随着全光谱流式的成功商业化以及染料技术的更新与发展,多色流式细胞术在近年来取得长足进展。众多复杂(超过20色)免疫表型分析方案已在流式方法学、新冠感染免疫、肿瘤微环境等领域研究工作中得到充分的设计与验证,并在血液病检测、免疫监控、细胞治疗等方面展现出独特优势。
为了进一步提升多色流式细胞术的检测通量,罗氏公司研发团队开发了基于Cytek®️全光谱流式的荧光编码混样技术,报道了一管样本中同时检测20个21色PBMC样本的研究进展,除效率提升外,该技术能够在批量分析中大幅降低试剂用量,有效避免人为因素引起的实验误差,并可用于混样多路分选。相关研究工作与2022年发表于Cytometry Part A。
图1. CD45多色编码混样技术示意图
该方法通过对CD45的多色标记实现多个样本的荧光编码,例如“5选2”的编码方案中(图2上),从5种标记不同染料的CD45单抗库中选取2种进行标记样本,最多可产生10种编码组合。数据分析时,仅通过简单的散点图圈门即可快速解码(图2下)。经实验对比,研究人员验证了“5选2”编码混样方案检测与常规单管检测结果具有较强的可比性,并证实了Anti-CD45编码混样方案不会为实验引入明显的批次效应(实验数据请参考文献原文)。
图2. 5选2型编码模式(多至10样本混样)
及解码圈门策略
方案可靠性验证后,研究人员进一步将编码方案扩展为“6选3”模式,并开发了可用于免疫调节剂作用模式研究的21色表型分析方案,以区分T、B、M、NK细胞丰度以及不同发育阶段T细胞亚群的活化状态,该方案使用20混1的高容量混样模式评估PBMC在葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激下的免疫应答。Anti-CD45编码方式与多色方案如图3所示。
图3. SEB刺激实验21色方案及编码混样模式
解码后的流式检测数据经FlowSOM聚类区分为17个类群,并通过optSNE降维展示。结果显示,SEB刺激下,样本中各免疫细胞亚群丰度发生显著变化:活化T细胞比例大幅上升;CD4+与CD8+效应记忆T细胞(Tem)、CD4+中央记忆T细胞(Tcm)丰度发生不同程度的下降;CD14hi单核细胞几乎消失。此外,在SEB刺激样本中,研究人员通过CD279、CD134、CD137即CD154的表达区分出两种特有的活化CD4+T细胞亚群,而在对照组中并不存在。相关结果符合实验预期,进一步验证了编码混样方案的可靠性。
图4. SEB刺激试验结果展示
总 结
基于Anti-CD45的编码混样技术因向实验体系引入更多染料,无疑提升了多色方案的复杂性。得益于Cytek®️全光谱流式强大的多色分析性能,荧光溢漏带来的扩散误差(SE)被有效控制,即便在21色20混1的复杂混样方案中依然得到可靠的数据表现。该编码技术在高容量混样的同时可维持细胞活性,为后续的混样流式分选创造了可能。
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参考文献:
Junker F, Camillo Teixeira P. Barcoding of live PBMCs to assess immune cell phenotypes using full spectrum flow cytometry[J]. Cytometry Part A, 2022.
关于Cytek
About Cytek /
Cytek® Biosciences, Inc.(Nasdaq: CTKB)作为一家全球技术领先的生命科学技术公司,通过其受专利保护的全光谱分析(Full Spectrum Profiling,FSP™)技术,提供高分辨率、高参数和高灵敏度的新一代细胞分析工具。Cytek的创新技术通过检测荧光信号的完整光谱信息,以实现更高水平更高灵敏度的多参数检测。Cytek的FSP™平台包括其核心仪器—Aurora和Northern Lights™分析系统、Aurora CS分选系统、试剂、软件和服务,为客户提供全面和完整的解决方案。Cytek总部位于美国加利福尼亚州Fremont,在全球设有分部和分销渠道。
更多的相关信息,请登录Cytek的官方网站:www.cytekbio.com和www.cytekbio.com.cn。
注:Cytek®, Tonbo Biosciences, cFluor®, Full Spectrum Profiling™, FSP™和Northern Lights™是Cytek Biosciences, Inc. 的商标或注册商标。Cytek®全光谱检测技术相关专利包括但不限于:US10739245B2,US11169076B2,US10788411B2。
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[来源:Cytek Biosciences]
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