蛋白胨是一种外观呈淡黄色的粉剂，浓缩干燥而成的浅黄色粉末，具有色浅、易溶、透明、无沉淀等良好物理性状。可配制各种微生物培养基。一般来说，用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白(酪蛋白、肉类)和植物蛋白(豆类)两种。蛋白胨当中不仅含有丰富的氨基酸，特别是含硫氨基酸较多，而且含有更多的细菌生长需要的维生素和其它生长因子。是生物制药发酵及各种培养基制备的基础原材料。在培养基当中它起的主要作用是提供氮源。蛋白胨的用途：实验室用作培养基，培养细菌。食品中用作提高蛋白含量。用于饲料中显著降低了饲料厂的生产成本，是饲料行业中蛋白源不足的良好佳品。胰酪蛋白胨是一种优质蛋白胨，亦称胰酶蛋白胨或称胰蛋白胨。该蛋白胨系采用酪蛋白经胰酶消化后，浓缩干燥而成的浅黄色粉末，具有色浅、易溶、透明、无沉淀等良好物理性状。可配制各种微生物培养基。酪蛋白胨是用酪蛋白经胰酶水解精制而成，色泽呈淡黄色或白色。月示胨采用精蛋白为基质，经特殊水解提取制备的干燥粉末，营养极为丰富，可做多种培养基的基础。大豆蛋白胨是是用大豆为基质，采用新工艺提取而成的淡黄色粉末，含有多种营养成份，适合做微生物培养用原料。专门用于培养链球菌、肺炎球菌、布氏杆菌等，营养丰富，也可用做工业化生产的发酵原料。牛肉蛋白胨用新鲜精牛肉，采用最新工艺精致而成在培养基当中它起的主要作用是补充蛋白胨以及其它氮源的营养不足。多价胨采用先进生物提取工艺精致而成，为淡黄色干燥粉末，营养极为丰富，可做多种培养基的基础。适合奈瑟氏菌、沙门氏菌属等生长。骨蛋白胨系蛋白质分解产物，如将牛肉、酪蛋白、牛奶粉、白明胶、大豆蛋白、丝蛋白、血纤维蛋白等为原料，经不完全的水解工艺所得的产物。市售产品以淡黄至棕黄色粉剂为主。其分子量约2000左右。不同来源的蛋白质和不同的水解条件，其水解物中组成可千差万别。所以胨往往是一个复杂的多肽混合物。可溶于水，过热不凝固，在饱和硫酸铵中不发生沉淀但可为蛋白质沉淀剂所沉淀。可用作微生物和动物细胞培养基、特种功能性食品和化妆品的配料，也有用作啤酒等产品的稳定剂。可通过添加下方微信公众号与我们联系，感谢您对远慕生物的支持！

采样的基本原则采样的基本原则是：为了掌握总体物料的成分、性能、状态等特性，往往需要按一定方案从总体物料中采得能代表总体物料的样品，通过对样品的检测了解总体物料的情况。因此，被采得的样品应具有充分的代表性。有时采样的费用较高，在设计采样方案时可以适当兼顾采样误差和费用。但首先是要满足对采样误差的要求一、保证采样器具的无菌性1.玻璃器皿：采用干热灭菌方式进行灭菌，保证恒温、时间足够（但不可时间过长，导致玻璃器皿易裂纹而报废）。2.取样筐：使用前要用 75%酒精进行喷洒消毒3.取样勺、浓奶取样提子：要保证其清洁消毒，清洁后用 75%酒精进行擦拭消毒。4.取样袋：可现用酒精进行擦拭消毒，再在超净台用紫外灯照射消毒，（包装车间要在传递窗用紫外灯照射消毒）。5.电子称表面用 75%酒精消毒。二、人员操作1.保证手部的清洗、消毒：取样前及做样前都要先洗手再消毒。2.取样要具有代表性（随机样、目的样、综合样）且要标示清楚。3.取样完毕，不可在车间逗留，要及时将样品放入超净台，对其外表面进行紫外灯照射消毒。4.在要求的做样区域进行操作。5.做样前，要用 75%酒精棉球对样品袋口部进行擦拭消毒，再开口。6.往盐水瓶加样品时，要注意勺子或袋子尽量不接触瓶口。7.样品计量要准确，稀释倍数也要准确（1mL 吸管不允许将管口敲掉），进行 100 倍稀释时，1mL 吸管要伸入盐水中，不可以将样品管壁流下去，同时要避免将管底部捅破。8.盐水温度以 40℃左右为宜，不能过热，将部分微生物烫死，也不能温度太低，不能将奶粉溶解完全。9.进行稀释时，要摇匀，保证溶液的均一性。10.倾倒平皿时，要注意培养基瓶口不要接触到平皿；倾倒的培养基要适量，不可以太少，在培养过程中干掉，微生物亦死亡，以 15mL 左右为宜。11.做大肠菌群样时，要提前将乳糖胆盐培养基培养管按需要量备好，放入超净台对外表面进行紫外线灭菌。12.接二步时，要注意先将接种针（环）进行冷却，避免出现接不上菌落的情况发生，导致无法判断、确认。13.做样完毕，及时放入相应培养箱进行培养，并清理清洁超净台。可通过添加下方微信公众号与我们联系，感谢您对远慕生物的支持！

曾经有人做过这样一些实验：实验一：强电解质溶液的pH试验——在50mL去离子水中加入1.6g的Na2SO4，用NaOH和H2SO4调节pH，结果……实验二：中浓度缓冲渡pH的试验——250mL去离子水中加入pH6.86标准混合磷酸盐2.5g，用NaOH和H2S04调节pH，结果……实验三：多种缓冲剂混合溶液的pH试验——250 mL去离子水中加入pH 4.008标准邻苯二甲酸氢钾1.25g，pH6.86标准混合磷酸盐0.85g及pH9.18标准四硼酸钠0.92g，用NaOH和H2s04调节pH。看了上面的实验，是不是吓了一大跳？下面是小编今天要说的重点、重点、重点：从理论上讲，pH计和pH试纸所依据的测试原理是不同的！！！pH计：一般使用玻璃电极，其膜电位Em与待测溶液氢离子活度a（H+）之间的关系，符台能斯特方程，因此，pH计测量pH值时无需消耗H+或OH-。因此，pH计测得的值比较正确地反映了溶液的实际pH值！pH试纸：原理是基于指示剂的显色反应：试纸上含有一定量的指示剂，当它要从一种颜色变为另一种颜色就要消耗一定量的H+或OH-。当溶液中H+或OH不足以使指示剂从一种颜色变为另一种颜色，这就造成pH试纸无法准确显示溶液的pH。缓冲溶液缓冲理论指出：在缓冲溶液的缓冲范围内，H+或OH-的少量增加或减少溶液的pH基本上稳定不变，也就是说能够提供足够的H+或OH-使pH试纸变色，而溶液的pH基本不变，pH试纸不产生误差。当溶液的实际pH超出了缓冲范围，少许H+或OH-会引起溶液pH很大的变化。用pH试纸测试时，使溶液实际pH超出缓冲范围的少许H+或OH-不足以使试纸变色至实际的pH，而（浸润试纸的）溶液原本的实际pH已改变（回到缓冲范围附近），pH试纸往往仍显示缓冲范围附近的值，产生了误差。远慕生物总结：pH试纸测试时要消耗一定的H+或OH-，所以pH试纸极易产生误差！对于强酸性溶液及强碱性溶液，pH试纸一般不会不产生误差。pH试纸更多地体现了缓冲溶液的性质：在缓冲体系的缓冲范围内，pH试纸很好地显示溶液的实际pH；而在缓冲范围外，pH试纸的值就会偏离溶液的pH，严重的可达好几个pH单位……可通过添加下方微信公众号与我们联系，感谢您对远慕生物的支持！

培养基的质量是微生物实验室检测工作的基础，事关检测工作的准确性、可靠性，在微生物实验室检测工作中举足轻重。如果在工作中忽视任何一个环节的质量问题，都将导致检验结果科学性、客观性的偏离。因此，加强培养基的实验室质量控制，认真地做好培养基的质控工作，不断完善和提高培养基的质控水平，才能为微生物检测实验室提供高质量的培养基。培养基的制备流程1.培养基用水培养基制备用水应使用电阻率不小于30万Ωcm的蒸馏水或与其同质的水，最好不使用离子交换器生产的去离子水。2.称量称量时要用专用的角匙，避免交叉污染而影响检验结果；干粉培养基易吸潮，如有条件，尽量在湿度较低的房间称取培养基。干粉培养基应严格按照生产商提供的有关说明准确配制。3.复水复水时不得用铜锅或铁锅，以防有离子混入培养基中，影响微生物的生长；容器的大小需大于复水后培养基总体积的2倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基溢出；含有琼脂粉的培养基，在加热溶解之前可以浸泡数分钟；加热培养基时一定要进行搅拌，特别是琼脂类培养基。为避免烧焦和沸腾溢出，对于少量的培养基最好使用沸水浴进行加热。烧糊的培养基营养物质被破坏，并可产生有毒物质，如发现焦化，或未溶解均匀前培养基有溢出，该培养基即不能使用，应重新制备。对于琼脂类培养基进行再融化时应使用沸水浴或流动蒸汽进行加热,最多只能加热两次,第二次再融化后仍未用完的培养基应弃去。4.灭菌培养基应按培养基配方中.规定的条件及时进行灭菌，通常是121℃.15.min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份，含糖或特殊培养基，按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。已配制好的培养基必须立即灭菌，避免微生物生长繁殖而消耗养分，改变培养基的酸碱度。高温可破坏培养基的营养成分，还会使琼脂的凝胶强度下降，因此必须严格控制灭菌温度和时间，并且不可重复灭菌。高压蒸汽灭菌锅的压力表等要定期进行检定，并定期采用生物指示菌法或化学变色纸片对灭菌效果进行验证。5.pH测定微生物必须在适宜的pH范围内才能正常生长繁殖或体现其生物特性。灭菌前后PH会有所变化，所以灭菌前就要准备好，可以用1mol/L.Na0H或.lmol/L.HCL调整，注意不可反复调pH，否则会影响培养基的渗透压。6.配制好的培养基保存灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。所以建议平板倾注后立即使用。保存时,尽可能贮存在不会改变其成分的条件下，即避光或在4.℃.~.12℃冰箱密闭保存。如果保存时间超过2d,应将其放人密封的塑料袋中保存;配好的肉汤类培养基如果保存时间超过2个星期,应将其放在带有螺旋盖的试管或其他密闭的试管或容器中防止蒸发。可通过添加下方微信公众号与我们联系，感谢您对远慕生物的支持！

蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。蛋白质主要用于维持、生长、妊娠和泌乳等需要。因此蛋白质含量的检测成为一项日常性且必需性的工作。蛋白质含量测定的方法有微量凯氏定氮法、双缩脲法、folin―酚试剂法、考马斯亮兰法、紫外吸收法等。接下来远慕生物带你一一了解。蛋白质含量测定的几种方法 1.紫外分光光度法蛋白质分子中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，使蛋白质对280nm的光波具有最大吸收值，在一定的范围内，蛋白质溶液的吸光值与其浓度成正比，可作定量测定。该法操作简单、快捷，并且测定的样品可以回收，低浓度盐类不干扰测定结果，故在蛋白质和酶的生化制备中广泛被采用。但此方法存在以下缺点：1.当待测的蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基含量差别较大会产生一定的误差，故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的样品。2.若样品中含有其他在280nm吸收的物质如核酸等化合物，就会出现较大的干扰。但核酸的吸收高峰在260nm，因此分别测定280nm和260nm两处的光吸收值，通过计算可以适当的消除核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。但因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽经校正，测定结果还存在着一定的误差。2.Bradford法1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的原理，是一种能够迅速并且准确的定量蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收光的改变，从465nm变为595nm。蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度(最低检出量为1μg)。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子(如K+，Na+，Mg2+、)、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如TritonX-100，SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛用于蛋白质含量的测定。总氮量的测定——微量凯氏定氮法：当被测定的含氮有机物与浓硫酸共热消化时，分解出氮、二氧化碳和水，其中氮与硫酸化合成硫酸铵。由于分解反应进行得很慢，故可加入硫酸铜和硫酸钾或硫酸钠，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点，氧化剂(过氧化氢)也能加速反应。消化终止后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸氨分解放出氨;用水蒸气蒸馏，将氨蒸入过量的标准无机酸溶液中，全部蒸完之后，用标准的盐酸溶液滴定收集的氨量，准确测定氨量，从而折算出蛋白质含量。3.双缩脲法具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中能与Cu2+络合呈紫红色，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法进行测定，根据标准曲线进行计算可以确定蛋白质浓度。4.Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的经典方法，它是在双缩脲法的基础上发展而来的。它操作简单、迅速、灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。Folin-酚法所用的试剂由两部分组成，试剂A相当于双缩脲试剂。蛋白质中的肽键与试剂A中的碱性硫酸铜反应形成铜-蛋白质复合物。这个复合物可与试剂B中磷钼酸-磷钨酸发生氧化还原反应。由于磷钼酸与磷钨酸易被酚类化合物还原而呈蓝色反应。而蛋白质中的酪氨酸和色氨酸均可发生此呈色反应。颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色法测定蛋白质的含量。此法易受蛋白质样品中酚类化合物及柠檬酸的干扰。另外，试剂B中的磷钼酸-磷钨酸仅在酸性pH值时稳定，故在将试剂B加入到碱性的铜-蛋白质溶液时，必须立即混合均匀。以确保还原反应能正常发生。此法也适用与酪氨酸和色氨酸的定量测定。5.微量凯氏定氮法含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。可通过添加下方微信公众号与我们联系，感谢您对远慕生物的支持！ 

防止细胞培养出现污染的方法如下：1、从培养箱取放细胞前，用酒精清洁双手（或手套），尽量缩短开门时间和减少开门次数。培养瓶放入培养箱前，用酒精消毒表面，并稍等至酒精挥发后再放入，以免培养箱内滞留过多乙醇蒸气。2、操作的时候防护服、口罩、手套缺一不可。操作前，准备好所有实验所需物品，以减少走动，物品需有序摆放在超净台触手可及的地方，同时空留足够操作空间。3、操作时，试剂不用尽量及时盖上盖子，移至操作区外围，尽量不要从开口容器上经过。4、使用移液枪时，将容器倾斜以便于移液，切勿将枪杆碰触瓶口及内壁。一旦发生倒吸情况，要及时用酒精棉球擦拭，以免液体残留导致细菌滋生。5、冻存细胞时冻存管盖子需拧紧。复苏细胞时，从液氮罐取出冻存管，轻拧盖子，以确认盖子是否拧紧。动物细胞培养技术的应用(1)生产病毒疫苗、单克隆抗体、干扰素等。(2)利用动物细胞培养技术中的细胞贴壁生长和接触抑制的特点，可用烧伤病人自己的健康皮肤细胞培养出大量的自身薄层皮肤细胞，以供植皮所需。(3)培养的动物细胞用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性。可通过添加下方微信公众号与我们联系，感谢您对远慕生物的支持！

细胞分裂和细胞分化是多细胞生物个体发育过程中的两个重要事件，两者之间有密切的关系。通常细胞在分裂的基础上进行分化，而早期胚胎细胞的不对称分裂所引起的细胞质中转录因子的差异制约着细胞分化方向和进程。细胞分化发生于细胞分裂的G1期，在早期胚胎发育阶段特别是卵裂过程中，细胞快速分裂，G1期很短或几乎没有G1期，此时细胞分化减慢。细胞分裂旺盛时细胞分化变缓，分化较高时分裂速度减慢是个体生长发育的一般规律。例如，哺乳动物的表皮角质层细胞等终末细胞分化程度较高，分裂频率明显减慢，而高度分化的细胞，如神经元和心肌细胞则很少分裂或完全失去分裂能力。细胞分化与细胞分裂伴随发生但不完全平行。例如，有的细胞在下一步分化开始之前要先经过多次分裂；而来自一个同源群的细胞在进行分裂前可能处于不同的分化程度，桑椹胚(morula)和成体的软骨细胞都是明显的例子。可通过添加下方微信公众号与我们联系，感谢您对远慕生物的支持！

概念EMSA 称凝聚阻滞实验或凝胶电泳迁移率检测， 是一种用于研究转录因子和其相关的 DNA 结合序列相互作用的技术，能对各类转录因子的 DNA 结合活性进行定性和半定量分析，是一项研究细胞信号转导通路的关键实验技术。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。原理EMSA 主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针有互作。分类同位素标记探针特点：特异性强、敏感性高达到10-18mol水平，对操作人员身体有害非同位素标记探针------应用最为广泛特点：无需放射显影，采用生物发光或化学发光原理。灵敏度高，信号强EMSA的特异性常用实验技术中免疫组化、免疫印迹 ( WesternBlotting) 和 EMSA 均可用于转录因子检测，但三者的侧重点各有不同。免疫组化或免疫荧光技术可以较准确的反应转录因子的表达部位和表达细胞， Western Blotting 可以精确定量转录因子。但并非所有转录因子均可以与 DNA 结合以刺激基因转录，唯有 EMSA 技术可以反映转录因子是否具有 DNA 结合活性，故 EMSA 是证明细胞信号转导通路最终效应的必要实验技术。实验步骤（步骤来源与网络仅供参考）探针的标记①:探针标记的反应体系(1.75pmol/μl) 2μlT4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1μlNuclease-Free Water 5μl[γ-32P]ATP (3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1μlT4 Polynucleotide Kinase (5-10u/μl) 1μl总体积 10μl②:使用水浴或PCR仪37℃反应10min.③:加一定体积的终止液、混匀、终止探针标记.④:加入一定体积的TE、混匀.探针的纯化(视情况定）对于100μl标记好的探针，加入一定量的醋酸铵和无水乙醇在-70℃沉淀1h或在-20℃沉淀过夜在4℃12000g-16000g 离心30min 弃上清在4℃12000g-16000g 离心1min、吸去残余液体加入一定体积的 TE ,使沉淀溶解探针使用时间一般不超过3天，保存在-20℃实验中常见的问题：1、为什么看不到迁移带？1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。3）探针与蛋白无特异性的相互作用。4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。5）曝光或者成像时间过短。6) 在 Super-Shift EMSA 测定中看不到 Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因：a. 抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于 Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于 Super-Shift EMSA。b. 测定的活化的 DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到 Super-Shift 的带，也看不到 DNA/蛋白复合物的量的减少。c. 使用的抗体过度稀释。一般 10～20 ul 的反应液需要使用 0.5～1 ul 原倍的抗体。d. 多抗与 DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到 Super-Shift 的带，但应当可以看到 DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。2、为什么实验背景高？1）曝光或者成像时间过长。2）封闭时间不足或者效率不高。3）洗涤效果不佳。4）实验过程中膜没有一直处于湿润状态。3、EMSA 测定需要多少量的蛋白与标记的探针？对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化：一般所用纯化蛋白的量在 20～2 000 ug 间，用粗制核抽提液，需要 2～10 ug 蛋白形成特异的复合物。部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在 -80 ℃、探针应保存在 -20 ℃ 以防止降解。无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。4、用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为 6%，在特定条件下可用高或低的浓度。也可将 TGE 缓冲液（12.5 mM Tris，pH8.3，95 mM 甘氨酸，0.5 mM EDTA）用于不稳定的蛋白/DNA 复合物。在 4 ℃ 进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。5、Poly(dI:dC)，非特异性竞争 DNA，特异性竞争 DNA 在 EMSA 测定中的作用？Poly(dI:dC) 由肌苷和胞嘧啶组成。在 EMSA 反应中加入 poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中转录调节因子与标记探针的非特异结合。结合溶液中的 poly(dI:dC) 的用量需在正式实验前进行优化，一般用量大约在 0.05 mg/ml 左右。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入 poly(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过 50～100 ug。对核抽提液，每 2～3 ug 核抽提液用 1 ug poly(dI:dC)。可通过添加下方微信公众号与我们联系，感谢您对远慕生物的支持！

