新老客户节日快乐！　　2023.6.21    远慕生物特此通知。

酶抑制剂是指特异性作用于酶的某些基团，降低酶的活性甚至使酶wan全丧失活性的物质。是很多外来化合物产生毒作用的机理。可分为：①不可逆性抑制，抑制剂与酶活性中心的必需基团结合，这种结合不能用稀释或透析等简单的方法来解除。如有机磷农药与胆jian碱酶活性中心的丝an酸羟基结合，一些重金属离子与多种酶活性中心半胱an酸残基的－SH结合。②可逆性抑制，有竞争性和非竞争性两种，竞争性抑制是抑制剂和底物争相与酶结合，增加底物浓度可使抑制减弱，如丙二酸抑制琥珀酸脱氢酶；非竞争性抑制可以降低酶的活性，如qing化物能与细胞色素氧化酶的Fe3+结合成氰化高铁细胞色素氧化酶，使之丧失传递电子的能力，引起内窒息。

含量测定的定量分析法大类上主要包括：色谱分析法,光谱分析法，定量分析法。一、色谱分析法色谱分析法是一种分离分析方法，系根据混合物中各组分的色谱行为差异，将组分从混合物中分离后再选择性对待测组分进行分析的方法。因此色谱分析法是分析混合物的最有力的手段。1. 高效液相色谱法（HPLC） HPLC全称是High Performance Liquid Chromatography（高效液相色谱法），又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。HPLC检测方法，因对含有众多成分的复杂体系具有强大的分离功能，且分析速度快，其重现性和准确度优于薄层色谱法。是中药及其制剂含量测定的首选方法，中国药典大多采用 HPLC 进行含量测定。 1.1 高效液相色谱分析的流程由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。    1.2 高效液相色谱的分离过程同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C 在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。1.3 高效液相色谱含量计算一般分面积归一法，外标法，内标法，植物提取物用前两个比较多。面积归一化法：假定样品中的所有组分全部流出而且检测器对它们都产生信号，计算各杂质峰面积以及总和。该方法操作简单，不用标准品，结果相对准确，但是校正因子确定繁琐和重复性不好。国内植物提取物厂家很多为用的是这种检测方法。外标法：要用标准品，检测结果准确，但是受标准物质和线性范围影响。标准品分国产和进口的，有时客户会指定进口的标品，价格比较昂贵。内标法： 色谱分析中一种比较准确的定量方法，尤其在没有标准物对照时，此方法更显其优越性。内标法是将一定重量的纯物质作为内标物(参见内标物条)加到一定量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积(或峰高)及相对校正因子，按公式和方法即可求出被测组分在样品中的百分含量。检测结果很准确但是内标物选择困难。植物提取物一般不用。2. 薄层色谱分析法（TLC）薄层色谱分析法是将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，根据比移值(Rf)与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值(Rf)作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属于固－液吸附色谱。它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01μg）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。此外，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。3. 气相色谱法（GC）GC：Gas Chromatography 气相色谱法用气体作为移动相的色谱法。用气体为流动相流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法，一般用于测挥发物质的含量，比如农药残留 666，DDT 的检测用的就是这种方法。根据所用固定相的不同可分为两类：固定相是固体的，称为气固色谱法；固定相是液体的则称为气液色谱法。气相色谱系统由盛在管柱内的吸附剂，或惰性固体上涂着液体的固定相和不断通过管柱的气体的流动相组成。将欲分离、分析的样品从管柱一端加入后，由于固定相对样品中各组分吸附或溶解能力不同，即各组分在固定相和流动相之间的分配系数有差别，当组分在两相中反复多次进行分配并随移动相向前移动时，各组分沿管柱运动的速度就不同，分配系数小的组分被固定相滞留的时间短，能较快地从色谱柱末端流出。