高质量数据新标准，Cytek谱写45色全光谱流式方案二重奏（分析+分选）

2020年Cytek发表的OMIP-069全光谱流式40色文章¹让超多色实验的梦想照进现实，4年之后，文章的同一作者再次分享了一个高质量的45色方案，全景式描绘了人外周血单个核细胞的免疫图谱，同时深入挖掘了记忆T细胞的免疫表型。该45色方案采用Cytek^®全光谱流式分析平台进行优化，随后无缝衔接到Cytek^®全光谱流式分选平台--方案不仅在分析平台上呈现出高质量的数据表现，在分选平台也以高度一致的数据分辨率实现结果的平移，并成功完成稀有细胞的分选且保持了细胞功能性。这一方案续写经典，再创突破，有望被普及应用于肿瘤免疫、自身免疫、药物研发、感染性疾病、神经退行性疾病等诸多领域。

在排除细胞黏连体和红细胞后，圈选活的CD45+细胞，基于FSC/SSC分成淋巴/DCs/NK和单核细胞群。单核细胞以CD14/CD16的表达区分出非经典、中间与经典亚群。淋巴/DCs/NK细胞圈走CD14+之后，CD3-TCRγδ-CD19+CD20+识别B细胞，借助IgD/CD27/CD20区分出Naïve、浆母细胞与IgD-记忆B细胞。CD14-CD3-CD19-CD20-CD56-HLA-DR+表征为DCs，并细化了CD123+ pDCs和CD11c+ DCs的功能性表达。CD14-CD3-CD19-CD20-HLA-DR-定义为NK细胞，根据CD56/CD16的表达丰度可分为早期、成熟与终端NK细胞。CD14-CD3-CD19-CD20-HLA-DR-CD56-CD16-圈出CD123+的嗜碱性粒细胞与CD123-的ILCs。CD3+TCRγδ-CD56+表征为NKT样细胞。CD3+CD56-中区分CD4+、CD8+、CD4-CD8-三群，CD4+ T细胞进一步细分为Naïve、TSCM、TCM、早期类TEM、早期TEM、中期TEM、晚期TEM、TEMRA各类亚群，并平行对比各自功能性指标的表达。

45色方案分析人PBMCs手动圈门策略

由于OMIP-069文章发表于2020年，在此之后，试剂厂家陆续研发出新型染料，为高维方案的优化和拓展带来了更丰富的选择。40色方案的部分荧光试剂存在货期问题，亦或是出现了数据表现更优的平替试剂。图中呈现的6种试剂，均与原方案的荧光素相似度较高，替换时无需对方案做出额外调整。其中cFluor^®系列试剂来源于Cytek公司，染色指数与原方案相当甚至更优。CD24 cFluor YG610优化了对于蓝激光激发的荧光素的spread，也改善了针对非B细胞的非特异性结合的问题（图1D）。CD57 cFluor B532替换FITC，染色指数显著提升，同时还可优化与BB515的spread（相似指数：BB515/FITC 0.98；BB515/cFluor B532 0.89）

荧光试剂数据性能对比

Cytek^® Aurora™分析系统和Aurora™ CS分选系统搭载专利的全光谱分析技术（Full Spectrum Profiling™, FSP™），实验方案可以在双平台间实现无缝衔接，高质量结果仅需“复制粘贴”，大大简化了分选实验的流程。文章使用5激光的Aurora™和Aurora™ CS平台，采用相同的增益条件、参考对照、数据采集与实验分析模版，同一样品在3台分析仪与1台分选仪上分别进行获取，从降维可视化结果来看，4台仪器呈现的结果高度重叠，这为实现多中心标准化打造了一体化的平台。

全光谱流式分析和分选平台无缝衔接

高维方案应用于Aurora™ CS分选平台，能够高精度地分辨细胞亚群，尤其是聚焦低比例细胞，并且一管样本可以实现6路同时分选，节省了时间和资源。从CD45+CD3+CD19-CD56-CD14-CD4+CD8-细胞群中，同时分选以下6群细胞：

随后，将分选收集到的细胞在37℃, 5% CO2培养箱中静置过夜，次日用PMA和离子霉素刺激，再用胞内标志物IFNγ、IL-2、TNF-α、IL-17进行染色，配色时选择分选的细胞上非共表达指标的荧光素。6种细胞呈现出截然不同的细胞因子表达趋势，阐明在免疫反应中各自可能扮演着不同的角色。

6路分选细胞并进行功能性验证