中科院崔丽研究员最新进展：耐药基因的水平基因转移研究进展，单细胞分析显身手

10月28日，中科院城市环境研究所崔丽研究员团队在期刊《Analytical Chemistry》上发表耐药基因水平基因转移最新研究。文章标题为“Phenotypic Tracking of Antibiotic Resistance Spread via Transformation from Environment to Clinic by Reverse D2O Single-Cell Raman Probing”。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.0c03218?ref=pdf

【研究背景】

微生物耐药是一个危害公共卫生安全的全球性问题。耐药基因（antibiotic resistance gene，ARG）在环境或临床中出现并传播扩散。在这一过程中，水平基因转移（Horizontal gene transfer，HGT）现象起着不可忽视的作用。HGT的一个主要途径是转化（transformation）——受体细菌摄取胞外DNA（extracelluar DNA，eDNA）。这些eDNA多是细菌主动分泌或者裂解过程中释放的质粒DNA以及片段化DNA，常常携带着ARG。环境充当着ARG储库的角色，威胁着临床治疗。因此了解ARG从环境到临床转移的过程是必要的。

在上述问题的研究中，常规方法依赖耐药菌的选择性培养或是报告基因标记eDNA技术。前者需要已知被筛选微生物的培养条件，且无法筛选出耐药但扩增不活跃的微生物。后者需要对eDNA等进行改造，不能反应实际的HGT情况。

近年新兴了一种联合正向D2O标记的单细胞拉曼光谱方法用于微生物抗性区分。微生物利用环境中的D2O合成相关的生物分子，可以通过拉曼光谱的C-D带（2040-2300 cm^-1）进行表征。抗性环境中敏感菌与耐药菌会表现出不同D2O摄入，进而表现出不同的C-D峰情况。然而微生物不仅摄入D2O，还会摄入其他含H元素的营养物质，这导致单位时间C-D谱带的增长较低。同时较短时间的孵育也降低了该方法的灵敏度。作者团队改进并提出了反向D2O-单细胞-拉曼检测技术（reverse D2O single-cell Raman (Raman-rD2O) probing，Raman-rD2O）。微生物预先在D2O中孵育，后置换为含抗生素的H2O环境孵育并被检测。作者确定了该方法的有效性并利用该方法研究了HGT过程.。

【实验设计】

这项研究中，为了评价微生物耐药性，作者建立了Raman-rD2O方法，确定了其有效性，以及灵敏度。之后在大肠杆菌体系中确认了水平基因转移的情况。接着评价了与来自于复杂环境中质粒共孵育的大肠杆菌对各抗生素（meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin）的耐药情况，并确认了该方法比传统培养方法更加准确。最后提出了一种用于反映ARGs传播风险的计算方法。

【结果讨论】

Raman-rD2O方法区分耐药菌以及敏感菌的灵敏度

对colistin耐药的FIT10（B. cereus）以及colistin敏感的DH5α（E. coli）菌株进行D2O培养12h。转移至含抗生素colistin的无D2O环境进行培养，取不同时间点进行拉曼图谱采集，结果如图 1。在C-D峰处可以看出，耐药菌FIT10峰强逐渐变低，非耐药菌DH5α无明显变化。

图1

图 1. 预先标记同位素D微生物在含0.125 mg/L colistin的LB培养基中培养0、0.5、1、4、8小时后的单细胞拉曼光谱（a）耐药菌FIT10，（b）敏感菌DH5α。

采集含colistin培养条件下FIT10以及DH5α的单细胞拉曼图谱并统计C-D比值（CD/(CD + CH)），结果如图 2a-Ⅰ。另外比较了含ampicillin条件下的DH5α-Ampr以及DH5α数据，如图 2a-Ⅲ。可以看出该方法能够区分耐药菌以及敏感菌，且适用不同抗生素。