以各组分从柱末端流出的浓度 c对进样后的时间t作图，得到的图称为色谱图。二、光谱分析法当物质吸收辐射能或者热能后，其内部发生能级跃迁，记录由能级跃迁所产生的辐射能随波长的变化所得到的图谱成为光谱。利用物质光谱进行定性，定量和结构分析的方法称为光谱分析法。1. 紫外吸收光谱分析法（UV）UV检测法也是植物提取物常用的检测方法之一，UV全称紫外-可见分光光度法，是 Ultraviolet and visiblespectrophotometry 的缩写，是基于物质分子对紫外光区(波长200~400nm)和可见光区(波长为 400~760nm)的单色光辐射的吸收特性建立的色谱分析方法。UV检测也称紫外检测法、紫外光谱检测法。 UV检测法主要用于配合物组成及其稳定常数的测定。紫外光谱是分子中某些价电子吸收了一定波长的电磁波,由低能级跃近到高能级而产生的一种光谱，当分子中的电子吸收能量后会从基态跃迁到激发态，然后放出能量（辐射出特征谱线），回到基态；而辐射出特征普线的波长在紫外区中就叫做紫外光谱（UV）。1.1 UV定性分析在有机化合物的定性分析中，紫外－可见光谱适用于不饱和有机化合物，尤其是共轭体系的鉴定，以此推断未知物的骨架结构。此外，可配合红外光谱、核磁共振波谱法和质谱法进行定性鉴定和结构分析，因此它仍不失为是一种有用的辅助方法。一般有两种定性分析方法，比较吸收光谱曲线和用经验规则计算最大吸收波长λmax，然后与实测值进行比较。 结构分析可用来确定化合物的构型和构象。如辨别顺反异构体和互变异构体。1.2 UV定量分析紫外－可见分光光度定量分析的依据是Lambert-Beer定律，即在一定波长处被测定物质的吸光度与它的溶度呈线性关系。应此，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度可求出该物质在溶液中的浓度和含量。常用的测定方法有：单组分定量法、多组分定量法、双波长法、示差分光光度法和导数光谱法等。1. 原子吸收光谱法（AAS）原子吸收光谱法（AAS），全称是Atomic Absorption Spectrometry。是基于气态的基态原子外层电子对紫外光和可见光范围的相对应原子共振辐射线的吸收强度来定量被测元素含量为基础的分析方法，是一种测量特定气态原子对光辐射的吸收的方法。AAS基本原理是，每一种元素的原子不仅可以发射一系列特征谱线，也可以吸收与发射线波长相同的特征谱线。当光源发射的某一特征波长的光通过原子蒸气时，即入射辐射的频率等于原子中的电子由基态跃迁到较高能态（一般情况下都是第一激发态）所需要的能量频率时，原子中的外层电子将选择性地吸收其同种元素所发射的特征谱线，使入射光减弱。由于原子能级是量子化的，因此，在所有的情况下，原子对辐射的吸收都是有选择性的。由于各元素的原子结构和外层电子的排布不同，元素从基态跃迁至第一激发态时吸收的能量不同，因而各元素的共振吸收线具有不同的特征。原子吸收光谱位于光谱的紫外区和可见区。三、定量分析法定量分析法也称滴定法，是将已知浓度的滴定液(标准物质溶液)由滴定管滴加到被测溶液中，直至滴定液与被测物质反应完全(通过适当方法指示)，然后根据滴定液的浓度和被消耗的体积，按化学计量关系计算出被测物质的含量。四：目前植物提取物常见五种检测方法的应用领域检测方法应用领域高效液相色谱法（HPLC）标准植物提取物的常用检测方法薄层色谱分析法（TLC）被用于比例提取物的检测气相色谱法（GC）用来检测挥发性液体或油类紫外分光光度计（UV）标准植物提取物的常用检测方法原子吸收光谱法（AAS）用于提取物重金属含量的检测

细胞裂解液各成分的作用：1、第一种50mmol/L Tris-HCl是缓冲液，保证细胞裂解时PH值也能稳定，Tris是一种有机碱。2、第二种1.0 mmol/L EDTA是一种金属螯合剂。3、第三种150 mmol/L NaCl是等渗体系电解质，用于协调细胞膜内外离子平衡。4、第四种0.1% SDS是十二烷基硫酸钠，是一种表面活性剂和还原剂，有增溶作用。制备细胞裂解液实验流程：1. 收集胰蛋白酶消化的细胞并离心，用PBS清洗。2. 用100μl 裂解缓冲液冰浴溶解沉淀10min（每500000个细胞20μl裂解缓冲液）。3. 10000rpm，4°C离心10min，取上清转移至新管。4. 用考马斯亮蓝法检测蛋白质浓度。5. 用裂解缓冲液将溶液浓度调到5mg/ml，每小瓶中放100μl，-80°C储存。6. 按照1：1体积比混合2×样品缓冲液，煮沸5min后，室温放置5min。7. 短时离心后点样电泳检测。溶液准备：裂解缓冲液：0.15M NaCl, 5mM EDTA(pH 8.0), 1% Triton×100, 10mM Tris-Cl(pH 7.4); 使用前加 5mM DTT, 0.1mM PMSF 异丙醇和5mM ε-氨基己酸2×样品缓冲液：130mM Tris-HCl（pH8.0）, 20%（v/v）甘油, 4.6%（w/v）SDS, 0.02%溴酚蓝, 2%DTTPBS（pH7.4）：10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, 50mM NaCl, 2.7mM KCl 