稀释是指对现有溶液加入更多溶剂而使其浓度减小的过程。在稀释后溶液的浓度减小，但溶质的总量不变。例如将一摩尔(约58.5克)的食盐(溶质)溶在一升的水(溶剂)中，溶液的体积摩尔浓度为1M，若再加入一升的水，溶液的体积摩尔浓度变为0.5M，但溶液食盐的总量仍为一摩尔。稀释倍数的公式稀释倍数就是稀释前溶液浓度除以稀释后的溶液浓度所得的商。要想知道如何配置稀释液，需要知道你原液的浓度。稀释倍数=原液浓度/(原液浓度×移取体积/定容体积)例如，你有一瓶100mg/L的溶液，要稀释3倍、5倍、10倍、20倍。现有300毫升的容量瓶或其他可定容的容器。稀释3倍，即移取100mg/L的溶液100mL，定容至300mL;稀释5倍，即移取100mg/L的溶液60mL，定容至300mL;稀释10倍，即移取100mg/L的溶液30mL，定容至300mL;稀释20倍，即移取100mg/L的溶液15mL，定容至300mL。试验样品稀释倍数的计算方法预估未知的大概范围，如100-500ug/ml，或1000-5000ug/ml，用预估浓度除以标准样品?2ug/ml，得到一个数，这个数接近100,200,500，1000，2000,5000这类的数，接近那个，那么未知样就稀释多少倍。如一个未知的预估值在3600ug/ml，3600ug/ml除以2ug/ml等于1800，那么这个未知样就得稀释2000倍。如果未知的预估值在3000ug/ml，3000ug/ml除以2ug/ml等于1500，那么这个未知样就得稀释2000倍或1000倍。总之，在仪器检测时的结果必须在标准样品1ug/ml,?2ug/ml,3ug/ml的中间，最好是正中间?2ug/ml附近。要是检测值超过，说明稀释倍数不够，用检测到的值再除以?2ug/ml，得到的倍数如12或18，即未知样还得至少稀释这个倍数的整数倍数10或20。可通过添加下方微信公众号与我们联系，感谢您对远慕生物的支持！

相信从事生命科学研究领域的小伙伴对于Western Blot一定不陌生吧，这是一个步骤繁多的常用基础实验，其中电泳过程至关重要，稍有不慎我们就只能对着 「微笑线」和 「皱眉线」 叹气，而质量好的电泳能让目的条带整齐，结果图让人眼前一亮。电泳的支持介质为聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶的聚合则由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体在自由基的催化下完成。丙烯酰胺介质为网状结构，小孔尺寸与生物大分子具有相似的结构，带负电荷的蛋白，在电场的驱动下从电极负极向正极迁移。分子量大的蛋白滞留在上方，小分子蛋白继续迁移，从而分离不同分子量的蛋白。在实验室中若要自行配制WB所需凝胶时需准备很多试剂和材料，包括：ddH2O，30%丙烯酰胺混合液，1.5M Tris（pH 8.8），1.0M Tris（pH 6.8）,10%SDS，10%过硫酸铵，四甲基二乙胺(TEMED)等。其中丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体具有神经毒性，作用具有累积性。APS也有一定毒性，对皮肤粘膜有刺激性和腐蚀性；眼、皮肤接触可引起强烈刺激、疼痛甚至灼伤，长期皮肤接触可引起变应性皮炎；吸入后引起鼻炎、喉炎、气短和咳嗽；口服则会引起腹痛、恶心和呕吐。TEMED具有强神经毒性，对粘膜和上呼吸道组织及皮肤有极大破坏作用，因此配置电泳凝胶必须注意个人防护，戴好各种防护装置，如口罩、手套，并在通风橱中进行，但依然常有很多研究人员因为实验操作不慎而受伤中毒乃至影响到生命安危。鉴于人们在自行配置中存在误触有毒试剂的风险以及人工配制胶质量的参差不齐，预制胶这个新兴种子选手逐渐走入了大众视野。预制胶拥有以下优点：1. 即开即用，无需自行配制所需溶液、灌胶、等胶凝固，节省了科研人员宝贵的时间和精力；2. 无需接触其中具有积累性神经毒性的试剂，大大降低了实验的安全风险；3. 性能优秀，分离能力强，分辨率高；4. 大规模生产，胶与胶之间重复性好，质量稳定，不像手工配置胶那样结果差异大；5．超长保质期：2-8℃可以稳定保存一年；随着预制胶的逐渐推广，有些商家更是推出了有如下买点的彩色凝胶试剂盒：1. 彩色上层胶：可制备红色或绿色上层胶，加样孔清晰易辨，方便上样及区分不同凝胶；2. 配胶过程短：可快速配置一块或多块彩色PAGE凝胶，无需复杂计算及配置，只需将等体积凝胶溶液及缓冲液混合，并加入少许促凝剂即可，操作简便；3. 稳定且环保：促凝剂无TEMED成分，避免难闻臭味，4度即可稳定保存。凝胶均匀，弹性好，不易碎，电泳蛋白带型美观；4. 条带清晰：小分子蛋白条带更清楚可见。在预制胶里，由于丙烯酰胺已经聚合成了聚丙烯酰胺，不再有毒性，彻底杜绝了丙烯酰胺对实验人员可能造成的人体毒害。在国外，大多数实验室都已开始使用预制胶，这使得蛋白电泳变得简便，检测更加快速，省去了自己配胶的诸多麻烦，实验效率得到显著提高。

一、蛋白质组学概述“蛋白质组”一词的英文是Proteome，它是proteins 和genome 两个词的组合，意思是proteins expressed by a genome，即为基因组表达的蛋白质。蛋白质组的概念是1994 年由Wilkins首先提出，并在1995 年7月的“Electrophoresis”上发表，指“一个细胞或一种组织基因组所表达的全部蛋白质”， 蛋白质组学(proteomics) 是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律。与基因固定不变的基因组不同，蛋白质组作为相应基因组所表达的产物随时间、地点、环境等条件变化。在同一机体不同的组织和不同细胞中、蛋白质的种类、数量不同； 即使同一组织或细胞在不同的发育阶段、生理状态、甚至不同的外界环境下，其蛋白质组也是在不断的变化之中； 在病理或治疗过程中， 与正常生理过程也不同。因此， 蛋白质组是一个动态的概念。其目的是从整体的角度分析机体内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平、修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用和， 揭示蛋白质功能与生命活动的规律。蛋白质组学的研究分为3方面:(1) 蛋白质大规模鉴定和转录后修饰的微特征研究。(2) 差异显示蛋白质组学，即蛋白质表达水平的研究， 对肿瘤等疾病的应用有着广阔的前景。(3) 蛋白质间相互作用和翻译后修饰的研究。分析不同蛋白质的表达可用来比较正常组织和肿瘤组织之间的差别，蛋白组学将成为鉴别疾病的标记物，可以阐述某种机制，这种机制在越来越多的分析中被应用。人类的基因组比预期要小的多，并且基因组计划中的肿瘤相关基因现在才被知道，然而较小的基因不能反映单一的蛋白质组。通常，广泛的翻译后修饰例如磷酸化、糖基化，蛋白水解处理作用都是很常见的方式。蛋白质翻译后修饰能够显著地改变蛋白质的功能，因此可以表达出细胞和组织特征。因此，在基因组中，蛋白组学的挑战之一就是通过蛋白效应器的知识理解组织特征，并且把它应用到临床中。二、蛋白质组学分析方法蛋白质组学可以利用蛋白微数列、电泳和质谱分析法检测、识别和特征标记的蛋白进行分析。这些方法有其独特的优点和局限性，根据各自能力评估蛋白质组谱。1.蛋白微数列技术蛋白微数列是将大量抗体或者大量组织蛋白质样品一次标记在载玻片上进行检测分析。这种方法能够检测大量蛋白质的存在或者大量组织样本表达的水平，但是这种技术在特异性和敏感性抗体的可用性方面是有限的。此外抗体的特异性必须通过免疫印迹证实，并且需要内部的对照，尤其是抗体的微数列没有预测的亲和力和特异性。尽管如此，大量商品化抗体的应用使得应用蛋白微数列成为可能。2.双向凝胶电泳双向电泳在1975年由O’Farrell发明,其原理是：*向基于蛋白质的等电点不同，用等电聚焦分离.第二向则按分子质量的不同用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分离，这种方法尤其适用于分子量相似的蛋白质。采用蛋白质组重叠群 , 即利用多个不同pH梯度和分子量上相互重叠的2-DE 图谱, 拼接成一张完整2-DE 图谱, 大大提高了分辨率和进样量, 这对于低丰度蛋白的检出十分有利。个别蛋白质可以被染色水解为肽，这些可以通过质谱分析法进行分析。肽的酶解图谱可以根据蛋白质的数据库进行分析。3.质谱分析法蛋白组学主要的工具之一就是质谱分析法。这种方法是将基因转变成气体离子后，根据投料比例分析蛋白质。吸解作用和离子化技术例如基质辅助的激光解吸离子化技术，为检测和分辨蛋白质提供了高水平的敏感度和度，这种技术的高敏感度和样品的简化使得这项技术便利化，但是它也存在局限性。分析复杂的样品例如血清相比检测蛋白困难大的多。

