利用光谱流式技术，基于TRBC1评估T αβ大颗粒淋巴细胞白血病的T细胞克隆性

T-LGLL是一种罕见的慢性淋巴细胞增生性疾病（Chronic Lymphoproliferative Disorder, CLPD），其特征是血液或组织中的成熟细胞毒性T细胞，如大颗粒T淋巴细胞（T- Large Granular Lymphocytes, T-LGL）的克隆性增生。由于缺乏特异性基因标志物，其表现（绝对计数变化、形态、免疫表型特征等）又常常与反应性扩增相似，因此，在T-大颗粒淋巴细胞白血病（T-Large Granular Lymphocytic Leukemia, T-LGLL）的诊断检测中，证明扩增的 T-LGL 的克隆性仍然是一个挑战，特别是在没有淋巴细胞增多（lymphocytosis）的情况下。

利用流式细胞术（Flow cytometry, FCM）分析T细胞受体β链恒定区1（Constant region 1 of T-cell receptor β chain, TRBC1）的表达（后续用TRBC1-FCM表示），已被证明是评估Tαβ细胞克隆性的一种有效、简单、快速和特异的方法。然而，由于更为成熟的Tαβ细胞相较于总Tαβ细胞，往往显示出更为宽泛的TRBC1+/TRBC1 -比值，TRBC1-FCM方法对于诊断T-LGLL 克隆性的实用价值，还有待进一步证实。

研究者希望通过直接比较正常 Tαβ-LGL 与T-LGLL中 TRBC1+ 和 TRBC1-Tαβ 细胞的相对分布和绝对计数，验证TRBC1-FCM方法在诊断T-LGLL中特异性T细胞克隆的实用性。

研究纳入了54例样本（EDTA抗凝的全血），样本分别来自17例正常对照（HD），8例反应性 Tαβ 淋巴细胞增多症，5例HDc（有T-LGL克隆的HD），及24例Tαβ-LGLL 患者（18 名 TαβCD8-LGLL、5 名 TαβCD4-LGLL 和 1 名 Tαβ 双阴性 LGLL）。

利用Cytek^® Aurora全光谱流式细胞仪，研究者设计了两组免疫分型方案（Panel I 和Panel II）对样本进行检测分析，整个过程严格遵循EuroFlow SOP进行。

两组光谱流式免疫分型方案详细信息如下图1：

图1-基于光谱流式的免疫分型方案

利用Panel I，研究者比较了含有多克隆（n = 25）和单克隆（n = 29） LGL的血液中TRBC1+和TRBC1−的Tαβ-LGL的分布和绝对计数。

总体而言，多克隆性TRBC1+或TRBC1− 的Tαβ-LGL细胞数量（百分比）在0.36 ~ 571细胞/μL之间（3.2 ~ 91% TRBC1+细胞），而单克隆性LGL的细胞数量（百分比）在51 ~ 11,678细胞/μL之间（<0.9%或>96% TRBC1+细胞）。因此可以认为，通过总Tαβ细胞群体中TRBC1表达谱鉴定的病理性T-LGL的绝对计数不能作为检测Tαβ克隆性的通用（单一）标准，特别是在没有淋巴细胞增多和/或血液中携带相对较少（<2000 个细胞/μL）的TαβCD4-LGL或 TαβCD8-LGL 克隆的 T-LGLL 例中。相反，一旦将EM 和 TE Tαβ 细胞中的 TRBC1+ 细胞的百分比纳入考虑，所有携带单克隆细胞的T-LGLL和HDc例可以被明确识别，并可与仅有多克隆细胞的例区分开来。

图2-TRBC1+和TRBC1−细胞的绝对计数和相对分布

（多克隆vs.单克隆）

接下来，研究者将TRBC1-FCM方案结合TCRVβ库和异常表型检测（Panel II），以进一步验证 TRBC1-FCM 方法在临床环境中对 T-LGLL 中 T 细胞克隆性进行高灵敏度评估的实用性，并提高其检测（小）LGL 克隆的特异性。一共有12个例的样本被纳入此步研究（6 个 HD、2 个 TαβCD8-HDc 和 4 个 TαβCD8-LGLL）。结果发现，T-LGLL 和 HDc 例中克隆性 TRBC1+ 或 TRBC1-的 Tαβ 和 TαβCD8 细胞的绝对计数（32-5,515 个细胞/μL） ，显著高于来自正常/反应性例的多克隆 TRBC1+ 和 TRBC1- 的总 Tαβ（0-25 个细胞/μL）和 TαβCD8（0-21 个细胞/μL）细胞（图 3A&C）。但对TRBC1+ 细胞百分比的分析却并未观察到显著差异。提示，基于表达单个 TCRVβ 家族的细胞中 TRBC1 的表达模式识别 Tαβ-LGL 的克隆性，应该基于（表达单个TCRVβ 家族的克隆性 TRBC1+ 或 TRBC1- Tαβ 和 TαβCD8 细胞）绝对细胞计数和/或异常表型表达的综合评估。

图3- TCRVβ 家族中 TRBC1+ 细胞的绝对计数和相对分布

（多克隆vs.单克隆）

利用光谱流式技术，研究者验证了 TRBC1-FCM 方法的临床实用性，并进行了拓展。值得特别指出的是，得益于Cytek^®全光谱流式仪器的高参数和高灵敏的检测能力，研究者可以将多种免疫标记（TRBC1, TCRVβ 库，异常表型标记，成熟相关标记等）同时检测和分析，详细了解TRBC1 表达谱和不同 TCRVβ 家族在正常/反应性 CD28-EM 和 TE Tαβ 中的分布情况。

研究数据显示，在存在LGL 淋巴细胞增多症的患者血液中， T-LGLL的 TRBC1+ Tαβ 细胞百分比有显著改变（增加或减少）（大约 0 或 100%），因此研究者认为该方法可用于快速和简便地评估这类患者血液中的T 细胞克隆性。相反，在没有淋巴细胞增多（或者怀疑 TαβCD4-LGLL）的情况下，检测 T 细胞克隆性，需要在TRBC1-FCM 方法的基础上增加检测表达单个 TCRVβ 家族的 T-LGL 亚群的绝对细胞计数。由于样本数量有限，研究者也提出，如果需要进一步比较 TRBC1 -FCM方法与传统的 T 细胞克隆性检测方法，则需要进行更大的样本研究以验证本他们的发现。

#参考文献：

Muñoz-García, N.; Morán-Plata, F.J.; Villamor, N.; Lima, M.; Barrena, S.; Mateos, S.; Caldas, C.; van Dongen, J.J.M.; Orfao, A.; Almeida, J. High-Sensitive TRBC1-Based Flow Cytometric Assessment of T-Cell Clonality in Tαβ-Large Granular Lymphocytic Leukemia. Cancers 2022, 14, 408. https://doi.org/10.3390/cancers14020408.