  动物细胞融合也称细胞杂交（cell hybridization），是指两个或多个动物细胞融合成一个细胞的过程，融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。  诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（离心，震动，电刺激）。某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。  细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。 而动物细胞融合技术最重要的用途是制备单克隆抗体。  原理：细胞膜具有一定的流动性  促进动物细胞融合的诱导剂  动物：物理法、化学法（同植物）以及生物法（灭活病毒等）；  植物：物理法（离心、振动、电刺激等）和化学法（聚乙二醇（PEG））。  动物细胞融合也称细胞杂交（cellhybridization），是指在一定的条件下将两个或多个动物细胞融合为一个细胞的过程，融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞（hybridcell）。  诱导动物细胞融合的意义：突破了有性杂交方法的局限，克服了远缘杂交的不亲和性，使远缘杂交成为可能，为制造单克隆抗体提供了条件。成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。

一、细胞融合的方法有三种：生物方法、化学方法、物理方法。二、细胞融合也称细胞杂交,是指细胞通过介导和培养,在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合(合并)成一个核或多核的杂合细胞的过程。体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。三、化学诱导融合1.盐类融合法。此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。2.高钙和高pH值融合法。高Ca2+和高pH值可以诱发融合。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。3、聚乙二醇融合法(PEG法)。1974年发现的聚乙二醇(PEG)使不同科属的植物原生质体之间都可以融合，融合率可达30%。聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。PEG可与水分子借氢键结合，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，从而引起细胞融合。为了发挥PEG促进细胞融合的效力，必须采用较高的浓度(40%～50%，分子量为6000)，但PEG在高浓度下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。影响原生质体融合的因素很多。特别是环境中的阳离子存在，融合时的pH?也对原生质体融合有较明显的影响。一般来讲钙、镁离子有助于融合。如有钙离子存在时，可得到较高的融合率。但在缺乏钙离子时，若pH?较低，融合频率也较高。这是因为钙离子和带负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用，使原生质体带电，彼此易于附着发生凝集所致。PEG诱导细胞融合由于具有容易制备和控制、活性稳定、使用方便等特点，在细胞融合领域取得了可喜的成绩，大量的研究仍采用此法。虽然PEG作为融合剂有很多成功的报道，但存在着对细胞损伤大、残存有毒性、融合率较底及经验性大等缺陷。四、物理诱导融合1.细胞电融合技术细胞电融合是以脂质膜和脂质一蛋白质膜的电学性质为基础的，以双向电泳和电子击穿细胞质膜的联合作用为手段，和细胞电注射构成一对互补技术。在短时间强电场的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿(Reverisb?leb?reakdown)，瞬时失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟后恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时，即可诱导他们的膜相互融合，从而导致细胞融合。