1、细胞裂解液细胞裂解液作用：(1) 利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；(2) 溶解蛋白；(3) 蛋白变性使其稳定；(4) 抑制蛋白酶活性。细胞裂解成分一般使用的是表面活性剂，常用的有曲拉通X-100（Triton X-100）、脱氧胆（deoxycholate）、乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P40，NP-40）、十二烷基磺酸钠（SDS）。其中Triton X-100和NP-40为非离子型，deoxycholate和SDS为离子型。不同裂解成分的裂解强度不同，一般来说Triton X-100和SDS的裂解能力较强，deoxycholate和NP-40的裂解效果较为温和，可以根据不同的实验需求选用不同的裂解液。2、蛋白酶抑制剂破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。蛋白酶抑制剂（protease inhibitor）从广义上指与蛋白酶分子活性中心上的一些基团结合，使蛋白酶活力下降，甚至消失，但不使酶蛋白变性的物质。各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。常用的蛋白酶抑制剂和各自作用特点如下：(1) 苯甲酰磺酰氟（PMSF）：抑制丝氨酸蛋白酶（如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；(2) 乙二胺四乙酸（EDTA）：作为螯合剂可逆抑制金属蛋白水解酶；(3) 胃蛋白酶抑制剂（pepstantin）：抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管紧张肽原酶，组织蛋白酶D和凝乳酶；(4) 亮抑蛋白酶肽（leupeptin）：可逆抑制丝氨酸、半胱氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血浆酶和组织蛋白酶B；(5) 胰蛋白酶抑制剂（aprotinin）：竞争性可逆抑制丝氨酸蛋白酶，如血浆酶，血管舒缓素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶；(6) AEBSF：一种水溶性的丝氨酸蛋白酶不可逆抑制剂，其抑制常数与PMSF和DFP的抑制常数相似，可以有效抑制胰蛋白酶（trypsin）、糜蛋白酶（chymotrypsin）、纤溶酶（plasmin）、激肽释放酶（kallikrein）和凝血酶（thrombin）等蛋白酶，作为PMSF和DFP的替代物，AEBSF的毒性更低、水溶性和水溶液稳定性更好。(7) 乌苯美司（I Ubenimex，NN，也称为bestatin）：竞争性，可逆的氨基肽酶抑制剂，对精氨酰氨基肽酶（氨基肽酶B），白三烯A4水解酶（显示环氧化物水解酶和氨基肽酶活性的锌金属蛋白酶），丙氨酰氨基肽酶（氨肽酶M /N），亮氨酰/胱氨酰氨基肽酶（催产素/血管加压素酶）（白三烯D4水解酶）有抑制作用；(8) N-（反式-环氧丁二酰基）-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺（E64）：半胱氨酸蛋白酶不可逆抑制剂；(9) 胃酶抑素A（Pepstatin A）：天冬氨酸蛋白酶可逆抑制剂。3、磷酸酶抑制剂细胞或组织裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，以各种方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化，从而影响后续的蛋白检测。因此在提取物中适量添加外源性磷酸酶抑制剂，有利于在之后的Western blotting、免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质和蛋白激酶活性测定等实验过程中抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，维持蛋白质的磷酸化状态。常见的磷酸酶有蛋白酪氨酸磷酸酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶，常用的磷酸酶抑制剂如下：(1) 氟化钠（sodiμm fluoride）：酸性磷酸酶可逆抑制剂；(2) 焦磷酸钠（sodiμm pyrophosphate）：丝氨酸/苏氨酸磷酸酶不可逆抑制剂；(3) β-甘油磷酸（β-glycerophosphate）：丝氨酸/苏氨酸磷酸酶可逆抑制剂；(4) 正钒酸钠（sodiμm orthovanadate）：碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶可逆抑制剂：(5) 钼酸钠（sodiμm molybdate）：酸性磷酸酶不可逆抑制剂；(6) 二水酒石酸钠（sodiμm tartrate dihydrate）：酸性磷酸酶可逆抑制剂；(7) 咪唑（imidazole）：碱性磷酸酶可逆抑制剂。

　　一、标准品的制备　　标准品的制备是非常复杂的问题，也是标记免疫分析中比较难于制备的一个成分。以下讨论的是实验室标准品(或商品化试剂中标准品)的制备。　　（1）基质的制备：如前所述，作为标准品的介质(基质)成分应与被测样品相同。对大多数用于测定血清中某物质的标准品，应用不含被测物质的零血清制备，以求反应的介质环境相当。但有时零值血清的制备十分困难，所以有些标准品用适当的缓冲液制备，并在缓冲液中加入一定量的载体蛋白(一般用1%～2%的牛血清白蛋白)，以便使其与样品的介质环境相近。　　零值血清的制备方法有：　　A、吸附法：血清中小分子物质如三碘甲状腺原氨酸 (T3)、甲状腺素(T4)等，可用活性炭吸附去除。这种方法简便，但待测物质难以清除干净，而且大分子活性物质不能用此法进行制备。　　B、反复冻融法：对大分子活性物质可选用低值血清，经反复冻融使被测物质失活。用这种方法可使某些蛋白类激素大部分失活，但也难以得到真正的零值血清。　　C、亲和层析法：用特异性抗体制备亲和层析柱，用以吸附被测抗原。用这种方法可以得到高质量的零值血清，但本法比较复杂而且成本也高。　　（2）标准物纯品的选择：应选择高化学纯和高免疫纯的纯品作标准品。其中免疫纯尤为重要，在标准品中不应含有与被测物质有交叉反应的物质。　　（3）标准品的制备：先用零值血清配置高浓度的标准品，然后根据实验系统的要求，用零值血清将高值血清稀释至应有的浓度，制成符合预定要求的，由不同浓度组成的系列标准品。　　二、标准品的鉴定　　（1）免疫活性的鉴定：选用高特异性的抗血清分别作公ren标准品(如WHO的国际参考品或国家标准品)的待鉴定标准品的剂量反应曲线，并观察两条曲线的平行性。如两条剂量反应曲线平行，说明两种物质对同一抗体有相同的亲和力，即二者是同质性物质。如两条剂量反应曲线不平行，说明两种物质具有异质性，因而这一待鉴定的标准品是不能使用的。　　（2）浓度的标定：用已鉴定过的，免疫活性合格的标准品，与公ren的标准品作浓度相同的剂量反应曲线。此时，两条剂量反应曲线应该是基本重合的。如果两者平行但不重合，则取两条剂量反应曲线的50%结合处的相应剂量( ED50 )计算二者的换算系数，然后调整待鉴定标准品的浓度，直至使两条剂量反应曲线wan全或基本重合为止。　　三、标准品的计量　　许多小分子抗原或半抗原已能得到纯品或进行合成，它们对作为标准品的要求可以得到基本的满足，其计量多直接用单位体积中的重量表示，如mg / ml、ng / ml 、pg / ml等。最近WHO推荐用质量单位取代重量单位，即mol / L、mmol / L、或nmol / L等。对大分子的活性物质则比较复杂。由于得不到绝对的纯品，故很难直接用单位体积中的重量或单位体积中的质量计量。因此，常用该物质的生物活性单位表示，如IU / L、mIU / L等。

标准品是标记免疫分析定量的依据。标准品的正确与否直接影响样品的测定结果。如果在连续测定中，或各实验室之间使用的标准品不一致，则可影响到实验结果的可比性。为此，对标记免疫分析所使用的标准品应满足如下要求。1、化学结构：原则上标准品应与被测物具有完全相同的化学结构，包括相同的立体化学结构。但在实际工作中，用化学结构完全相同的物质作标准品是十分困难的。这是由于一方面来源有限，另一方面有些被测物本身的化学结构还不清楚，或是有明显的异型性。所以有时也用结构类似的物质作标准品。此时，应充分了解这些物质与真正标准品之间的定量关系。2、化学纯度：所有通过化学合成法制备的小分子化合物，都应是高化学纯度的纯品。对某些蛋白类物质，则可能由于纯化的方法不同而有差异。对此，在最初建立该方法时，应与国际上公认的标准参考品或高纯度的纯品进行比对。3、免疫纯度：标记免疫分析是通过比较被测物质与标准品的免疫活性实现的，故被测物质与标准品对所用抗体的免疫活性应该完全一致，即两者对所用的同一抗体有完全相同的亲和力。因此，标准品的免疫纯度比其化学纯度更重要。4、反应介质：免疫学反应受反应介质和温度等条件的影响，所以理论上要求标准品和被测物应在完全相同的介质中进行反应。如测定血清中某物质的浓度，其所用的标准品也应溶解在无被测物的零值血清中；如测定尿液中某物质的浓度，其所用的标准品也应溶解在无被测物的尿液中等。但在实际工作中这一点很难做到。因为，血清中的成分十分复杂，因而无被测物的零值血清的制备非常困难，而且个体血清中还可能存在一些干扰物质。理想的标准品应该用与被测样品相同的基质(如血清)，先将被测物质完全去除，然后再加入已知量的被测物质的纯品。5、干扰物质：标准品中不能有干扰分析的物质。在作为标准品使用前，必须对那些从机体提取到的大分子物质活性进行测定。6、标准品的批量：为保证检测的连续可比性，每批标准品应有相当大的量，以保证在较长的时间内使用。每批标准品如保存的条件适当，在相当长的时间内可保持其浓度和免疫活性的稳定。这对于生产标记免疫分析试剂的厂家尤为重要。

