质粒抽提的基本原理及操作流程

质粒抽提的基本原理及操作流程

⒈质粒抽提基本原理

在其中采用几种水溶液及其硅酸化学纤维膜（超滤膜柱）。 水溶液Ⅰ：50 mM果糖 / 25 mMTris-HCl/ 10 mMEDTA，pH 8.0；水溶液Ⅱ：0.2 N NaOH / 1%SDS； 水溶液Ⅲ：3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸/75%乙醇。

水溶液Ⅰ

果糖是使飘浮后的大肠埃希菌不容易迅速堆积到水管的底端；EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属材料正离子的螯合剂，其关键目地是以便鳌合二价金属材料正离子进而达到抑制DNase的特异性；可加上RNase A消化吸收RNA。

水溶液Ⅱ

此步为碱解决。在其中NaOH关键是以便融解体细胞，释放出来DNA，由于在强偏碱的状况下，细胞质产生了从两层膜结构工程向微囊构造的转变。SDS与NaOH联用，其目地是以便提高NaOH的强偏碱，一起SDS做为阳离子表活剂毁坏脂两层膜。那步要记牢二点：首位，时间不可以太长，由于在那样的偏碱标准下基因组DNA-p段也会渐渐地破裂；其次，务必温柔混和，要不然基因组DNA会破裂。

水溶液Ⅲ

水溶液III的功效是沉定蛋白质和中和反应。在其中醋酸钾是以便使钾离子换置SDS中的钾离子而产生了PDS，由于十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）碰到钾离子后变为了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS不是溶水的，一起1个SDS分子结构均值融合2个碳水化合物，钾钠正离子换置所造成的很多沉定大自然就将绝大多数蛋白沉定了。2 M的醋酸是以便中合NaOH。基因组DNA如果产生破裂，要是是50－100 kb尺寸的片段，就没有方法再被 PDS共沉淀了，因此碱解决的时间要短，并且不可猛烈震荡，要不然蕞终获得的质粒上都会有很多的基因组DNA渗入，琼脂糖电泳能够 观查到这条浓浓总DNA条带。75%乙醇关键是以便清理盐分和抑止Dnase；一起水溶液III的强酸碱性都是以便使DNA尽快融合在硅酸化学纤维膜上

⒉质粒抽提流程

⑴应用质粒提取试剂盒获取质粒时请参照实际试剂盒的操作指南。如Omega企业的E.Z.N.A.? Plasmid Mini Kit I, Q(capless) Spin （质粒提取盒）。

⑵碱裂解手提式法：此方式适用少量质粒DNA的获取，获取的质粒DNA可立即用以酶切、PCR测序、银染编码序列分析。方式给出：

①接1%含质粒的大肠埃希菌体细胞于2mlLB培养液。

②37℃震荡塑造留宿。

③取1.5ml菌体于Ep管(离心管)，以4000rpm抽滤3min，弃上清液。

④加0.lml水溶液I（1%果糖，50mM/LEDTApH8.0，25mM/LTris-HClpH8.0）充足混和。

⑤添加0.2ml水溶液II（0.2mM/LNaOH，1%SDS），轻轻地旋转搅拌，放置冰浴5min.

⑥添加0.15m1预冷水溶液III（5mol/LKAc，pH4.8），轻轻地旋转搅拌，放置冰浴5min.

⑦以10，000rpm抽滤20min，取上清液于另翻新Ep管。

⑧添加等容积的异戊醇，搅拌后静放10min.

⑨以10，000rpm抽滤20min，弃上清。

⑩用70%酒精0.5ml清洗一回，吸干全部液体。

待沉定干躁后，溶解50ulTE缓冲液中（或60℃温育双蒸水）。