细胞融合分为两步：第一步是建立细胞间接触(cell-to-cell?contact)?；?第二步，接受区膜结构受扰动而紊乱，然后恢复并融合。根据其诱导细胞接触的性质，分为特异性和非特异性两大类。非特异性细胞电融合法是指在进行细胞电融合时，无法排除亲本细胞的自体融合而只进行双亲本间的细胞杂交融合。主要原因是细胞间的相互接触是无选择性的，是非特异性细胞聚集。非特异性电融合技术包括细胞物理聚集电融合法和细胞化学聚集电融合法。细胞融合所必需的两个步骤为：①细胞间接触；②接触区的膜结构受到瞬间扰动而导致融合。只要其中的任意一步有特异性，就能形成特异性的细胞融合。?2.激光诱导法。激光诱导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行破坏(或扰动)，可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实现融合。即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触，然后对接触处进行脉冲激光束处理，使质膜发生光击穿，产生微米级的微孔。这样，由于质膜上微孔的可逆性，细胞开始变形融合，最终成为一个细胞。使用此技术时，使细胞接触的方法可用①光俘虏法；②用低浓度的融合剂PEG?(5%?)使细胞聚法。目前，最新颖的方法是利用激光光阱建立两细胞间接触，即光镊利用激光高斯光束光场的梯度力把细胞从光束边缘拉向光束中间，在光斑直径与光波波长尺度相比拟时，指向束腰的轴向梯度力要大于沿光束方向的散射力，该梯度力把细胞竖直地拉到激光束腰下方处，从而实现对细胞的操作。细胞融合实验的注意事项1、整个制备过程需严格无菌及温度控制。2、细胞传代培养时注意适时更换培养液。3、SP2/0细胞与脾细胞比例需严格控制，这决定了融合率。4、融合细胞因细胞膜受损而特别脆弱，操作过程需温和小心。5、融合剂PEG的加入时间需准确把握，避免融合失败。

1. 细胞株取材要求新鲜，无菌，解剖小鼠时，注意不要损伤脾脏及其周围的脏器，尤其是肠道等，防止污染脾脏。2. 冲洗脾脏时要尽量洗净血污，去除无用组织，并要防止组织干燥。3. 碾磨后及时用清水冲洗筛网，防止组织、细胞阻塞网孔。4. 计数前，注意吸尽平皿里的细胞，充分混匀，使细胞分散成单个细胞。5. 实验操作应在操作台*无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。6. 金属器械不能在火焰中烧的时间过长，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。7. 另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。8. 吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。9. 不能用手触及已消毒器皿瓶口、瓶塞内部，吸管前部等所有可能与细胞接触的部分，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。10. 开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。细胞株防止因温度过高烧死细胞。11. 换液时倾倒废液，瓶口不能接触废液缸，速度不能过快，防止废液四溅。12. 吹打细胞时，要注意边角的细胞是否吹打下来。13. 手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上，即不可以在开放容器上方操作。14. 每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染。15. 注意自身的安全，对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂例如DMSO，并避免尖锐物品伤人等。16. 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但为对数生长期细胞。在冻存前一天换一次培养液。17. 将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤。18. 细胞株冻存和复苏用新配制的培养液。