　　药物杂质因其可能对药品质量、安全性和有效性产生影响，目前成为国内外药品监管机构的重点关注内容之一。那么，你知道药物杂质都是怎么划分的吗？接下来跟着远慕一起了解一下。　　杂质控制要合理，即合理地确定杂质检查项目与限度，合理地选择杂质检查方法。有机杂质在药品质量标准中的项目名称：　　1、以杂质的化学名称作为项目名称　　当被检查的杂质是已知化合物时(特定杂质)，就以该化合物的化学名称作为质量标准中的项目名称。例如:卡比马唑及其片剂中的“甲巯咪唑',阿司匹林中的“游离水杨酸”、磷酸可待因中的“吗啡”等。如果杂质的化学名太长,又无通用的简称,可选用相宜的简称或习称作为项目名称，并在质量标准起草说明中应写明该已知杂质的结构式。例如:肾上腺素中的“酮体”。　　2、以某类杂质的总称作为项目名称　　当杂质不能明确为单一物质而又知为某一类物质时，则以这类物质的总称作为项目名称。例如:硝酸毛果芸香碱中的“其他生物碱”、山梨醇中的“还原糖”和“总糖”、黄体酮中的“有关物质”、许多原料药物中的'残留溶剂'等。　　3、以检测方法作为项目名称　　当被检查杂质的结构未知，亦不属于具体的类别时，根据检查方法相应的名称作为项目名称。例如:“杂质吸光度”,“溶液透光率”、“易炭化物',“不挥发性杂质”等。　　杂质检查项目的确定　　1.杂质检查项目的确定要有针对性。药品标准中的杂质检查项目，应包括药物在质量研究和稳定性考察中检出的，并在批量生产中出现的杂质和降解产物。所以，原料药和制剂中的杂质检查项目，均应根据其起始原料、生产工艺及稳定性情况确定。　　2.尤其是降解产物和毒性杂质，通常均作为必须的检查项目。除降解产物和毒性杂质外，在原料中已控制的杂质，在制剂中一般不再控制。单一对映体药物，其可能共存的其他对映体应作为杂质检查。消旋体药物，当已有其单一对映体药物的法定质量标准时，应在该消旋体药物的质量标准中设旋光度检查项目。　　杂质限度的确定　　1.杂质限量的确定要合理，在确保用药安全有效的前提下，应考虑到生产的可行性及批与批之间的正常波动，还要考虑药品本身的稳定性。可以根据原料药每日剂量来制订质控限度。　　2.如果所制订的限度超过该限度值，就必须提供所订限度的合理性依据。有机杂质的限度规定应包括:每一个已知杂质、未知杂质及总杂质。在确定仿制药品的杂质限度时，应与已上市产品进行质量对比研究。　　杂质的研究规范　　制药企业应该按照经国家药品监督管理部门依法审查批准的规定工艺和规定原辅料进行药品的生产，如果变更生产工艺或原辅料，并由此而带进新的杂质，需对原质量标准进行修订，并应依法向有关药品监督管理部门申报批准。在新药的研发中，应该对新药中的杂质进行检测和安全性研究。　　杂质检查方法的选择与验证　　1.药物中杂质的检测方法包括化学法、光谱法、色谱法等，因药物结构及杂质的不同采用不同的检测方法。有机杂质的检测方法多采用色谱法，特别是HPLC法。　　2.用于杂质检查的分析方法要求专属、灵敏。为验证杂质分析方法的专属性，可根据原料药或制剂的生产工艺及储存条件,以中间体、立体异构体、粗品、重结晶母液、经加速破坏性试验后的样品作为测试品进行系统适用性研究，考察产品中各杂质峰及主成分峰相互间的分离度是否符合要求。　　3.当采用HPLC法检查有机杂质时，由于等度洗脱具有可能漏检杂质的缺点，所以国内外药典中也常常采用梯度洗脱，例如司帕沙星、丝裂霉素、地高辛、辛伐他丁等药物中有关物质检查都采用了梯度洗脱。　　4.分析方法的检测限一定要符合质量标准中对杂质限度的要求,检测限不得大于该杂质的报告限度。

在日常检测中，有的时候虽然我们的检测方法优良，仪器设备检定合格，环境条件满足检测要求，检测员技术娴熟，但是，往往得到的检测结果却不可能是绝对准确的。即使是同一个检测人员对同一个检测样品、对同一项检测项目进行多次检测，得到的结果也不会完全相同，总会产生各种不同的差别，换句话说，任何项目的检测都不可能是绝对准确的，测得值与真实值之间总是或多或少的存在着差别，即误差。1、实验室表示误差的常用术语有哪些准确度 测量结果与真实值之间一致的程度。（测量结果与真实值差值越小，准确度越高）准确度只是一个定性概念而无定量表达。精密度 相同条件下，多次平行检测结果相互接近的程度。（各次检测结果之间越接近，则说明分析检测结果的精密度越高）重复性 相同操作条件下，由同一检测人员，在同一实验室内，使用同一仪器，短时间内多次测量所得结果之间的最大差值。重复性条件 相同的条件、程序、人员、仪器、环境，以及尽量短的时间内完成重复测定。再现性 在不同的测量条件下，同一被测量的测定结果之间的一致性。2、误差的种类、产生原因及如何消除在定量分析中，由于各种原因造成的误差，按照性质可分为系统误差、偶然误差和过失误差。系统误差 系统误差又称可测误差。由某种固定的原因所造成的，一般有固定的方向，重复进行测定时重复出现。产生原因：1.仪器和试剂引起的误差，如容量瓶刻度不准，试剂纯度不够等。2.方法误差，检测方法不恰当引起的，如滴定分析中，反应进行的不完全。3.操作误差，操作不当引起的误差，如滴定分析中，检测员对滴定终点颜色不敏感，对终点判定有误。消除系统误差的方法：1.校准仪器对仪器设备进行校准，以校正值的方式，消除系统误差。如：被测样品的含量=样品的检测结果×校正系数。2.对照实验如方法比对、人员比对、留样再测、实验室间比对等。3.空白实验没有试样，其他条件完全相同，所得的结果为空白值。如：实测值=测得值-空白值。偶然误差 偶然误差是由于在测定过程中一系列有关因素微小的随机波动而形成的具有相互抵偿性的误差。产生原因：分析过程中种种不稳定随机因素的影响。如温度、湿度和气压等环境因素，仪器不稳定等。偶然误差是无法消除的，但可以通过增加实验次数减小。过失误差 过失误差也称粗差，是指工作中的差错，是由于工作粗枝大叶，不按操作规程办事等原因造成的。如读数错误、记录错误、测量时发生未察觉的异常情况等。过失误差无规律可循，但基本上是可以避免的。一旦出现了过失误差，就应该舍弃相关数据重新测量。另外消除过失误差的关键是实验人员必须培养专心、认真、细致的工作态度，并要不断提高理论和操作技术水平。3、在质量控制中如何应用误差理论误差理论在结果质量控制中，有着重要意义。质量监控的分类包括以下几种：1.定期使用有证标准物质（参考物质）次级标准物质（参考物质）对仪器和检测方法开展内部质量控制。2.参加国内或国际能力验证计划或实验室间的比对实验。3.使用相同或不同方法进行重复检测或校准。4.对存留样品进行再检测或再校准。5.分析一个样品不同特性结果的相关性。

  实验室试剂在开启后受到空气、水分、光照和温度的影响会发生物理化学变化，发生变质。一个实验室，难免会有或多或少过期的化学试剂。  过期的试剂还可以使用吗？  一般情况下，化学试剂的保质期为1-2年，有些性质稳定的保存期就长点，这取决于正确的保存方法。这就需要考虑存储条件是否符合说明书上的要求，例如温度、光照和湿度等，对于那些没有明确存储条件的试剂，更要注意存储条件，通常高温、暴晒和高湿度，非常容易造成产品的失效。  未开启的化学试剂，保质期到了未必就不能用。如果你之前能够记录周围环境的变化，特别是遇到一些极端的温度、湿度等环境的变换，就可以判断过期的试剂是否可以再继续使用。  如何预防化学试剂变质？  a. 密封  这是最普遍通用的方法。试剂瓶的材料和密封程度应根据试剂性质而定。如：强腐蚀的“三酸”和液溴，可用带磨口玻璃的试剂瓶，或是有塑料衬垫的螺旋盖的玻璃瓶，氢氟酸则应密封贮藏在银制或塑料制容器内，等等。  密封适用于易挥发、升华、潮解、稀释、风化、水解和氧化还原、霉变的所有化学试剂对于极易 分解产生气体的试剂，远慕生物提醒，一般不完全密封，要适当留有余地，否则可能使容器破裂。除了一般密封外，可再加蜡封，或用自制硝罗酊封口，如：三氯化铝、五氧化二磷等。  b.隔离  能和空气、水作用的试剂，如：很活泼的金属和非金属应隔离存放在对试剂相对而言稳定的液体或惰气之中，钾、钠、钙浸没在机油中，黄磷则浸没在水中贮放。这种隔离方法也称液封法，前者叫油封，后者叫水封。小编提醒，水封存也可使某些容易挥发的试剂减少损耗。如：在装有液态溴、二硫化碳的试剂中加一薄层水，就能大大减少挥发损失和空气污染。  实验室中无机、有机试剂种类繁多，性质各异，应注意合理分类存放。有机物、无机物分开，普通药品和危险的分开，氧化剂和易燃物、还原剂分解、易挥发性酸和碱分开。做到这几个分开，一可避免药品间的不良影响，二则即使有意外事故发生，也能免除药品的相互作用，而产生更大的隐患。  c. 避光  通常采用遮光性能较好的深棕色试剂瓶。将试剂放在暗处或遮光的专用试剂柜中。也可用照相纸的黑色厚纸包裹试剂瓶，如：浓硝酸、碘化钾、碘化钠、氯化汞的贮存就是如此  d. 低温  普通挥发性试剂常放置在阴冷处，如：浓硝酸、浓盐酸、氨水等。某些特殊的生化试剂则要贮放在水箱或冰箱之中，如：酶试剂等。  e. 通风  尽管装化学试剂的容器一般都处于密封状态，但也难免有跑、冒、漏、泄发生，在夏季高温天气，更易形成爆炸性混合气体，因此，贮藏室必须通风良好，应安装专用排风扇，并经常开启，使空气流通。  f. 适时  这是根据某些试剂的特性，特别是一些极易变质失效的试剂应采取适当措施，应做到适时配制、适时使用和及时处理。  如：极易氧化的氢硫酸溶液、氯水、溴水、碘水最好适时制备及时使用；做银镜反应的硝酸银溶液、氨水、乙醛溶液配好后，应及时使用才不致影响效果；硫酸亚铁溶液配好后应加些还原铁粉才能使其不被氧化；淀粉、蔗糖、蛋白质的溶液在使用后应及时清洗试剂瓶，以防霉变。

