基于Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统检测低拷贝端粒基因

我们都知道在实时定量PCR（qPCR）中，可以通过Cq值和标准曲线得出样本的初始拷贝数。但Cq值与样品中靶标的拷贝数有关，也会受到PCR反应的效率和仪器检测灵敏度的影响。高灵敏度的仪器可以减少检测样品所需的循环数，节省时间并提高效率；同时也可以减少假阴性的存在。Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的设计初衷，就是为了高灵敏高性能而生，每个孔配有单独的激发和发射光纤，可有效提高灵敏度并降低背景噪声干扰（图1左）。此外跟同类产品相比，Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统使用全孔检测技术，每个孔可采集约100,000个数据点，使每个qPCR扩增曲线能够准确、可重复和灵敏地表示荧光强度，从而提高荧光数据的可靠性（图1右）。

▲ 图1. 高性能光路系统

为了进一步表明Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的灵敏度，与同类产品进行了以下比较实验：使用酵母的三个RNA靶标进行检测，分别是高丰度的Actin基因、低丰度的6Y’端粒基因，以及单拷贝的TEL06R端粒基因。

材料和方法

从10mL酵母培养液中制备出RNA，将3µg RNA逆转录成cDNA作为模板备用。对于Actin，在Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统上使用的cDNA按1：20稀释；其他的cDNA均按1：10进行稀释。引物如下：

▲ 表1. Actin、6Y’端粒基因和TEL06R端粒基因的引物对

采用4个4倍系列稀释的cDNA模板和一个无模板对照来计算qPCR扩增效率，反应体系和扩增程序如下：

结果和讨论

在高丰度Actin和低丰度6Y’端粒基因的检测中，Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统和同类产品的扩增效率非常相似（表2）。然而，在单拷贝TEL06R端粒基因的检测中，发现同类产品得到的Cq值偏大，位于35-38之间，导致计算出的扩增效率大于200%，不能作为参考数据；Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统则计算得出E=96%（表2）。

▲ 表2. 各基因的扩增效率及R2值

同时结果表明，尽管Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的Actin cDNA上样量仅为同类产品的一半，但Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的Cq值小于同类产品的Cq值，两者相差0.65（表3）。针对低丰度的6Y’端粒基因和单拷贝的TEL06R端粒基因，两者的Cq值差异较大，差值分别是2.25和4.02（表3）。这些结果表明，随着基因起始拷贝数的减少，Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统灵敏度的提高变得尤为重要。

▲ 表3. 各基因的数据对比

灵敏度也会直接影响数据的准确度和再现性。随着PCR循环数的增加，非特异性产物或引物二聚体扩增的可能性也增加。尤其是使用非特异性荧光染料（如SYBR green）检测PCR产物时，更需要避免过多的循环数。因此，在早期循环中检测扩增的能力大大提高了数据的可靠性。

具有单孔检测的Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统设计用于最小化背景噪声和最大化灵敏度，以实现qPCR反应中最高的特异性和精确度。快快申请试用，让它帮助你优化qPCR实验吧。