1.动物细胞培养在所有的细胞离体培养中，困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。⑴血清:动物细胞离体培养常常需要血清。常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。有一天人们真正学会了配制和血清一样的培养液，那时血清才可被取代。在这里，血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。⑵支持物:大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃，高速冷冻离心机，塑料等作为支持物。⑶气体交换:二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件，每一次开箱操作后的快速恢复对设备的要求可想而知有多难?由此决定了动物细胞离体培养设备要求高、投资大。2.植物细胞培养⑴光照:离体培养的植物细胞对光照条件不甚严格，因为细胞生长所需要的物质主要是靠培养基供给的。但光照不但与光合作用有关，而且与细胞分化有关，例如光周期可对性细胞分化和开花调控作用，所以以获得植株为目的的早期植物细胞培养过程中，光照条件特别重要。以植物细胞离体培养方式获得重要物质，如药物的过程，植物细胞大多是在反应器中悬浮培养。⑵激素:植物细胞的分裂和生长特别需要植物激素的调节，促进生长的生长素和促进细胞分裂的分裂素是基本的激素。植物细胞的分裂，生长，分化和个体生长周期都有相应的激素参与调节。和动物细胞相比，植物细胞离体培养对激素要求的原理已经了解，其应用技术也已相当成熟，已经有一套广泛作为商品使用的培养液。同时解决了植物细胞对水、营养物、激素、渗透压、酸碱度、微量元素等的需求。3.微生物细胞培养微生物多为单细胞生物，野生生存条件比较简单。所以微生物人工培养的条件比动植物细胞简单得多。其中厌氧微生物培养比好氧微生物复杂，因为严格厌氧需要维持二氧化碳等非氧的惰性气体浓度，而好氧微生物则只需要通过不断搅拌提供无菌氧气。微生物对培养条件要求不如动植物细胞那样苛刻，玉米浆、蛋白胨、麦芽汁、酵母膏等成为良好的微生物天然培养基。对于一些特殊微生物的营养条件要求，可以在这些天然培养基的基础上额外添加。

大家在养细胞的时候，想必大家也一定遇到过细胞状态差这种情况，但是细胞状态差，有很多种原因造成。细胞状态很差，常常出现的现象是：细胞边缘不清晰、细胞不饱满、折光性差、背景比较脏、黑点很多、细胞碎片多（细胞凋亡后的细胞碎片）、单个细胞内有空泡（凋亡）且空泡比较多；如果细胞出现老化，也就是细胞比较扁平、增殖减缓、细胞核体积增大、细胞突触变多，此时观察到的细胞状态也是不正常的。所以，除了考虑血清和细菌污染的问题，细胞老化也不容忽视~何为细胞老化？1882年，德国生物学家Weismann曾大胆预测“在细胞水平存在老化现象”。他推测：机体的寿命限制受控于体细胞的分裂能力；在遗传进化中，不同物种的体细胞获得了不同分裂的潜能，从而决定了不同物种的寿命长短。20世纪50年代，Swin和他的同事利用原代细胞体外培养试验证明了来源于不同物种的纤维细胞均不具备无限分裂的潜能。取得突破性进展的还是Hayflflick和Moorhead，他们做了更系统更细致的观察和描述，他们对25株人成纤维细胞进行原代培养，在这个过程中发现，经过约50次传代之后，所有细胞出现功能退化，并且丧失分裂能力的现象。此后人们将这一现象称之为“Hayflflick极限”或者自发性老化。之后也有事实证明，细胞老化并不是体外培养所导致，细胞在体内也会随着年龄的增长，逐步走向老化。细胞老化的征兆细胞周期阻滞长期的细胞周期阻滞是老化细胞的基本特征，也是体外鉴定细胞老化不可或缺的指标。为了检查细胞是否跃出了细胞周期，人们通常检测增殖指示分子Ki-67的表达丰度；或者通过将与胸腺嘧啶相似的溴脱氧尿嘧啶（Bromodeoxyuridine，BrdU）掺入到细胞培养基中，观察是否有新的DNA合成。细胞老化主要表现为G1期阻滞，个别情况下也可伴随G2/M期周期阻滞，或直接由G2/M期阻滞诱发形成。细胞形态改变虽然由于细胞周期的中断和DNA复制的停止，老化细胞内的DNA含量与正常细胞类似，但 RNA与蛋白质丰度均比正常细胞要明显升高。这是因为，尽管细胞进入老化阶段后蛋白质的整体合成速率降低，但是蛋白质的降解体系受到更加明显的抑制，导致蛋白质在细胞内持续堆积。但，由于不同组织来源的细胞，其形态本就各不相同，因此，目前还并无客观的、统一的标准从细胞形态判断并定义老化细胞。换句话说，目前并不能直接根据细胞的形态去判断是否老化细胞。无论是原代细胞或是细胞株，在细胞培养过程中细胞老化现象是存在且常见的，但却容易被操作人员忽略，老化的细胞会出现的特征包括：细胞增殖变慢、细胞核体积异常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、细胞体积增大、细胞扁平、细胞质中出现空泡等现象。总结研究表明,衰老细胞的细胞核、细胞质和细胞膜等均有明显的变化：①细胞内水分减少,体积变小,新陈代谢速度减慢；②细胞内酶的活性降低；③细胞内的色素会积累；④细胞内呼吸速度减慢,细胞核体积增大,核膜内折,染色质收缩,颜色加深.