广东省微生物研究所：铁还原菌研究新突破——可视化单细胞分选技术大显身手

2020年11月，广东省微生物研究所许玫英与杨永刚研究员团队在期刊《Appl Environ Microbiol》上发表文章“Visualizing and isolating iron-reducing microorganisms at single cell level”，论文第一作者为助理研究员甘翠芬。该论文在线后被环境微生物学领域著名专家DR Lovley教授评为“One of the most exciting papers in microbial iron reduction of 2020 ”

原文链接：

https://aem.asm.org/content/early/2020/11/02/AEM.02192-20.long

一、研究背景

在自然环境中，铁还原是细菌胞外电子传递的主要形式之一。铁还原菌（FeRM）不仅在矿物和腐殖质的还原中起关键作用，而且还参与硫化合物和有机物的氧化。此外，FeRM在废水处理、生物修复和生物电化学系统等许多工程过程中至关重要。铁还原菌在系统发育上普遍存在，目前还没有合适的16S rRNA或基于功能基因的检测方法对其进行检测。本文章作者合成了一种对Fe²⁺具有高灵敏度和选择性的耗氧Fe²⁺特异性荧光化学探针（FSFC）。该FSFC可以从纯培养、不同细菌共培养或含沉积物样品中选择性地鉴定和定位活性FeRM。FSFC的荧光强度可以作为细菌培养物中Fe²⁺浓度的指标。与单细胞分选技术相结合，该探针可以帮助从丰富的沉积物群落中识别和分离FeRM。

二、实验设计

首先作者设计合成了一种对Fe²⁺具有高灵敏性和选择性的特异性荧光探针（FSFC），FSFC能够定位和鉴定具有活性的FeRM，其荧光强度能够作为细菌培养物中Fe²⁺浓度指示。将FSFC荧光探针与单细胞分选技术结合，实现可视化识别和分选铁还原菌。

三、结果与讨论

1. FSFC的灵敏度、选择性和稳定性

由于碲原子对萘二甲酰亚胺荧光团的重原子作用，在没有Fe²⁺的情况下，FSFC是非荧光的，Fe²⁺可以触发FSFC的脱氢反应并引起强烈的荧光，研究表明不同浓度Fe⁺对FSFC荧光强度具有影响，并且荧光强度与Fe²⁺浓度呈现线性关系，因此，对于大多数环境和实验样品，FSFC可以作为Fe²⁺或铁还原菌的指示剂。接下来作者验证FSFC的选择性，实际环境中其他金属离子可能会影响FSFC对Fe²⁺的荧光影响，通过实验表明所有被测金属分别对FSFC没有显著的影响效应。并且稳定性测试实验表明FSFC在5h内保持较好的稳定性，优于经典的邻菲罗啉法。

Fig.1 FSFC对Fe²⁺溶液中的灵敏度、选择性和稳定性。(A) FSFC荧光光谱对不同浓度Fe²⁺的响应。(B) Fe²⁺浓度与荧光强度FI的关系为对数关系。(C) FSFC对Fe²⁺的选择性测试。(D) FSFC与传统邻菲罗啉法的相对稳定性。

2. 活性FeRM还原可溶性和固态Fe3+的荧光成像。

前人的研究已经广泛证实了Shewanella和Geobacter的还铁能力。此外，有报道称，在用FeRM法还原铁的过程中，磷酸亚铁和碳酸亚铁在细胞表面聚集。实验结果表明与非铁还原菌相比S12和MR-1细菌表面的Fe2+浓度高很多。使用S. decolorationis S12、S. oneidensis MR-1、G. sulfurreducens PCA三种模式铁还原菌进行可溶性柠檬酸铁还原时发现细胞荧光强度与二价铁浓度呈良好的线性关系（图2 A-E, G）。

Fe在自然界中主要以固体的形式存在，本研究发现上述模式菌在还原无定形水铁矿的过程中的Fe²⁺浓度也与荧光强度呈一致性变化趋势。值得关注的是，在用于Geobacter无定形铁还原测试时，仅有接触铁颗粒的细胞呈现荧光，而未接触铁颗粒的细胞几乎无荧光（图2F），与该菌依赖直接接触的铁还原方式一致，表明FSFC具有判断细菌细胞是否正在进行铁还原的能力。