从图 2a-Ⅱ/Ⅲ以及2b数据，可以看出正向标记方法4h后才能观察到差异。因此反向标记方法是优于正向标记的。

图2 

图 2. (a-Ⅰ，a-Ⅲ) 反向D2O方法下，不同时间点的colistin耐药FIT10、ampicilin耐药DH5α-Ampr以及DH5α的C-D比值统计结果；(a-Ⅲ，a-Ⅳ) 正向D2O方法下结果；(b) 1×MIC抗生素浓度下培养1h，反向D2O、正向D2O的单细胞拉曼图谱C-D区域结果。

利用Raman-rD2O方法揭示转化过程中ARGs的水平基因转移

作者比较了实验组JM109（E . coli）以及对照组DH5α、DH5α-Ampr 菌C-D比值。JM109预先与携带bla基因（编码抗ampicilin蛋白）的pMD19-T质粒共孵育。从图 3可以看出，DH5α组维持高的C-D比值，DH5α-Ampr 组比值降至6.4%以下。而JM109组分为了高比值群体以及低比值群体。这意味着JM109组中部分微生物获得了bla基因并表达，从而能在含ampicilin环境中进行代谢生长。

HOOKE单细胞分选仪助力耐药基因水平基因转移研究

为了验证这一假设，作者利用长光辰英科仪（HOOKE instruments）的单细胞分选仪（PRECI SCS），对各样品进行了单个细胞分选。对分选的单个微生物进行全基因组扩增后，通过PCR验证bla基因的携带情况。从图 3b可看出，DH5α组无bla基因，DH5α-Ampr 组携带bla基因，部分JM109组携带bla基因。这一结果印证了bla基因转移的假设。

长光辰英科仪（HOOKE instruments）单细胞分选仪HOOKE PRECI SCS

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作者统计了不同采集个数下耐药菌个数并计算了转化频率（Transformation Frequency = 转化菌个数/（10×拉曼采集总数），10为微生物1h时扩增倍数）。采集数目大于40时，转化频率趋近4.33 × 10^-2。该结果与传统平板培养方法得到的5.07 × 10^-2一致。

图3

图 3. （a）预标记同位素D的E. coli DH5α（敏感对照），E. coli DH5α-Ampr（抵抗对照）以及转化了含bla基因质粒的接受菌E. coli ，经过含ampicillin的LB培养基孵育1h，采集拉曼光谱并统计C-D比率。每个点对应一个拉曼结果。阈值6.4%为未经过D标记的抗性转化子的C-D比值的平均值+3倍标准偏差；（b）PCR产物（针对质粒上bla基因）的电泳结果，1-3道为高C-D比值的敏感接受菌，4-6为小于10% C-D比值的耐药接受菌，7为不含质粒的E. coli DH5α，8为含bla基因的E. coli DH5α-Ampr；（c）质粒（携带bla基因）的转化频率（线）以及转化频率的标准偏差（柱）。利用单细胞Raman-rD2O方法对不同拉曼图谱采集个数下结果进行了统计。

通过单细胞Raman-rD2O评价复杂环境中质粒介导的eARGs转化现象

作者提取了土壤中的质粒并与E. coli共孵育。通过单细胞Raman-D2O，分析了不同抗生素下（meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin）的拉曼C-D比值。从图 4a可以看出，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin组出现了水平基因转移现象。考虑到土壤等环境中质粒对受体微生物增殖能力的影响，不同质粒编码导致同一抗性等问题，作者引入了传播效率（Spread Efficiency = 转化菌个数/拉曼采集总数）来评估传播风险。就图 4b结果来说，传播效率ampicillin（1.5 × 10^-1） > cefradine（8.6 × 10^-2）和ciprofloxacin（6.7 × 10^-2） >meropene（0）m和 vancomycin（0）。

作者同时计算了Raman rD2O方法的转化效率，ampicillin (1.9 × 10^-3)> ciprofloxacin (5.9 × 10^-4) and cefradine (8.8 × 10^-4) >meropenem and vancomycin (0) 。而传统平皿培养方法下的转化效率数值小于上述80-100倍。传统方法低估了HGT的程度，一方面存在携带抗性基因但在极端环境下不可培养鉴定的微生物（viable but nonculturable，VBNC），另一方面存在接受质粒导致扩增速率大幅降低（1000倍）的微生物。而在传统方法中过夜培养后，这种差异变得更加的明显。

