Cytek®Amnis®量化成像流式技术应用——细胞外囊泡篇

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为蛋白质、mRNA、miRNA、脂质等信息物质在细胞间转运的载体, 是细胞与细胞间通讯的重要媒介，参与大量正常生理和病理过程，包括感染性疾病、自身免疫性疾病、心血管和其他炎症性疾病、癌症和凝血障碍等，因此研究EV在人类健康和疾病中的作用具有重要意义。

• 外泌体 (30-150 nm) ，在胞体内区室中形成多囊泡小体，随后与质膜融合后从细胞中释放。

• 微囊泡或微粒 (100-1000 nm) ，这是质膜起泡/出芽以及随后从细胞中释放的结果。

• 凋亡小体 (1000-5000 nm) ，由凋亡细胞释放。

  
  

目前还没有特异性标记物可以最终鉴定不同类型的囊泡。因此，我们把这些小的生物颗粒统称为细胞外囊泡。

细胞外囊泡示意图

近年来，随着Amnis^®成像流式技术的发展，越来越多的研究利用这项技术解决了EVs检测这一难题。Amnis^®技术的核心是使用时间延迟积分CCD (TDI-CCD)进行信号检测。与光电倍增管(PMT)相比，CCD具有更大的动态范围、更低的“噪声”和更高的量子效率，使其更适合测量微弱信号。与传统流式细胞术相比，这种方法信号整合时间更长，噪音低，灵敏度大幅增加，对研究EVs具有独特的优势。

用常规流式技术 (A-B)和成像流式技术 (C-D)获得的200 nm大小的荧光标记脂质体和不同尺寸的聚苯乙烯珠(220、450、880和1300 nm)。Amnis®成像流式可以清晰地分辨出缓冲液背景信号(灰色)以上的所有脂质体(粉色)，而常规流式仅能通过荧光分辨出一小部分脂质体。

(a)从6名健康供体中获取无血小板血浆，并使用CD235(红细胞)、CD41(血小板)、CD45(白细胞)和CD146(内皮细胞)标记物进行染色以确定微粒细胞的来源。

(b)利用CD14(单核细胞)、CD66b(中性粒细胞)和CD3(淋巴细胞)标记物进一步对白细胞微粒进行表型分析，以确定其来源细胞。下方是图库中事件的代表性图片。

(c)表为N = 6例供体的绝对计数±SEM。

如图所示，Amnis^®成像流式技术可实现不同来源的外泌体的精准鉴定与计数。

(a)用Amnis^®成像流式技术分析PKH67标记的外泌体。BF和FITC荧光图像(E)所示。

(b) PKH67预标记外泌体与外周血单个核细胞共孵育。使用Amnis^®IDEAS^®软件内化功能测量外泌体的内化程度。

Amnis^®成像流式技术不仅实现了PKH67标记的外泌体鉴定，同时也实现了单个核细胞内化外泌体检测，且呈现直观图像佐证结果准确性。

以上研究均通过 Cytek^® Amnis^® ImageStream^®X Mk II 仪器完成。

通过将流式细胞术的表型分析能力、高速度和高灵敏度等优势，与荧光显微镜技术在细胞形态学细节的洞察力和针对细胞功能研究的深度有机结合在一起，Amnis^® ImageStream^®XMk II 平台可高速获取每个细胞的多个图像，包括明场、暗场 (SSC) 和多达 10 色荧光标记。ImageStream^®X Mk II 通过高分辨率成像，可以定位荧光蛋白表达位置（细胞膜、细胞质或者细胞核），实现超乎想象的广泛应用需求。