一文揽尽：荧光定量PCR扩增曲线哪个阶段最重要

qPCR扩增曲线一般分成四个阶段：基线期、指数期、线性期和平台期。那么每个阶段PCR产物量的变化都有什么区别呢？哪个阶段最重要呢？小编这就一一道来。

基线期

PCR起始时，刚开始前几个循环的荧光信号还没有发生变化，接近一条直线，将其称之为基线，一般是3-15个循环。在基线期内，扩增的荧光信号被背景荧光信号所掩盖，无法判断PCR产物量的变化。

指数期

扩增的荧光信号高于背景荧光信号，扩增曲线起峰，开始进入指数期。在指数期内，每个循环积聚的产物准确加倍（假定100%反应效率）。该阶段的PCR反应具有高度特异性和精确度。因为所有试剂均充足，反应的动力学推动反应有利于扩增子加倍，所以产物出现指数级扩增。只有在这个阶段，Cq值与初始模板量的对数之间存在线性关系，所以在此阶段进行定量分析最合适。

线性期（高变异性）

随着PCR反应体系各成分的消耗，其中的一种或者多种成分限制反应，导致反应开始减缓，并且每个循环的PCR产物不再加倍，该阶段不再是指数级扩增。

平台期

反应停止，不再产生更多产物，并且如果放置时间够长，PCR产物将开始降解。因为每个样品具有不同的反应动力学，所以每支试管或每个反应将在不同的时间点进入平台期，最终的产物含量也各不相同。

由于线性期和平台期的扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的产物量与初始模板量之间没有线性关系，所以也不能通过这两个阶段的PCR产物量计算出初始模板量。想要知道初始模板量的多少，还要依赖指数期的Cq值进行计算。

▲ 图1. qPCR 反应的重要阶段

如图所示，标准的扩增曲线是呈现S型的。曲线是否符合标准，不仅跟样本起始量、qPCR体系配制、反应程序等相关，更依赖于一套高品质的实时荧光定量PCR系统。对于实时荧光定量PCR系统来说，高度检测灵敏度、高度重复性和高度稳定性，是每一台qPCR仪的追求。

高性能的Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统完全符合以上要求，该系统来自美国Azure Biosystems公司，融合了高品质的帕尔特温度模块和基于光纤传输的光学检测系统，为您的科学研究提供高精准、高灵敏可靠结果。提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根据实验需求灵活配置。

同时配有10.3”触控系统，主机本身可独立运行、连接、远程交互，让您随时随地知悉实验进程和及时获得实验结果。

▲ 图2. Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统

高度的灵敏度

使用探针法，同时在Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统和其他品牌产品上检测GAPDH基因，结果表明：A）Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统对单拷贝基因的检出率更高。B）Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的Cq平均值要低于2个Cq。

▲ 图3. 单拷贝基因检测对比(n=96)

高度的重复性

源于优异的孔间均一性。105拷贝数GAPDH模板，GAPDH引物扩增，96孔重复结果。Cq平均值=19.1，变异系数（Cv）=0.002。

▲ 图4. 96孔重复扩增曲线   A）线性图  B）对数图

       高度的稳定性

稳定可靠的温度模块和光学系统，确保仪器连续运行1000轮qPCR实验，数据依然稳定可靠，重复性高度一致。对GAPDH进行检测并连续计算Cq值得出平均值和Cq值的标准偏差。Cq值=22.4+0.01。

▲ 图5. 长时间连续工作数据稳定