图4

图 4. （a） E. coli DH5α（敏感对照）C-D比值，以及接受菌E. coli 的C-D比值。接受菌经同位素D预标记后，与从土壤提取质粒进行共孵育。后分别在meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin条件下孵育1h。每一个点对应一个单细胞拉曼图谱。C-D比值小于6.4%的为不带D标记的耐受转化子；（b）携带抗meropenem，vancomycin，ampicillin，cefradine以及ciprofloxacin基因的质粒的传播效率。星号表示比较具有统计学意义（单因素方差分析ANOVA，P< 0.001）。

【结论】

利用单细胞拉曼反向D2O检测方法能够可靠且快速的从表型上追踪耐药从环境到临床的扩散。方法具有很高的灵敏度，能够在大量受体菌种识别出那些少量的抗性转化子。单细胞水平的检测避免了繁琐的培养过程，可以直接计算传播效率，能够表征临床相关抗生素的不同风险。该方法后续未来可用于破解影响抗性质粒转移以及持续的因素。通过与基因型研究的联系，能更好的理解环境质体（environmental plastidome）传播风险。也是一种研究HGT机制的新手段。

关于作者

崔丽 (Li Cui)，研究员，博士生导师，国家优秀青年科学基金获得者，中科院青年创新促进会会员。2002年获厦门大学化学系学士学位，2008年获厦门大学理学（物理化学专业）博士学位。2008.9-至今在中科院城市环境研究所工作，2010. 10评为副研究员，2019.01评为研究员。英国牛津大学（2015.8-2016.2），兰卡斯特大学（2015.2-2015.7）和瑞士伯尔尼大学访问学者（2009.11-2010.2）。至今已在化学和环境国际主流刊物J. Am. Chem. Soc., Anal. Chem.（7篇）, Environ. Sci. Technol., Water Res，J Mem Sci, Soil Biol. Biochem，J Phys Chem等发表论文45篇。先后承担国家自然科学基金项目5项，科技部项目1项，省市基金3项。研究领域：环境分析化学（微生物为主），尤其是利用单细胞拉曼/表面增强拉曼光谱，并与稳定同位素标记技术联用，开展环境微生物的研究，如抗生素抗性、氮磷微生物利用过程、生物膜、纳米毒性等。

关于长光辰英

长春长光辰英生物科学仪器有限公司（长光辰英科仪，Hooke Instruments）成立于 2017年，坐落于风景秀美的塞外春城长春，由海外归国团队、长春奥普光电技术股份有限公司（上市公司）、上海合森生物科技有限公司和自然人等股东投资设立的高技术企业，注册资金 3350 万人民币，拥有自主知识产权，主要开展光学、生物学、医学等领域科学仪器的研发、生产、销售及技术服务等工作。

辰英科仪自主研制的单细胞分选仪PRECI SCS具有独特的可视化分选功能，所见即所得，精准实现目标细胞的逐一分离。采用独特的激光与物质相互作用原理，对于复杂生物样本中形态各异的细胞，可实现非标记状态下的精准分离。对于百纳米级的单个微生物细胞也同样适用。

图5. 单细胞分选仪HOOKE PRECI SCS

图6. 拉曼单细胞分选仪HOOKE PRECI SCS-R300

PRECI SCS具有可视化、精准、广泛适用等特点。分选过程不依赖标记，可与形态、拉曼、荧光等多种识别方式结合，多种机型可选，满足不同应用需求。搭载潜心研制的HOOKE IntP智能软件，实现单细胞图像智能识别、一键自动分选、全自动细胞获取等。设备操作流程简易，为单细胞测序、未培养微生物开发、工程细胞筛选、细胞图谱绘制等研究提供完美解决方案，助力前沿科学研究。（文源：长光辰英）