线粒体数量减少,体积增大；⑤细胞膜通透性功能改变,使物质运输功能降低.形态变化总体来说老化细胞的各种结构呈退行性变化.衰老细胞的形态变化表现有：1、核：增大、染色深、核内有包含物 2、染色质：凝聚、固缩、碎裂、溶解 3、质膜：粘度增加、流动性降低 4、细胞质：色素积聚、空泡形成 5、线粒体：数目减少、体积增大 6、高尔基体：碎裂 7、尼氏体：消失 8、包含物：糖原减少、脂肪积聚 9、核膜：内陷分子水平的变化1、DNA：从总体上DNA复制与转录在细胞衰老时均受抑制,但也有个别基因会异常激活,端粒DNA丢失,线粒体DNA特异性缺失,DNA氧化、断裂、缺失和交联,甲基化程度降低.2、 RNA：mRNA和tRNA含量降低.3、蛋白质：含成下降,细胞内蛋白质发生糖基化、氨甲酰化、脱氨基等修饰反应,导致蛋白质稳定性、抗原性,可消化性下降,自由基使蛋白质肽断裂,交联而变性.氨基酸由左旋变为右旋.4、 酶分子：活性中心被氧化,金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+等丢失,酶分子的二级结构,溶解度,等电点发生改变,总的效应是酶失活.5、脂类：不饱和脂肪酸被氧化,引起膜脂之间或与脂蛋白之间交联,膜的流动性降低。那我们该如何防止细胞老化？1. 不要等细胞长得太满才传代。细胞太密会导致细胞状态下降，产生细胞接触性抑制。2. 细胞不要消化过度。采用胰蛋白酶消化细胞，会造成细胞表面一定程度的细胞损伤。3. 最重要的是使用优质的血清和培养基：干细胞对培养基中的内毒素非常敏感。除了要留意基础培养基的内毒素外，也要留意血清的内毒素。如果血清中内毒素≥3EU/ml时，干细胞很容易老化或死亡，导致细胞“亚健康”状态，导致实验受到影响。很多使用者，在血清在试用前，就会通过提早审核该批次《检测报告》，以决定是否入围进行试用。4. 在开始养细胞并传代时，也要特别注意冻存细胞，以保持细胞有种子库存在，可以有效避免细胞损伤。

在细胞培养中大多数动物细胞体外培养时都需要加入血清提供营养，但由于血清存在很多潜在风险，促使科学家们进行无血清驯化细胞的研究。所以，在1976 年Hayashi 等人提出了无血清培养基的概念，此后，大量生物医药学家开始对无血清培养基进行研制。80 年代后，无血清培养基的研究与制备广泛发展，到 90 年代已有一些商业化无血清培养基。与传统的培养基相比较，无血清培养基是不含动物血清，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、增殖的一种培养基。无血清培养基由于其组成成分相对清楚，制备过程简单，在现代生物技术学领域得到广泛应用。无血清培养基的组成和作用1.葡萄糖动物细胞培养基中添加的糖主要是葡萄糖，添加量通常在5-25mM之间。葡萄糖的主要代谢途径是通过糖酵解代谢成丙酮酸，进而降解成乳酸。这最终会导致乳酸在培养基中积累。代谢流研究分析发现，只有一小部分（约20-30%）的葡萄糖流向其它途径包括三羧酸循环和戊糖磷酸旁路。除了葡萄糖，研究发现，动物细胞也能利用谷氨酰胺作为主要的能量物质。谷氨酰胺的添加量常常高于其它氨基酸（2-4mM），也是很多细胞系生长需要的物质。在大多数情况下，谷氨酰胺和葡萄糖会分别被快速利用，在耗尽之前，会引起细胞生长抑制。2.氨基酸细胞不同，所需的特定营养也不同，同理，它们所需的必需氨基酸（动物体内不能自身合成）也是不同的。一些非必需氨基酸通常也会加入到培养基中，这是因为有些细胞系自身不能产生相应的氨基酸，从而会限制细胞生长。培养基中氨基酸限制会降低细胞生长速率和/或最高细胞密度。其它非必需氨基酸细胞可以产生，但是不足以维持最优生长。一些氨基酸如谷氨酰胺在培养基中不稳定，因此需要单独加入以维持其在一个合适的浓度水平。支链氨基酸被很多细胞包括MDCK细胞、人成纤维细胞、小鼠骨髓瘤细胞和BHK细胞等消耗得特别快。研究发现，当杂交瘤细胞利用谷氨酰胺利用率很低的时候，支链氨基酸被氧化的更多。同样，谷氨酰胺的消耗降低，丝氨酸的消耗就会升高。一些细胞系对氨基酸限制比其它细胞要敏感，因此，在大规模培养基中，补料策略非常重要。例如，谷氨酰胺浓度低，BHK细胞就会消耗更多的其它氨基酸，尤其是必需氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸和非必需氨基酸如丝氨酸和谷氨酸盐。3.盐为防止渗透压失衡，培养基的盐浓度需与渗透压匹配。培养基细胞生长标准渗透压是300mOsm/kg，这个渗透压适用于绝大多数细胞。值得注意的是，由于盐会改变培养基的渗透压，因此，向培养基中加盐的时候要特别小心。大多数细胞能承受的渗透压范围在270~330mOsm/kg。经常用的盐有Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-和HCO3-。它们几乎出现在所有的基础培养基中。