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凝胶过滤层析 (GF),也称为尺寸排阻层析 (SEC),基本原理是根据样品分子大小和形状进行分离的一种常用的纯化方法,属于非吸附性层析。
图1: Cytiva全新一代Increase系列分子筛预装柱,专门为小规格制备纯化及分析而设计
根据应用目的的不同,凝胶过滤层析主要可以分为以下三种方法:
分析型凝胶过滤层析:对于分辨率有很高的要求,上样体积一般在柱体积的0.3% - 0.5%;使用柱子的高度一般为30cm。而在快速纯度检测和筛选的实验中,常用的是15cm柱高的柱子,可以在提供足够分辨率的前提下,缩短运行时间,节省样品和缓冲液。
制备级凝胶过滤层析:对于分辨率有较高的要求,上样体积一般在柱体积的0.5% - 4%。同时,运行时流速较低,使用的柱子高度也比较高 (一般≥ 60cm)。经过纯化后的样品将被直接置换到合适的缓冲液条件中,用于后续的实验或储存。
脱盐与缓冲液置换:与上述精细分离不同,脱盐或缓冲液置换属于组分分离,即,将大分子样品与小分子或离子进行分离的过程,因此对于分辨率的要求相对不高。上样体积可达柱体积的30%。
Sephadex
Sephadex填料是早期发现的一种填料,按照交联度的不同,用Sephadex G加数字来区别,数字越小交联度越大,形成的孔径越小,对应的分离范围越小。
Sephadex G系列填料目前一般主要用于脱盐与缓冲液置换,且有多种分离范围、颗粒大小可以选择。粗颗粒 (Coarse)流速较快,细颗粒 (Fine)流速较慢,分辨率较高。
图2.不同上样量对于脱盐实验结果的影响
Sepharose
Sepharose填料是高流速大分子分离。作为琼脂糖基质的填料,具有非特异性吸附低、回收率高等特点,分离范围宽阔,从10kD – 2×104kD,适合分子量大小差异大而对分辨率要求不高的样本。
Sepharose和2,3二溴丙醇反应而成的Sepharose CL系列填料,增强了Sepharose的物理和化学稳定性。特别适合含有机溶剂的分离,能承受较强的在位清洗,并可以高温消毒,同时在流速方面也比传统的Sepharose填料有了明显的提升。
Sepharose Fast Flow填料为粒径90μm的高度交联的琼脂糖填料,大大加强了机械性能,流速特快,适合工业规模生产。该填料经去电荷处理,非特异性吸附特低,回收率也得到了了提高。极高的化学稳定性,可用多种促溶剂、有机溶剂工作及1-2M NaOH进行在位清洗。
Sephacryl
Sephacryl填料是葡聚糖与N,N-亚甲基二乙酰胺交联而成的一种新型葡聚糖填料。目前Cytiva提供5种不同分离范围的Sephacryl填料:Sephacryl S-100 HR、Sephacryl S-200 HR、Sephacryl S-300 HR、Sephacryl S-400 HR、Sephacryl S-500 HR,选择性广阔。排阻极限甚至可以达到108,不仅可以用于分离一般的蛋白,也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。
同时经济型HiPrep 16/60、26/60 Sephacryl S-100,200,300,400,500HR预装柱提高了分辨率和重复性,具有较好的分离特性。
Superose
Superose填料是分离范围广的填料,同时宽广的分离范围配合高分辨率,能一次性分离生物分子大小差异大的混合物。刚性相比传统填料有了极大的提升,在高粘性液体如8M尿素下也能保持流速,适合糖类、核酸、病毒,特别是包涵体蛋白在促溶剂中的纯化。
Superose填料的颗粒细小,大小分布集中,允许高流速纯化,所以适合中、高压层析系统使用。
图3.用于精细分离的凝胶过滤层析产品的分离范围
Superdex
Superdex由葡聚糖和琼脂糖的复合基质高度交联形成,是目前Cytiva产品中分辨率、选择性最高的凝胶过滤层析填料。该填料流速快且反压低,同时较低的非特异性吸附提高了回收率的表现能力。
Superdex可以在高粘性洗脱液 (如8M尿素)在相对较高的流速下运行。在常用的水性缓冲液和添加剂 (如去污剂、变性剂)中化学稳定,并可以耐受1M的NaOH清洗。
Increase平台系列预装柱:进一步缩小了填料粒径,提高了填料的耐压性能,提升了分辨率的同时有效缩短了分离纯化所需的时间。
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相同流速下更高分辨率:提高蛋白的纯度与分析数据的精度
图4. 与Superdex Peptide相比较,新一代Superdex 30 Increase在相同流速下提高了50%分辨率
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相同分辨率下更高流速:节省实验时间,同等分辨率下时间更短,或通量更高
图5. 与Superdex Peptide相比较,新一代Superdex 30 Increase在相同的分辨率下,只需要1/3的实验时间。
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批次差异更小,获得更好的可重复性
图6. 在Superdex 30 Increase预装柱上重复注射由蛋白质和肽组成的样品混合物,并显示了运行1、50、150、250和350的结果。 蛋白质和肽的峰标记为1-5。
Cytiva针对不同的实验目的,提供了3种不同规格的预装柱:
适应于不同的上样量以及应用目的,Cytiva SEC Increase预装柱提供了丰富的选择与卓越的性能,为每一次蛋白纯化,样品分离都保证了不凡的表现。
[来源:北京德泉兴业商贸有限公司]
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