Fig.2 FSFC在氧、可溶性Fe³⁺或固态Fe³⁺为电子受体的情况下对菌株PCA的荧光响应。

3. 评价不同细菌的铁还原能力。

除铁还原能力外，不同属细菌通常具有不同的形状、表面性质和代谢物，这些都可能影响FSFC的荧光。为了进一步分析FSFC的选择性，我们使用FSFC对5个盲菌标本进行了检测。从沉积物中分离出五种还原铁性能未知的细菌。

实验表明，与预期的结果一样， S12和 MR-1显示荧光，阴性对照无荧光。在5个盲样细菌中，只有P. motobuensis Iβ12有荧光，但FI低于S12。其余细菌均无荧光(图4A-G)，所以不同细菌的贴还原能力差异较大，且FSFC探针对不同菌的评价结果与经典邻菲罗啉法一致。

 Fig.4：FSFC对含有柠檬酸铁的不同细菌培养物的荧光图像。 (A) Ciceribacter sp. F217, (B) S. hydrophobicum C1, (C) Bacillus Iβ8, (D) L. varians GY32, (E) P. motobuensis Iβ12, (F) S. decolorationis S12, (G)基于邻菲罗啉法的不同菌株的铁还原测定。

4. FeRM与其他细菌共培养

FeRM和与其他功能的细菌共培养是了解FeRM与其他细菌之间相互作用的重要方法。

为了测试FSFC是否可以在共培养系统中鉴定出FeRM，作者使用乳酸作为电子供体共培养了丝状非FeRM 菌株GY32和杆状菌株S12。如图5A所示，杆状菌株S12显示出强荧光，而丝状细菌GY32在相同的铁还原培养物中没有荧光。可以看出，FSFC可以选择性地选择微生物样品中的FeRM。为了评价FSFC在更复杂环境下的可行性，用FSFC在含柠檬酸铁的灭菌底泥中共培养GY32和S12。图5C显示在没有共培养的沉积物中，只有少数颗粒显示荧光，这可能是由于这些沉积物颗粒上固有的Fe ²⁺引起的，而没有细菌样颗粒显示出荧光。 结果表明，FSFC在沉积物中的背景荧光很小，沉积物中非活性微生物不能触发FSFC的荧光。 在共培养系统中，如图5D显示，S12表现出显著的荧光，而丝状细菌GY32没有荧光，表明FSFC在含沉积物的环境中可视化FeRM的可行性。

Fig.5 S12和GY32共培养的荧光图像

5.可视化并从混合物中分离单细胞FeRM

除了可视化FeRM外，从多物种样品中分离FeRM对于了解铁相关的生物地球化学过程是一个普遍而重要的需要。作者结合FSFC和PI来标记富铁还原反应中的生物膜。CLSM显示，活跃的FeRM细胞主要位于生物膜的外层，而内层生物膜细胞活性较低，FSFC荧光较少，如图6A. 7个有荧光的单细胞和6个没有荧光的单细胞通过单细胞分选仪从沉积物富集的菌群中分离出来(图6)。其中有3个分离的荧光单细胞被成功培养，它们都可以使用醋酸盐作为电子供体来还原柠檬酸铁(图6G)，进一步证实了FSFC在FeRM分选中的可靠性。

Fig.6 基于FSFC可视化单细胞分选铁还原菌。

四、结论

这项研究报告了一种方法，该方法可以将FeRM可视化并从含有多物种甚至沉积物的细菌培养物中分离出来。FSFC对Fe²⁺具有很高的灵敏度，选择性和稳定性，并且在液体和沉积物环境中均具有低背景荧光。 在含有FeRM的纯培养物或共培养物中，FSFC可以选择性地观察活性FeRM。通过与单细胞分选技术相集成，可以从单细胞水平的样品中有效地获得目标FeRM。 这种新颖的方法可能是获得新的FeRM以及深入了解FeRM在不同环境中的生物地球化学作用的有力工具。

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