　　实验室细胞培养中常见的生物污染包括细菌污染、霉菌污染、支原体污染、黑点污染、真菌污染和原生动物污染。　　1.细菌污染　　细菌在普通倒置显微镜下呈黑色和细砂状。根据感染菌的种类不同，可能会呈现不同的形状，培养液一般会变得浑浊、黄色，对细胞生长有明显影响。　　2.霉菌污染　　正常情况下，培养基在 37℃ 培养箱中培养两三天，在倒置显微镜下仍保持透明，无杂质。一旦出现絮状杂质，显微镜下可见丝状和团块状漂浮物，菌丝明显。此时，虽然细胞仍在生长，但它们的生命状态会在长时间后逐渐恶化。　　3.支原体污染　　支原体是隐蔽的污染物，不能通过过滤去除。显微镜下没有任何可见的支原体污染迹象，比如细胞病变和浊度或 pH 值变化（即使在严重污染的培养基中），这样就会导致我们产生错误的安全感。而在牛血清中，支原体是最常见的微生物之一。　　4.黑点污染　　黑色的游动点能穿透滤膜并在空气中扩散。它们在低倍镜下显示为黑色圆点，在高倍镜下显示为可移动的黑色斑点。培养液也不浑浊，一般影响较小，因此细胞仍可使用。通常，黑点污染后，细胞生长良好，运动物体无明显增加，培养基的颜色和透明度无明显变化。在同一批血清培养的细胞中也可以发现类似的现象。　　5.真菌污染　　真菌污染后，培养基一般清澈，保持原色。细丝可以在显微镜下观察到。最初，一些真菌类似于死细胞碎片，但其中许多清晰可见，看起来像珊瑚，比较容易区分。此外，它们会慢慢长出细细的黑色细丝，因为它们生长得比较慢，不像细菌那样容易被发现，一旦发现培养基被污染，它们将很难存活。　　6.原生动物污染　　原生动物污染后，细胞培养基变得轻微浑浊。在显微镜下，大量的小点来回移动。虽然此时细胞仍能生长，但繁殖速度减慢，细胞生长状态不好，边缘不清，变得不透明。原生动物与细胞形成共生关系。同时，原生动物与细胞竞争营养。这种共生现象非常普遍，但以细胞为主，因为原生动物的数量相对较少，因而对细胞的正常生长没有影响，只有当它们达到一定数量时，才最终爆发成为恶性循环。　　细胞培养过程中细胞受到污染的原因：　　1，取放细胞时引起的污染　　细胞培养过程中，取放细胞是基本的操作，培养房开关门的瞬间，环境中的微生物或多或少会进入培养箱中，而且内外温差导致内门冷凝水的产生，极易吸附微生物，都是造成培养箱污染的风险因素。　　2，灭菌不彻底造成的二次污染　　细胞培养过程中，因其它操作问题（如培养基泼洒，水盘污染等），造成培养房的大规模污染也时常会发生，此时就需要对培养箱进行灭菌消毒，常规的消毒（如紫外照射）只能达到表面消毒的效果，特别是对真菌等顽固性污染，无法进行彻底灭菌，导致后续培养过程中细胞污染频发。

　　化学试剂按照形态的差异分为固体、液体、粉末、颗粒等不同种类，针对不同的试剂需要选用符合其特性的试剂瓶，所以试剂在取用时也会有所差别。　　为了防止试剂洒出来，同时避免试剂挥发，液体试剂主要存放在瓶口较小的细口瓶中，取用时遵循以下规则：　　1、用少量液体试剂时，常使用胶头滴管吸取，用量较多时则采用倾泻法。　　2、从细口瓶中将液体倾入容器时，把试剂瓶上贴有标签的一面握在手心，另一手将容器斜持、并使瓶口与容器口相接触，逐渐倾斜试剂瓶，倒出试剂。　　3、试剂应该沿着容器壁流入容器，或沿着洁净的玻棒将液体试剂引流入细口或平底容器内。　　4、取出所需量后，逐渐竖起试剂瓶，把瓶口剩余的液滴碰入容器中去，以免液滴沿着试剂瓶外壁流下。　　5、若实验中无规定剂量时，一般取用1至2 mL。定量使用时，则可根据要求选用量倚、滴定管或移液管。　　6、取多的试剂也不能倒回原试剂瓶，更不能随意废弃，可倒入指定容器内供他人使用。尤其在取用有毒试剂时，应严格遵照规则取用。　　化学试剂常具有危险性，如易燃易爆、易挥发、剧毒、易变质、易氧化等，在取用试剂时需要特别注意，熟知各种试剂的特性及取用规则，可以确保实验的安全性，避免发生危险事故。

琼脂糖凝胶电泳仪是以琼脂糖凝胶作为载体的电泳，广泛用于核酸研究。琼脂糖凝胶属于大孔胶，可分析分子量为107的大分子，这种大孔特性有利于免疫电泳和微量制备。琼脂糖形成凝胶后孔径的大小取决于琼脂糖凝胶浓度，琼脂糖凝胶浓度与平均孔径的关系如下：一、琼脂糖凝胶浓度为0.075%时，平均孔径为800nm。二、琼脂糖凝胶浓度为0.16%时，平均孔径为500nm。三、琼脂糖凝胶浓度为1%时，平均孔径为150nm。四、琼脂糖凝胶浓度为2%时，平均孔径为20nm。琼脂糖凝胶的浓度选择：目的产物大小80BP的片段，你可以用2.0%的琼脂糖凝胶进行电泳，琼脂糖以及TAE的量的多少，首先与你跑得样品的个数有关，因为你样品的个数决定了你胶槽的体积，胶槽的体积决定了你的TAE的量，决定了琼脂糖的量，比如说你胶槽的体积是20ml, 那么你要配2.0%的胶，就需要20ml的TAE和0.4g的琼脂糖。做胶的时候要注意一定要让琼脂糖充分溶解，可以煮沸，同时也要注意煮沸的过程中TAE的蒸发，我第一次做胶的时候，用烧瓶煮沸差点都蒸发光了；再就是加EB的时候以不烫手为标准，因为高于70度时EB会升华蒸发，过于冷却了会使EB的浓度不均；因为EB为致癌物质，所以操作时一定要注意做好自我保护；再就是胶槽要洗干净，梳齿一定要放正，免得跑出来的带不整齐。跑胶的时间和电压成反比，电压和电泳槽两个电极之间的距离成正比，一般是小于5V/cm. 因为你的片段很小，所以很有可能和引物二聚体无法区分，所以你再跑电泳时时间应该适当延长一些，可以使溴芬兰指示条带跑过胶的2/3处，因为时间长了，因物二聚体就会跑没了，而目的产物不会。

细胞的种类多种多样，大小和特性个不相同，故此细胞固定化的方法有很多种。归结起来，主要可以分为吸附法和包埋法两大类。吸附法利用各种吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定的方法称为吸附法。用于细胞固定化的吸附剂主要有硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体、和中空纤维等。酵母细胞带有负电荷，在pH3~5的条件下能够吸附在多孔陶瓷、多孔塑料等载体的表面，制成固定化细胞，用于酒精和啤酒等的发酵生产；在环境保护领域内使用的活性污泥中含有各种各样的微生物，这些微生物可以沉积吸附在硅藻土、多孔玻璃、多孔陶瓷、多空塑料等载体的表面，用于各种有机废水的处理，降低废水中的化学需氧量（COD)和生化需氧量（BOD）；各种霉菌会长出菌丝体，这些菌丝体可以吸附缠绕在多空塑料、金属丝网等载体上用于生产有机酸和酶等；植物细胞可吸附在中空纤维外壁，用于生产色素、香精、药物和酶等次级代谢产物；动物细胞大多属于贴壁细胞，必需依附在固体表面才能正常生长，故可吸附在容器壁、微载体、中空纤维外壁等载体上，制成固定化细胞，用于各种蛋白质的生产。包埋法将细胞包埋在多空载体内部而制成固定化细胞的方法称为包埋法。包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定方法。固定化酶及应用1．由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本高、不利于大规模使用。因此，酶在大规模生产中，使酶能反复使用，是很有经济价值的课题。固定化酶的使用，推动了酶在生产上的应用。固定化酶，就是将酶分子结合在特定的支持物上且不影响酶的功能。用于固定酶的底物有琼脂糖、丙烯酰胺、藻酸钠等。固定化酶技术的应用，一是可循环反复使用酶制剂。据报道，在某些情况下可使用上千次，极大地降低生产成本。二是在生产中，可通过离心法或过滤法把酶与反应液相互分开，在大规模的生产中所需工艺设备比较简单易行。三是稳定性能好等。2．采用固定化酶技术生产L-氨基酸。1969年日本利用固定化氨基酰酶，由乙酰化-DL-氨基酸连续生产L-氨基酸获得成功，是世界上固定化酶大规模应用的首例。1974年以来，已能将米曲霉的氨基酰化酶固ㄔ贒EAE-Sephadex上生产出L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸等。工业成本降低约40％，产品广泛应用于食品、医疗、农业等等。3．采用固定化酶生产高果糖浆。用α-淀粉酶将玉米粉水解生成寡糖，再用葡萄糖淀粉酶处理产生95％～97％葡萄糖。由于葡萄糖的甜度比蔗糖低得多，所以利用葡萄糖异构酶将葡萄糖异构化转变成果糖，就可以解决这一问题。现通过α-淀粉酶、糖化酶和固定化葡萄糖异构酶，将玉米粉转化成含葡萄糖50％、果糖42％、其它糖8％的反应物，称为高果糖浆或果葡糖浆。它虽然是一种混合物，但甜度与蔗糖相当，比葡萄糖高出许多。因此，在饮料、食品生产中大量应用。现在，一些发达国家高果糖浆的年产量已达几百万吨，高果糖浆在许多饮料的制造中已经逐渐代替了蔗糖。