4.微量元素培养基中添加了血清含有的无机微量元素，如Mn、Cu、Zn、Mo、Va、Se、Fe、Ca、Mg、Si、Ni和不常用的微量元素如Al、Ag、Ba、Br、Cd、Co、Cr、F、Ge、J、Rb和zr。这些微量元素激活酶的活性，也是大多数细胞生长所需的元素。无血清培养基中经常添加的元素是硒。硒的主要功能是抗氧化和促进细胞生长，硒以硒蛋白家族形式在动物细胞中发挥生理作用，目前已被确认的形式有11种，据研究，这些蛋白均参与抗氧化活动，如谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白酶。在某些情况下，特定微量元素的加入会降低对某种生长因子的需求。例如，在很多细胞如B淋巴细胞、MDCK和人二倍体成纤维细胞中，亚铁盐能够替代转铁蛋白。研究发现，钙参与细胞增殖活动，这对于很多过程如信号转导、细胞分裂和细胞黏附等过程很重要。钙调蛋白（一种钙激活蛋白）通过不同的浓度水平调节细胞分裂过程中的很多丝氨酸/苏氨酸激酶活性。钙浓度升高，对很多细胞如角质形成细胞和人二倍体成纤维细胞生长有利。降低培养基中的钙浓度，就会降低细胞间的黏附。在很多生产系统中，细胞结团是一个大问题，这会降低产量和细胞存活率。如降低培养基中的钙浓度，则可以避开这个问题的产生，而且这在很多搅拌培养系统中被证明十分有效。5.维生素培养基中的维生素和荷尔蒙浓度相对较低，它们被作为辅助因子利用，不同细胞系对它们的营养需求存在很大不同。因此，这些辅助因子在不同的培养基中变化很大。维生素对细胞的限制表现在细胞生长和存活上，但不影响最高细胞密度。培养基中的维生素水平随细胞种类的不同而不同。基础培养基配方如为HeLa细胞和小鼠成纤维细胞而设计的BME培养基含有生物素、叶酸、尼可酰胺、泛酸盐、吡哆醛、核黄素和硫胺。无血清培养基配方越复杂，例如F12、DMEM、M199，它含有的维生素种类就越多。每种维生素的含量都是根据具体的细胞系靠经验添加。因此，每种培养基都需要根据不同的情况而设计。6.缓冲盐在细胞培养过程中，HCO3-经常和二氧化碳环境（5-10%）配合使用作缓冲系统，这使得培养基的pH普遍维持在6.9-7.4，在培养箱或者摇瓶中，通过控制气体控制CO2，HCO3--CO2缓冲系统的缺点在于，离开CO2的环境，培养基迅速变为碱性。为防止这种情况发生，有机缓冲液Hepes（pH7.0）经常以~25mM的浓度加入培养基，这使得CO2的浓度可以降低至2%7.生长因子为促进细胞生长，经常在一些培养基中添加特定蛋白，在无血清或低血清的培养基中，这些蛋白能够为细胞生长提供基础物质。他们被称为“生长因子”。这类生长因子包括成纤维细胞生长因子（酸性FGF和碱性FGF）、类胰岛素生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、神经生长因子（NGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）和转化生长因子（TGF：α和β）。这些生长因子在1-10ng/mL的范围内均有活性。8.脂类在细胞内，脂类有很多作用。它们是细胞膜、外部信号传感器的组件，也是能量代谢之源。血清本身含有脂类，但是基础培养基配方通常不含脂类。某些脂类作为添加剂添加到无血清培养基中，显示有促进细胞增殖的作用。通常，血清中的脂类有脂肪酸、磷脂、卵磷脂和胆固醇。磷脂不但是细胞膜的主要构成组件，在调节生长的信号传导途径中也起到非常重要的作用。在细胞外，磷脂对很多细胞系的生长起促进作用。在很多贴壁细胞如MDCK、小鼠上皮细胞和其它肾细胞中，磷脂酸和溶血磷脂酸能促进它们生长。在无血清培养基中，其它脂类如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇可以促进人二倍体成纤维细胞的生长。胆固醇对大多数细胞也有促进生长作用，也是某些细胞（如骨髓瘤细胞）生长的必需成分。其它一些特定的脂肪酸，如油酸和亚油酸，在杂交瘤细胞的无血清培养的传代中也能提高生长速度和产量。无血清培养基的优势1.可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。2.避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。3.避免血清组分对实验研究的影响。4.有利于体外培养细胞的分化。5.可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。无血清培养基的缺点1.细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。2.成本较高。3.针对性很强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。