pH值是培养基的常规监控项目，微生物的生长不仅依赖丰富的营养，还需要在适宜的pH值范围内才能正常生长繁殖或体现其生物特性，因此培养基pH值是否符合要求直接影响微生物检验结果。1、培养基配置：配料—溶解—调PH—过滤—分装—包扎—灭菌—摆斜面—贮存1.配料配方换算→在容器中加入少量水（蒸馏水，自然水）→按照配方称取各种药品（依次加入）→加足所需水量（一药一勺，取药后立即盖上瓶盖）。2.溶解淀粉溶解：少量冷水调成糊状加热溶解，特别是加有琼脂的培养基，一定要煮沸，琼脂的熔解温度95-97℃，且需要边加热边搅拌以防止烧焦。3.调PH用1N的盐酸或1N的 NaOH把培养基调节到所要求的值。4.过滤滤纸或棉花进行过滤。（有时可以省去）5.分装一般培养基放在三角瓶或试管中灭菌使用。(1)三角瓶若作静置培养，则100mL培养基/250mL的三角瓶，最多不能超过150mL培养基/250mL的三角瓶，否则灭菌时培养基沸腾容易污染棉塞，造成染菌；若作摇瓶培养，则15-20mL培养基/250mL的三角瓶，保证通气良好。(2)试管分装液体培养基一般装4-5mL，约试管的1/4高度；固体斜面培养基一般装3-4mL，约试管的1/5高度。6.包扎分装好后，塞上棉塞，在用牛皮纸将棉塞包裹好，防止灭菌时水份进入把棉塞弄湿。7.灭菌按配方上要求的温度、压力进行高压蒸汽灭菌。如果灭菌的温度太高，营养成分会被破坏，培养基中的糖、氨基酸会使培养基的颜色变深。8.摆斜面灭菌后需要摆斜面的试管要趁热斜着摆放，使其凝固成为一个斜面，约占试管长度的1/2。9.贮存培养基在30℃下放置一天，无污染的即可使用。一般用牛皮纸包裹好存放于2-8℃冰箱中备用注意事项：在配制时，首先要确保培养基未结块、颜色未发生变化或其他物理性状明显改变；应按照使用说明上的要求操作，称量应达到相应的精确度；纯化水是配制培养基最常用的溶剂，应确保溶剂的质量符合要求；配制培养基应采用干净且不会对培养基理化特性产生改变的容器。在分装前，应确保培养基完全溶解混匀，加热助溶是最常用的方法，应注意不要过度加热，尤其是含糖量较高的培养基，糖类不耐热的特性会使糖类在高温条件下产生有机酸而使pH值下降。2、培养基的pH控制培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。虽然培养基中含有缓冲物质成分，能使培养基的pH尽可能的保持在要求的范围内，但是配出的培养基若不符合要求，就要进行必要的调整。如果有已校准pH计，可用pH计，如果没有，可用精密的pH试纸，再根据需要用1 moL/L氢氧化钠或1moL/L盐酸（微调可用0.1氢氧化钠或0.1moL/L盐酸）调制所需的pH。培基的pH一般为7.4～7.6，也有酸性或碱性的。用氢氧化钠调整的需要高压灭菌的培养基，在调整pH时要调至高出所需0.1个～0.2个单位，因用氢氧化钠调整时，高压灭菌后，培养基的pH要降低0.1~0.2。如培养基中含有碳酸钙成分，可不pH。3、pH电极的维护保养目前，实验室使用pH计电极大部分都是复合电极。其优点是使用方便，不受氧化-还原物质的影响，且平衡速度快。使用时应注意以下事项：⒈复合电极不用时，可充分浸泡饱和氯化钾溶液中。切忌用洗涤液或其他吸水性试剂浸洗。⒉使用前，检查玻璃电极前端的球泡。正常情况下，电极应该透明而无裂纹；球泡内要充满溶液，不能有气泡存在。⒊测量浓度较大的溶液时，尽量缩短测量时间，用后仔细清洗，防止被测液粘附在电极上而污染电极。⒋清洗电极后，不要用滤纸擦拭玻璃膜，而应用滤纸吸干, 避免损坏玻璃薄膜、防止交叉污染，影响测量精度。⒌测量中注意电极的银—氯化银内参比电极应浸入到球泡内氯化物缓冲溶液中，避免电计显示部分出现数字乱跳现象。使用时，注意将电极轻轻甩几下。⒍电极不能用于强酸、强碱或其他腐蚀性溶液。⒎严禁在脱水性介质如无水乙醇、重铬酸钾等中使用

01、PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。02、假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备②引物的质量与特异性③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。一、模板1、模板中含有杂蛋白质2、模板中含有Taq酶抑制剂3、模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白4、在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚5、模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。二、酶失活需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。三、引物引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。四、Mg2+浓度Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。五、反应体积的改变通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul.或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。六、物理原因变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。七、靶序列变异如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。03、假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。一、引物设计不合适选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。二、靶序列或扩增产物的交叉污染这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。04、出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：1、将PCR反应的试管与反应板紧贴。2、当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。3、不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。4、对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。没有扩增产物：1、在提供MgCl 2 缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl 2 浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。2、泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl 2 ，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg 2+ 。3、检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。4、检查模板和引物的用量。5、增加循环次数和/或模板DNA的用量。泳道中出现模糊条带：1、减少循环次数或模板DNA的用量。2、提高退火温度，但不要超过68℃。3、重新设计引物或设计更长的引物。其他值得注意的条件：1、建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。2、最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。3、大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。4、优化Mg2+的浓度是必需的。5、基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。6、要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。7、降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。8、变性：第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。9、延伸：68--72℃下进行延伸操作。10、循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。11、长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。12、测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。引物设计：1、一般长度20-30bp；2、至少50%的GC含量；3、避免引物二聚体和二级结构；4、引物对的Tm值应该接近。

1、纯化的一般目标和方法首先，自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤(例如：匀浆、离心、硫酸铵沉淀等)成为稳定的可以用于色谱分离的样品。然后进行捕获色谱(capture chromatography)，主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质，此步最关心的是流速和载量，常采用高载量、快流速凝胶。经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱(intermediate chromatography)，目的是去除较难去除的杂质，此步最关心的是分辨率，常采用高分辨率的细颗粒凝胶。最后为了得到符合要求的最终产品，去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断，进行精制色谱(polishing chromatography)，常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。2、纯化前的准备工作(1)样品稳定性试验a、测定样品在pH 2-9的稳定性；b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性；c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性；d、测定样品在4-40℃的稳定性；e、室温下静置过夜，测定对蛋白水解酶的稳定性。(2)样品预处理a、去除样品中颗粒物(0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟)b、去除样品中脂类( 10000 g离心15分钟或有机溶剂抽提)c、去除样品中核酸(加入核酸酶消化或者使核酸沉淀)d、抑制样品中蛋白水解酶(加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第一步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白)(3)样品的保存条件：短期储存(小于24小时)a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀b、在密闭容器中冰箱冷藏较长期储存(数天)a、b、同上c、加入适当的抑菌剂长期储存a、同上b、冰冻或者最好冻干(真空冷冻干燥)保存。3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立a、目的蛋白含量测定酶活性测定、生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。b、总蛋白含量测定紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法(考马斯亮兰G-250)等。c、样品复杂度检测HPLC(离子交换、凝胶过滤、反相)、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳(CE)。4、蛋白质的来源(1)天然蛋白： 天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂，在分离过程中须采用多步骤才能去除各种杂质，并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。(2)重组蛋白： 重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要有三种表达定位：a、细胞质：在种情况下，必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质，同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放；在表达量较高的条件下，一般形成包涵体，包涵体含有过表达目的蛋白，且容易通过高速离心分离，但是包涵体的溶解与复性是较复杂的。b、外周质： 表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间，这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的作用并减少了宿主蛋白的污染。c、分泌到培养基：这种表达一般蛋白质浓度较低，主要受到培养基中的污染。

　　a 滴定管在装满滴定液后，管外壁的溶液要擦干，以免流下或溶液挥发而使管内溶液降温（在夏季影响尤大）。手持滴定管时，也要避免手心紧握装有溶液部分的管壁，以免手温高于室温（尤其在冬季）而使溶液的体积膨胀（特别是在非水溶液滴定时），造成读数误差。　　b 使用酸式滴定管时，应将滴定管固定在滴定管夹上，活塞柄向右，左手从中间向右伸出，拇指在管前，食指及中指在管后，三指平行地轻轻拿住活塞柄，无名指及小指向手心弯曲，食指及中指由下向上顶住活塞柄一端，拇指在上面配合动作。在转动时，中指及食指不要伸直，应该微微弯曲，轻轻向左扣住，这样既容易操作，又可防止把活塞顶出。　　c 每次滴定须从刻度零开始，以使每次测定结果能抵消滴定管的刻度误差。　　d 在装满滴定液后，滴定前“初读”零点，应静置1～2分钟再读一次，如液面读数无改变，仍为零，才能滴定。滴定时不应太快，每秒钟放出3～4滴为宜，更不应成液柱流下，尤其在接近计量点时，更应一滴一滴逐滴加入（在计量点前可适当加快些滴定）。滴定至终点后，须等1～2分钟，使附着在内壁的滴定液流下来以后再读数，如果放出滴定液速度相当慢时，等半分钟后读数亦可，“终读”也至少读两次。　　e 滴定管读数可垂直夹在滴定管架上或手持滴定管上端使自由地垂直读取刻度，读数时还应该注意眼睛的位置与液面处在同一水平面上，否则将会引起误差。　　读数应该在弯月面下缘最低点，但遇滴定液颜色太深，不能观察下缘时，可以读液面两侧最高点，“初读”与“终读”应用同一标准。　　f 为了协助读数，可在滴定管后面衬一“读数卡”（涂有一黑长方形的约4×1.5cm白纸）或用一张黑纸绕滴定管一圈，拉紧，置液面下刻度1分格（0.1ml）处使纸的上缘前后在一水平上；此时，由于反射完全消失，弯月面的液面呈黑色，明显的露出来，读此黑色弯月面下缘最低点。滴定液颜色深而需读两侧最高点时，就可用白纸为“读数卡”。若所用白背蓝线滴定管，其弯月面能使色条变形而成两个相遇一点的尖点，可直接读取尖头所在处的刻度。　　g 滴定管有无色、棕色两种，一般需避光的滴定液（如硝酸银滴定液、碘滴定液、高锰酸钾滴定液、亚硝酸钠滴定液、溴滴定液等），需用棕色滴定管。

ATCC是美国的一个微生物菌株保藏中心。每种已经定名的细菌都会有一个模式菌株,一般就是该种最早发现的那株菌株,称为标准菌株,用来作为和其他细菌之间比较的对照物。新种鉴定的时候作为参比的实验菌株就必须是标准菌株。细菌（学名：Bacteria）是指生物的主要类群之一，属于细菌域。也是所有生物中数量最多的一类，据估计，其总数约有5×10^30个。细菌的形状相当多样，主要有球状、杆状，以及螺旋状。细菌也对人类活动有很大的影响。一方面，细菌是许多疾病的病原体，可以通过各种方式，如接触、消化道、呼吸道、昆虫叮咬等在正常人体间传播疾病，具有较强的传染性，对社会危害极大。另一方面，人类也时常利用细菌，例如乳酪及酸奶和酒酿的制作、部分抗生素的制造、废水的处理等，都与细菌有关。在生物科技领域中，细菌也有着广泛的运用。细菌的个体非常小，目前已知最小的细菌只有0.2微米长，因此大多只能在显微镜下被看到。细菌一般是单细胞，细胞结构简单，缺乏细胞核、细胞骨架以及膜状胞器，例如线粒体和叶绿体。基于这些特征，细菌属于原核生物（Prokaryote）。原核生物中还有另一类生物称作古细菌（Archaea），是科学家依据演化关系而另辟的类别。为了区别，本类生物也被称为真细菌（Eubacteria）。远慕生物长期供应ATCC菌株保藏中心的菌株，货期快，操作流程简单，品种齐全。可以提供以下类别生物标准品:细胞株(3000多种);菌株(15000多种);动植物株(2500多种)以及重组物质等。详情与我们联系。

NK细胞和K细胞的不同点：1、数量不同K细胞占血液中淋巴细胞总数的5％～7％，NK细胞占血中淋巴细胞总数的2％～5％。2。免疫杀伤方式不同K细胞必须在抗体协助下才能具有免疫杀伤作用,NK细胞不需抗原激活,更不需抗体的协助,它可直接杀伤靶细胞。3、细胞体积不同K细胞体积略大,是中型淋巴细胞,其直径约为9～12μm。NK细胞是大淋巴细胞,平均直径为12～15μm,胞质较多,在胞质内有许多大小不等的嗜天青颗粒。4、免疫性质不同K细胞主要攻击比微生物大的靶细胞,可以是病毒感染的细胞,如慢性活动性肝炎中的肝细胞,由于这种细胞体积大,难以被吞噬，K细胞具有细胞外的杀伤作用,将它们清除,对肿瘤细胞也有明确的杀伤作用。NK细胞的这种抗感染和抗肿瘤的杀伤作用是广谱的，所NK细胞是非特异性的杀伤靶细胞的重要成分，是消灭癌变细胞的第一道防线。

　　冻干机适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母等的真空冷冻干燥保藏，但不适于霉菌的菌丝型、菇类、藻类和原虫等。生物菌种冻干保存步骤，其操作流程如下：　　1、安瓿管准备　　安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。　　2、保护剂的选择和准备　　保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。　　3、冻干样品的准备　　在适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后(参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》(试行))，与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜(以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支)。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。　　4、预冻　　一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。　　5、冷冻干燥　　采用冻干机进行冷冻干燥。将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。　　终止干燥时间应根据下列情况判断：　　安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；　　真空度接近空载时的最-高值；　　样品温度与管外温度接近；　　选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结；　　选用一个安瓿管，装1-2%氯-化钴，如变深兰色，可视为干燥完结；　　冷冻干燥完毕后，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。　　6、真空封口及真空检验　　将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。　　7、保藏　　安瓿管应低温避光保藏。　　8、质量检查　　冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。

质控菌株本质上是标准菌株的商业衍生产品，其应有可靠的溯源证明追溯至其使用的标准菌株来源，在微生物实验室仅可作为工作菌株进行使用，在使用前也应进行特性和纯度的确认。质控定量菌株使用起来非常方便，基本就是用无菌水复溶带菌小球，震荡后即可或在其允许的存放条件及时间内使用。自从2015版药典生效后，质控菌株这一标准菌株的商业衍生物慢慢热了起来，原来的微生物实验室，多数使用CMCC菌株，因此基本购买中检所的0代标准菌株制成1代标准贮备菌株然后再制成工作菌株进行使用，或购买地方所制备的2-3代商业衍生物作为工作菌株。其实在此之前已有不少外企使用质控菌株作为其微生物实验室菌株实验的基本耗材，但市场上的商品基本局限于ATCC、NCTC、NCPF等欧美国家菌种保藏中心的菌株，针对于CMCC菌株（中国医学细菌保藏管理中心）的质控菌株基本难寻踪迹。一、质控菌株的分类：一类满足低浓度接种量需求，含菌量一般为＜100cfu，为各类微生物培养基促生长实验，微生物实验阳性对照、无菌工艺模拟试验中培养基灵敏度检查，无菌或微生物限度检查实验方法学验证等的接种量需求。另一类为满足高浓度接种量需求，含菌量一般在105-106cfu，为对防腐剂、抑菌剂及消毒剂等抗微生物活性物质的效能测试或挑战实验，该类实验对微生物有下降几个对数降的统计需求，因此需要相对浓度较高的菌液。二、质控菌株的优势：1、精确的已知菌株cfu数量，减少实验失败率这点优势真的非常大，实验室建立一个各类菌株稳定的稀释至定量的方法至少需要3~6个月不等，培养人员可有效执行该方法每人基本需要3个月，检验所买来菌株的原始情况不一样，即使同一株菌，一样的复苏方法、培养条件、培养时间，同样的稀释方法但是不同人稀释出来的菌量还是不一样，每个微生物实验室肯定遇到过当天稀释加入供试品后发现第二天计数结果超限，或者当天计数第二天放在冰箱里取出的菌液里的菌株都死光了没有出现该有的阳性反应的情况，这些实验都是需要重做的，如果是原料检验或者是成品检验就比较难交代了，因此质控菌株的可稳定定量这个特性显得对实验室尤为有意义，这使得微生物实验的成功率大大提高。2、质控菌株的cfu数量稳定，缩小样本间差异这点在做微生物各类验证中非常有用，因为要做各类样本的对比，如果加入菌株的量差距越小，对于结果的评价就更为准确，比如供试品阳性实际加入量为10cfu，阳性对照实际加入量为90cfu，虽然都满足＜100cfu，但是对于最终微生物生长的判断就会带来一定问题，如果是无菌检查等仅看菌株长势的实验，可能就会有生长微弱和良好的不同判断，同样对于定量实验也可能会对实验回收率产生影响。但如果使用质控菌株即可更准确的进行结果判断，规避此类问题。3、极大减少实验准备时间，易使用降成本传统菌株实验需要经过菌株复苏、培养、稀释等过程，还需要准备培养基、耗材配合实验，如黑曲霉光复苏完培养就需要5-7天，再加做实验，最少也要从7天之前开始准备了，但是质控菌株实验只需要无菌水及人员有一定无菌操作能力加上使用移液枪的能力即可，对于铜绿、黑曲霉等实验控制难度较大的菌株也不需人员再费时练习，普通实验室人员即可胜任，从另一方面考虑其实也可降低人员成本。三、质控菌株的问题：1、溯源问题：因其为商业派生菌株，因此其所使用菌株的可追溯性和分析证书相当重要，生产过程一定要受控并满足标准物质生产商的标准，在使用前其特性及纯度一定要进行确认。2、菌量稳定问题：产品应能确保同一批次及不同批次间的菌量稳定；另外在产品复溶后，在其规定条件的保存时间内应尽量使得菌量稳定，应尽量减少标准误差。3、产品运输及贮存时温度问题：因为为活体菌株产品因此其温度，特别高温对产品可能有一定影响，因此在运输及贮存过程中应严格依据产品温度要求进行。其实以上问题在供应商审计阶段着重对质控菌株产品的溯源、菌量稳定技术及产品运输方式进行考察，找到质控稳定及资质优异的供应商即可解决。对于现代微生物实验室来说，质控菌株的使用是实验室发展的必经之道，使用质控菌株可极大减少实验及人员管控成本，且大大提高微生物实验的成功率，并使得微生物实验迈入定量化的理性时代，期待有更多更好的CMCC的质控菌株产品问世，为中国药企的微生物实验室带来便利和支持。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以zui大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。细胞冻存是细胞培养、引种、保种和保证实验顺利进行的重要技术手段。在细胞建株和建系中，及时冻存原始细胞是十分重要的。在杂交瘤单克隆抗体的制备过程中，杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞的冻存保种常常是*的实验操作。因为在没有建立一个稳定的细胞系或稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能因细胞的污染、分泌抗体能力的丧失或遗传变异等导致实验失败，如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而前功尽弃。1、常用冻存液组成成分20％血清（FBS）、10％DMSO、70％1640培养液；或90％血清（FBS）、10％DMSO，更可防止细胞内冰晶形成。将DMSO和FBS加入DMEM中，各自含量占总体积的10%，然后滤膜过滤后分装保存备用。2、DMSO在冻存液中的作用DMSO在4℃时对细胞无明显毒性，分子量小、溶解度大、易透过细胞膜，降低细胞外未结冰溶液中溶质浓度，使细胞免受高浓度溶质的损伤,细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩；DMSO与水分子结合，可使冰点下降，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶损伤。3、注意事项1.DMSO 不用高压灭菌；DMEM不能高温高压灭菌，可以过滤除菌。2.DMSO要用新的，而且要避光保存。3.DMSO：含10%FBS的DMEM=1:9(体积比)。